Summary
I filtri di lana di vetro sono stati utilizzati per concentrare i virus acquosa da un certo numero di gruppi di ricerca in tutto il mondo. Qui mostriamo un metodo semplice per la costruzione di filtri di lana di vetro e di dimostrare i filtri sono anche efficaci in concentrazione acquosa virali e patogeni batterici e protozoi.
Abstract
Il primo passo fondamentale per la valutazione dei livelli di agenti patogeni in sospetto di acqua contaminata è la concentrazione. Metodi di concentrazione tendono a essere specifica per un gruppo particolare agente patogeno, per esempio gli Stati Uniti Metodo Environmental Protection Agency 1623 per Giardia e Cryptosporidium 1, il che significa che più metodi sono necessari se il programma di campionamento di mira più di un gruppo patogeno. Un altro svantaggio dei metodi attuali è l'apparecchiatura può essere complicato e costoso, per esempio il metodo VIRADEL con cartuccia filtrante per concentrare il virus 1MDS 2. In questo articolo abbiamo descritto come creare filtri in lana di vetro per concentrare gli agenti patogeni a base acquosa. Dopo eluizione filtro, il concentrato è suscettibile ad una fase di seconda concentrazione, come centrifugazione, seguita da patogeno rilevamento e conteggio con metodi culturali o molecolari. I filtri sono diversi vantaggi. La costruzione è semplice ed i filtri possono essere costruiti ad unadimensioni ny per soddisfare le esigenze specifiche di campionamento. Le parti del filtro sono poco costosi, che permettono di raccogliere un gran numero di campioni senza incidere negativamente un bilancio del progetto. Grandi volumi di campione (100s a 1.000 s L) può essere concentrata a seconda del tasso di intasamento di torbidità. I filtri sono facilmente trasportabili e con attrezzatura minima, come una pompa e misuratore di portata, possono essere attuate in campo per il campionamento dell'acqua finito di bere, acque superficiali, sotterranee e scarichi agricoli. Infine, filtrazione lana di vetro è efficace per concentrare una varietà di tipi di patogeni così solo metodo è necessario. Qui riportiamo l'efficacia del filtro di concentrazione acquosa enterovirus umani, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, e il virus dell'influenza aviaria.
Protocol
1. Preparare la lana di vetro
- Prima e dopo aver fatto ogni partita di filtri, sterilizzare l'area di lavoro con una soluzione di candeggina al 10%.
- Indossare guanti e camice. Sterilizzare un secchio in autoclave a 121 ° C e 15 psi per almeno 20 minuti. Posizionare la lana di vetro nel secchio sterile.
- Saturare la lana di vetro con acqua ad osmosi inversa e lasciare macerare per 15 minuti.
- Scolare l'acqua ad osmosi inversa dal secchio.
- Saturare la lana di vetro con 1 M HCl e lasciate macerare per 15 minuti.
- Scolare la M 1 HCl dal secchio.
- Lavare la lana di vetro con acqua ad osmosi inversa.
- Mescolare accuratamente.
- Controllare il pH utilizzando carta pH e ripetere l'acqua osmosi inversa risciacquo fino a pH neutro si ottiene.
- Versare l'acqua di risciacquo.
- Saturare la lana di vetro con 1 M NaOH e si lascia macerare per 15 minuti.
- Scolare la M 1 NaOH dal secchio.
- Ripetere l'osmosi inversa risciacquo fino a pH neutro si ottiene.
- Versare l'acqua di risciacquo.
- Invece di un secchio, una rondella lana di vetro può essere costruito, che è simile nel disegno ad una rondella pipetta di vetro (Figura 1).
- Coprire la lana di vetro completamente con fosfato sterile Buffered Saline (PBS) a pH 6,8.
- Utilizzare la lana di vetro preparata immediatamente o conservare a 4 ° C. Può essere conservato per un massimo di due settimane. Prima dell'uso, assicurarsi che il pH è neutro in quanto aumenterà nel tempo. Se il pH non è neutro, ri-sciacquare con fosfato sterile salina tamponata (pH 6,8).
2. Il montaggio del filtro in lana di vetro
- Praticare un foro 11/16 di pollice nei tappi in PVC e fili di rubinetto in modo che i maschi raccordi in nylon adattatori possono essere avvitati i tappi. Questo passaggio è necessario solo per la prima assemblea. Successivamente, i tappi possono essere usati per anni. Applicare Teflonnastro per i fili di nylon e raccordi a vite per i tappi.
- Riporre il tubo in PVC con piccoli pezzi di lana di vetro. Utilizzare uno stantuffo metallico, come una valvola motore di un'auto, per il confezionamento stretto. Imballaggio non richiede grande forza. Confezione abbastanza stretto in modo che la lana di vetro rimane al suo posto e canali non si formano. Tuttavia, non viene imballato in modo così stretto acqua non può passare attraverso il filtro. Quando imballato opportunamente, una portata di 4 a 5 litri al minuto deve essere raggiungibile quando il filtro è fissato a rubinetti con pressioni comprese tra 40-60 psi. Per le dimensioni di tubo in PVC di cui al presente protocollo, circa 85 grammi lavato e lana di vetro imballato è usato per pipe. Tare il tubo vuoto PVC su un top-loading equilibrio e pacco con lana di vetro lavata fino a quando la massa del tubo aumenta 85 grammi.
- Inserire la rete in polipropilene nei tappi in PVC con raccordi maschio in nylon adattatore collegato.
- Applicare il nastro di teflon alle parti filettate del tubo in PVC.
- Avvitare tappi in PVC alla p PVCipe e etichetta un'estremità filtro l'afflusso e l'altra estremità del deflusso. Questo è importante per la successiva fase di eluizione. Che fine viene etichettato afflusso non importa.
- Spingere 60 mL di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (pH = 6.8) nel filtro utilizzando un catetere punta siringa. Eccesso uscirà all'estremità opposta.
- Wrap termina strettamente con Parafilm per evitare perdite. I filtri possono essere memorizzati fino a 30 giorni a 4 ° C.
3. Campionamento
- Sterilizzare tubi utilizzati per il campionamento da parte di ricircolo o immergendo gli elementi per 30 minuti in NaClO 0,525% (cioè, una soluzione al 10% di candeggina standard). Segui questa drenando la soluzione di ipoclorito e neutralizzare con tiosolfato di sodio 0,05%, ottenuto aggiungendo 25 mL di una soluzione al 2% di sodio tiosolfato anidro stock di un litro d'acqua ad osmosi inversa.
- Per esempio l'acqua con un pH maggiore di 7,5, regolare il pH a tra 6,5 e 7,0 con HCl. HCl concentrazione può variare da 0,25M a 1 M. quattro litri 0,5 M HCl è generalmente sufficiente per due campioni di 800 litri, a seconda del pH ambientale dell'acqua e la capacità di buffering. Iniettare HCl durante il campionamento utilizzando una pompa peristaltica o Venturi (Figura 2). Regolare la velocità della pompa o l'apertura Venturi per raggiungere l'obiettivo di pH. Misurare il pH all'uscita linea del campione usando un pH-metro campo.
- Utilizzare un prefiltro se gli zoccoli in lana di vetro filtro da acqua con elevata torbidità. (Specifiche per il prefiltro e la sua sede sono in linea nell'elenco Materiali.) Poiché patogeni può essere collegato a particelle intrappolate dal prefiltro deve essere eluito con il filtro di lana di vetro (vedi sotto).
- Regolare il flusso tra 2 e 4 litri al minuto. Volumi di campione tipici sono tra 200 e 1.500 litri.
- Scollegare il filtro di lana di vetro e riporlo in un sacchetto di plastica sterile a 4 ° C per un massimo di 48 ore.
4. Eluizione
- Applicare il filtro di lana di vetro ad un anellostand con l'estremità rivolta verso il basso afflusso di campione in una bottiglia di polipropilene. Eluire opposta alla direzione del flusso del campione.
- Premere 80 ml di estratto di carne sterile 3% in 0,05 M glicina con un pH di 9,5 nel filtro.
- Attendere 15 minuti.
- Premere un'altra 80 mL di sterile estratto di carne 3% in 0,05 M glicina con un pH di 9,5 nel filtro.
- Spingere il filtro d'aria che fino a schiuma fuoriesce dal filtro in ingresso.
- Regolare il pH dell'eluato a tra 7,0 e 7,5 con 1 M HCl.
- Eluato Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore oa -20 ° C per lunghi periodi di tempo.
- Eluire il prefiltro se viene utilizzato. Svitare la parte superiore della cartuccia fuori sede e versare tutta l'acqua residua all'interno del corpo mentre si tiene il prefiltro in posizione con le mani protette da guanti sterili.
- Togliere il prefiltro dalla cartuccia dell'alloggiamento e farla scorrere in un 15 "x 6" zip-lock bag.
- Versare 200 ml di estratto di carne sterile 3% in M 0,05 glycine con un pH di 9,5 nel sacco e sigillare saldamente con la zip-lock.
- Invertire il prefiltro insaccato diverse volte per garantire l'intera superficie viene a contatto con l'estratto di carne.
- Attendere 15 minuti, a volte invertendo e massaggiando il prefiltro insaccato.
- Aprire lo zip-lock. Afferrare il sacchetto attorno al prefiltro strettamente a spremere come estratto di carne il più possibile e tirare la prefiltro con guanti sterili,.
- Versare l'eluato estratto di carne in una bottiglia di polipropilene.
- Regolare il pH dell'eluato a tra 7,0 e 7,5 con HCl 1M.
- Eluato Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore oa -20 ° C per lunghi periodi di tempo. L'eluato prefiltro può essere analizzato separatamente per i patogeni o in combinazione con l'eluato filtro lana di vetro.
5. Risultati rappresentativi
| Patogeni | Water Level torbidità (NTU) a | Importo Seeded / L b, c, d | Recupero% ± 1 SD | Trials Numero indipendenti |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 5000 | 67 ± 12% | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 500 | 56 ± 18% | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 5 | 38 ± 14% | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 50 | 53 ± 19% | 8 |
| Piangereptosporidium parvum | 215 | 5 | 40 ± 16% | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33 ± 13% | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 500 | 56 ± 16% | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 | |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34 ± 18% | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Unità di torbidità nefelometrico
- Enterovirus enumerate da qPCR come copie genomiche / L
- C. parvum enumerati mediante immunofluorescenza di oocisti
- S. enterica enumerati dalla cultura come formanti colonie-unità
Tabella 1. Concentrazione di lana di vetro con la torbidità dell'acqua e densità diversi agenti patogeni.
| Patogeni | Campione d'acqua Location | Importo Seeded / L a | Reco% molto |
| Influenza aviaria H5N2 | Sundi Lake, Anchorage Borough | 2500 | 42,9% |
| Influenza aviaria H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Influenza aviaria H5N2 | Portage Valley, Anchorage Borough | 2500 | 7,8% |
| Influenza aviaria H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | 41,5% |
| Influenza aviaria H5N2 | Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough | 2500 | 15,5% |
- Misurato da qPCR come copie genomiche / L
Tabella 2. Concentrazione in lana di vetro del virus dell'influenza aviaria utilizzando l'acqua da cinque siti in Alaska.
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Figura 1. Schema di rosetta lana di vetro. Questo può essere usato al posto di un secchio, risparmiando tempo di risciacquo. Il concetto è simile ad una rondella pipetta di vetro.
Figura 2. Lana di vetro di filtrazione con iniezione di acido da pompa peristaltica. Nota: il connettore "T", dove il tubo della pompa acida introduce nella linea di campione tra il rubinetto dell'acqua e la lana di vetro filtro. regolazione del pH è necessaria solo se l'acqua ha un pH campionata> 7,5.
I filtri di lana di vetro sono efficaci agenti patogeni in concentrazione da acqua con una vasta gamma di livelli di torbidità e densità patogeni (Tabella 1). Per verificare ciò, 20 litri di acqua di rubinetto senza cloro è stato mescolato con il terreno limo argilla secca (0, 1,27 o 2,75 g / L) per raggiungere il livello desiderato di torbidità e poi seminati con agenti patogeni a varie densità. L'acquaè stato passato attraverso un filtro lana di vetro, i patogeni concentrati nell'eluato erano enumerate, e questo valore era il numeratore nel calcolo percentuale di recupero. La quantità di agenti patogeni seminati in acqua, che è, il denominatore del calcolo recupero percentuale, è stato determinato prima semina dei patogeni in un eluato negativo di elencare i patogeni. L'eluato negativo è stato preparato facendo passare una seminata campione di 20 litro attraverso un filtro e eluendo. Quantificare gli agenti patogeni seminate in un eluato negativo evita differenze di enumerazione degli agenti patogeni che potrebbero derivare da differenze matrice creata dal filtro di lana di vetro. L'importanza di questo passo, nel quantificare i patogeni di qPCR è discusso in Lambertini et al. 3. Un campione di 20 litro controllo negativo è stata concentrata mediante filtrazione in lana di vetro per determinare non ci fossero native presenti agenti patogeni che potrebbero confondere il calcolo percentuale di recupero. A 10 um dimensione nominale dei pori prefiltro wcome quando il livello torbidità era ≥ 215 NTU.
Poliovirus è stato quantificato in tempo reale utilizzando la concentrazione qPCR secondario e procedure di estrazione di acidi nucleici e inneschi e le sonde descritte in Lambertini et al. 3. Cryptosporidium parvum è stato quantificato nel volume finale del campione concentrato (FCSV) creato dalla concentrazione procedura secondaria di poliovirus . Oocisti sono state visualizzate mediante immunofluorescenza (MeriFluor Cryptosporidium e Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella enterica è stato quantificato in FCSV da piastrato su agar XLD (Remel, Lenexa, KS) e conteggio delle colonie di formazione- unità.
I filtri di lana di vetro sono efficaci a concentrare virus dell'influenza aviaria (Tabella 2). Virus a bassa patogenicità dell'influenza aviaria (H5N2) è stato seminato in acqua da diverse località in Alaska e la percentuale di recupero calcolato come descritto Above. Concentrazione secondario e procedure di acidi nucleici sono stati eseguiti come per poliovirus, il virus è stato quantificato qPCR utilizzando i primer e sonde descritte in Spackman et al 4.
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Discussion
I filtri di lana di vetro sono stati utilizzati da vari gruppi di ricerca a concentrarsi 3,5,6 virus enterici umani da una varietà di fonti d'acqua, come acqua potabile finito 7, 8,9 acque sotterranee, acque di superficie 10, 11 di acqua di mare, acque reflue 12, e scarichi agricoli 13. Qui riportiamo i filtri sono efficaci anche a concentrare il virus dell'influenza aviaria così come i patogeni batterici e protozoi Salmonella enterica (sierotipo Typhimurium) e Cryptosporidium parvum, rispettivamente. Deboosere et al. Anche recentemente riportato la concentrazione di lana di vetro del virus dell'influenza aviaria 14.
I filtri sono vantaggiosi in quanto essi sono poco costosi, altamente portatile, utilizzabile in una vasta gamma di matrici acqua, ed efficace per concentrare molti tipi di agenti patogeni acquosa. Essi possono essere costruiti a qualsiasi dimensione, a seconda delle esigenze di ricerca. Dopo disinfettareion, scatole del filtro sono riutilizzabili.
Filtri di lana di vetro, comunque, non abbiamo limiti. Come con qualsiasi metodo concentrazione di virus che si basa su supporti electropositively praticati per l'adsorbimento del virus (ad esempio, 1MDS filtro, CUNO Inc., Meriden, CT), filtro efficacia dipende dal pH dell'acqua ambiente. Nel nostro laboratorio abbiamo selezionato pH 7,5 come il cut-off, sopra il quale il pH viene regolato verso il basso in continuo pompaggio 0,25 M HCl in linea di ingresso del filtro durante il campionamento. Acque pH superiore può essere campionato senza regolazione del pH, ma a costo di efficacia filtro 3. Un'altra limitazione è shelf-life. Abbiamo dimostrato per i filtri conservati a 4 ° C per sei settimane che l'efficacia di concentrazione patogeno non si riduca (dati non pubblicati). Tuttavia, i tempi di conservazione più lunghi, non sono stati testati in modo, prudenzialmente, per garantire la qualità dei dati, non utilizzare i filtri di età superiore a 30 giorni. Solitamente, i filtri sono effettuate secondo necessità. Un altro posto di blocco potenziale in alcuni Countries è ottenere la lana di vetro dalla sorgente francese specificato in lavori precedenti. Recentemente, abbiamo dimostrato livello di isolamento in fibra di vetro a vista è ugualmente efficace, e questo è facilmente reperibile nei negozi di ferramenta di miglioramento o di casa (si veda l'elenco dei materiali online).
Per tutti gli esperimenti, è importante eseguire due serie di controlli in bianco, un apparecchio per garantire filtri di lana di vetro non sono stati contaminati durante la costruzione e il recupero di un controllo per garantire che i filtri funzionare come previsto. Questi controlli sono necessari per qualsiasi metodo a base acquosa di concentrazione degli agenti patogeni.
Utilizzando un filtro di lana di vetro può essere semplice come collegare ad un rubinetto e girando il rubinetto o complicato come il campionamento di un carico di sedimenti del fiume in un luogo remoto, richiedono pompe, regolazione del pH e un pre-filtro per evitare l'intasamento. Per il nostro gruppo di ricerca, il più grande vantaggio di utilizzare filtri di lana di vetro è la capacità di raccogliere e analizzare migliaia di campione d'acquas per patogeni umani e animali, producendo i dati sulla consistenza e la distribuzione degli agenti patogeni nell'ambiente che non sarebbe stata possibile in quanto con più costosi, complicati metodi di 13,15.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo William T. Eckert per raccontare il video. Sviluppo del protocollo di lana di vetro faceva parte del Water Wisconsin e Trial Salute per rischi enterica (WAHTER Study), finanziato dalla US EPA STAR di Grant R831630. Alaska campioni sono stati raccolti da A. Reeves, A. Ramey, e B. Meixell con il sostegno finanziario USGS. Qualsiasi uso di nomi commerciali, prodotto o azienda è per scopi descrittivi soltanto e non implica riconoscimento alcuno da parte del governo degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
