Summary
グラスウールフィルタは、世界中の研究グループの数によって水系ウイルスを濃縮するために使用されている。ここでは、グラスウールフィルタを構築するための単純なアプローチを示し、フィルタはまた、水性、ウイルス、細菌や原生動物病原体を濃縮するのに有効であるを示しています。
Abstract
疑われる汚染水の病原体のレベルを評価する上で重要な最初のステップは濃度である。濃縮方法としては、例えば、サンプリングプログラムは、複数の病原体のグループを対象としている場合は、複数の方法が必要であることを意味しジアルジアやクリプトスポリジウム 1、米国環境保護庁方式1623特定の病原体のグループの特定の傾向にあります。現在の方法のもう一つの欠点は、装置であるウイルス2を濃縮1MDSカートリッジフィルタ付きVIRADEL方法は、例えば、複雑で高価になることができます。この記事では、水中の病原体を濃縮するためのガラスウールフィルターを構築する方法について説明します。フィルター溶出した後、濃縮物は、文化的または分子的手法による病原体の検出と列挙に続いて遠心分離等の第2の濃度ステップ、に適している。フィルタはいくつかの利点があります。建設が容易であり、フィルタは次のように構築することができます特定のサンプリング要件を満たすためにニューヨークサイズ。フィルタ部品はそれが可能な深刻なプロジェクトの予算に影響を与えることなく、多数のサンプルを収集しながら、安価である。大量の試料（100〜1000 L）はサンプルの濁度から詰まりの速度に応じて濃縮することができる。フィルタは、非常にポータブルであり、このようなポンプ及び流量計として、最小限の機器で、それらが完成した飲料水、地表水、地下水、農業排水をサンプリングするためのフィールドで実装することができます。最後に、ガラスウールのろ過は、1つの方法が必要となるように、病原体のさまざまな種類の濃縮効果があります。ここでは、水系、人間のエンテロウイルス、S almonellaサルモネラ、クリプトスポリジウム 、鳥インフルエンザウイルスを濃縮することでフィルタの効果について報告する。
Protocol
1。ガラスウールの準備
- フィルタの各バッチの前と行った後、10％漂白剤溶液を用いて作業領域を滅菌する。
- 手袋とガウンを着用します。少なくとも20分間121°C、15 psiでオートクレーブでバケットを殺菌。滅菌したバケットにグラスウールを配置します。
- 逆浸透水のガラスウールを飽和させ、15分間浸漬しましょう。
- バケツからの逆浸透水を排出します。
- 1 M HClでグラスウールを飽和させ、15分間浸漬しましょう。
- バケットから1 M HClを排出します。
- 逆浸透水のガラスウールを洗浄します。
- 混和します。
- pH試験紙を用いてpHをチェックし、中性のpHが達成されるまでリンス逆浸透水を繰り返します。
- すすぎ水を注ぐ。
- 1 M NaOHでグラスウールを飽和させ、15分間浸漬しましょう。
- バケットから1 M NaOHを排出します。
- R中性pHが達成されるまで逆浸透リンスEPEAT。
- すすぎ水を注ぐ。
- バケットの代わりに、ガラスウールの洗濯機は、設計のガラスピペットワッシャー（図1）に類似している、構築することができます。
- pHを6.8に調整した緩衝生理食塩水（PBS）、滅菌リン酸で完全にグラスウールをカバーしています。
- すぐに準備されたガラスウールを使用して、または4℃で保存それは、最大2週間まで保存できます。使用する前に、それは時間の経過とともに上昇するようpHが中性であることを確認してください。 pHが中性でない場合は、滅菌リン酸を使用して再リンス液（pH 6.8）緩衝生理食塩水。
2。ガラスウールフィルタを組み立てる
- PVCキャップに11月16日インチの穴を開けると男性アダプタナイロン継手は、キャップにねじ込むことができるようにスレッドをタップします。このステップは、最初のアセンブリが必要である。その後、キャップは、長年使用することができます。テフロンを適用します。ナイロン継手スレッドとキャップのネジにテープで固定します。
- グラスウールの小片と塩ビ管を詰める。タイトなパックに、車のエンジンバルブのように、金属製のプランジャーを使用しています。パッキンが大きな力を必要としません。タイトな十分なグラスウールが所定の位置に留まるように梱包し、チャネルが形成されません。ただし、これをしっかりと水がフィルターを通って流れることができないパックはありません。フィルタは40から60のpsiの圧力で水栓に接続されているときに適切に梱包する場合は、分あたり4〜5リットルの流量は達成可能でなければなりません。このプロトコルで指定された塩ビ管のサイズは、約85グラムを洗浄し、充填したガラスウールは、パイプごとに使用されています。風袋洗浄したガラスウール入りトップローディングバランスとパックの空の塩ビ管パイプの質量は85グラムを増加させるまで。
- 接続されているオスアダプタナイロン継手PVCキャップにポリプロピレンメッシュを挿入します。
- 塩ビ管のねじ部分にテフロンテープを適用します。
- PVC pにPVCキャップのネジイペとラベルつのフィルタ端の流入と、もう一方の端流出。これは、溶出ステップの後に重要である。どちらの端には流入は関係ありませんというラベルが付いています。
- 注射器をひっくり返したカテーテルを使用してフィルタに液（pH = 6.8）緩衝生理食塩水、滅菌リン酸60mLのを押してください。過剰反対側の端を出てきます。
- ラップは、漏れを避けるためにパラフィルムでしっかりと終了します。フィルタは、4℃で30日間まで保存することができます
3。サンプリング
- 0.525パーセントのNaClO（すなわち、標準的な家庭用漂白剤の10％溶液）で30分間の項目を循環または浸漬することにより、サンプリングに使用されるチューブを滅菌する。次亜塩素酸塩溶液を排出することによって、これをフォローし、逆浸透水の1リットル〜2％の株式無水チオ硫酸ナトリウム溶液25mlを加えることによって行われた0.05％チオ硫酸ナトリウムとの中和。
- 7.5より大きいpHの試料水については、HClで6.5〜7.0にpHを調整します。塩酸濃度は0.25の範囲で指定できます1 M 4リットルにM 0.5 M HClは水の周囲のpHと緩衝能力に応じて、一般的に2つの800リットルのサンプルで十分です。蠕動ポンプまたはベンチュリ（図2）を使用して、サンプリング中に塩酸を注入します。ポンプの速度またはターゲットのpHを達成するためにベンチュリー開度を調整します。フィールドのpHメータを使用してサンプルラインの出口でのpHを測定します。
- グラスウールフィルター目詰まりであれば、高濁度水からプレフィルターを使用しています。 （プレフィルターとその住宅の仕様は、材料のリストをオンラインにあります。）病原体は、それがガラスウールフィルタ（下記参照）と一緒に溶出されている必要がありプレによって捕捉粒子に付着することができるので。
- 2〜4リットル/分の流量を調整します。典型的なサンプル量は200〜1500リットルです。
- 最大48時間まで4℃でプラスチックの滅菌袋のガラスウールフィルターとストアを外します。
4。溶出
- リングに貼りグラスウールフィルターポリプロピレンボトルに下向きのサンプル流入端に立っている。サンプルフローの方向の反対を溶出させる。
- フィルタに9.5のpHは0.05 Mグリシンの滅菌3％牛肉エキス80 mLを押してください。
- 15分間待ちます。
- フィルタに9.5のpHは0.05 Mグリシンの滅菌3％牛肉エキスの別の80 mLを押してください。
- 泡は、フィルタ入口から出てくるまで、徹底したエアフィルターを押してください。
- 1 M HClで7.0〜7.5に溶出液のpHを調整します。
- ストア4で溶出°Cより長い期間の最大24時間のために、または-20°Cで。
- 1が使用されている場合、プレフィルターを溶出させる。を外し、ハウジングカートリッジの上部と滅菌手袋をはめた手で固定プレを保持しながら住宅内のすべての残留水を捨てる。
- 住宅カートリッジからプレフィルターを取り外し、15 "x 6"のジップロック袋にそれをスリップ。
- 0.05 M gに滅菌3％牛肉抽出物200mLを注ぐジップロックの袋にしっかりとシールに9.5のpHを有するリシン。
- 表面全体が牛肉エキスに接触して確保するために袋詰めプレを数回反転します。
- 時折反転および袋プレフィルターをマッサージし、15分間待ちます。
- ジップロックを開きます。プレフィルターの周りグリップバッグはしっかりと、できるだけ多くの牛肉エキスと絞り出すと、滅菌手袋をはめた手でプレフィルターを引き出します。
- ポリプロピレン瓶に牛肉エキスの溶出液を注ぎます。
- 1M HClで7.0〜7.5に溶出液のpHを調整します。
- ストア4で溶出°Cより長い期間の最大24時間のために、または-20°Cで。プレ溶出液を別々に病原体のために分析やガラスウールフィルター溶出液と組み合わせることができます。
5。代表的な結果
| 病原体 | 水の濁度レベル（NTU） | 量シード/ L、B、C、D | ％回収率±1 SD | 数の独立した試験 |
| エンテロウイルス、ポリオセービンIII | 0.5 | 500 | 81パーセント±11 | 7 |
| エンテロウイルスポリオセービンIII | 0.5 | 5000 | 67パーセント±12 | 8 |
| エンテロウイルス、ポリオセービンIII | 215 | 500 | 59パーセント±32 | 7 |
| エンテロウイルス、ポリオセービンIII | 215 | 5000 | 38パーセント±22 | 6 |
| エンテロウイルス、ポリオセービンIII | 447 | 500 | 56パーセント±18 | 8 |
| エンテロウイルス、ポリオセービンIII | 447 | 5000 | 63パーセント±37 | 8 |
| クリプトスポリジウム | 0.5 | 5 | 38パーセント±14 | 7 |
| クリプトスポリジウム | 0.5 | 50 | 53パーセント±19 | 8 |
| 泣くptosporidiumクリ | 215 | 5 | 40パーセント±16 | 7 |
| クリプトスポリジウム | 215 | 50 | 30パーセント±6 | 6 |
| クリプトスポリジウム | 447 | 5 | 33パーセント±13 | 8 |
| クリプトスポリジウム | 447 | 50 | 28パーセント±11 | 8 |
| サルモネラ菌 | 0.5 | 5 | 29パーセント±24 | 7 |
| サルモネラ菌 | 0.5 | 500 | 56パーセント±16 | 8 |
| サルモネラ菌 | 215 | 5 | 32パーセント±24 | 7 |
| サルモネラ菌 215 | 500 | 34パーセント±11 | 6 | |
| サルモネラ菌 | 447 | 5 | 34パーセント±18 | 8 |
| サルモネラ菌 | 447 | 500 | 31パーセント±24 | 8 |
- ネフェロメ濁度単位
- ゲノムコピー/ Lとして、定量PCRによって列挙されたエンテロウイルス
- C.parvumのは、オーシストと免疫蛍光法により列挙
- S. entericaのは、コロニー形成ユニットとして、文化によって列挙
様々な水の濁度と病原体密度の表1のガラスウールの濃度。
| 病原体 | 水のサンプルの場所 | 量シード/ L | ％レコ非常に |
| 鳥インフルエンザH5N2 | Sundi湖、アンカレッジ自治区 | 2500 | 42.9パーセント |
| 鳥インフルエンザH5N2 | ミントフラッツ、フェアバンクスノーススターボロー | 2500 | 36.7パーセント |
| 鳥インフルエンザH5N2 | Portageの谷、アンカレッジ自治区 | 2500 | 7.8パーセント |
| 鳥インフルエンザH5N2 | ポッターマーシュ、アンカレッジ自治区 | 2500 | 41.5パーセント |
| 鳥インフルエンザH5N2 | 柳湖、ユーコン-コユークク川自治区 | 2500 | 15.5パーセント |
- ゲノムコピー/ Lとして、定量PCRによって測定し
アラスカ州の5つのサイトからの水を使って鳥インフルエンザウイルスの表2のガラスウールの濃度。
les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpgの "alt ="図1 "/>
図1ガラスウールワッシャーの図。これはすすぎから時間を節約し、バケットの代わりに使用できます。コンセプトは、ガラスピペットワッシャーに似ています。
蠕動ポンプにより、酸注入と図2のガラスウールろ過。ポンプチューブは、水の蛇口、ガラスウールフィルタの間にサンプルラインに酸を導入する "T"コネクタに注意してください。 pH調整は、サンプリングされた水は、pH> 7.5を持っている場合にのみ必要です。
グラスウールフィルタは、濁度レベルと病原体の密度（表1）の広い範囲で水から病原体を濃縮するのに有効である。これをテストするには、脱塩素水道水20リットルは、濁度の望ましいレベルを達成するために乾燥したシルト壌土（0、1.27、または2.75グラム/ L）と混合し、その後、様々な密度で病原体を播種した。水グラスウールフィルターに通した、溶出液中の濃縮された病原体は、列挙され、この値は、回収率の計算で分母であった。 、回収率計算の分母である水に病原体を播種量は、最初の病原体を列挙し、負の溶出液に病原体を播種することにより決定した。負の溶出液は、フィルターを介してシーディング20リットルのサンプルを渡して溶出することにより調製した。負の溶出液中に播種し、病原体を定量化するグラスウールフィルタによって作成されたマトリックスの違いから生じる可能性が病原体列挙の違いを回避することができます。定量PCRによる病原体を定量化するこのステップの重要性はランバーらに説明されています。3。 20リットル陰性対照サンプルは、回収率の計算を混乱させることができるネイティブな病原体の存在がなかったかを判断するためにガラスウール濾過によって濃縮した。 10μmの公称孔径プレワット濁度レベルが≥215 NTUたときなどに使用。
ポリオウイルスは、ランバーらで説明しています。3セカンダリ濃度および核酸抽出手順と、プライマーおよびプローブを用いたリアルタイム定量PCRによって定量した。 クリプトスポリジウムは、ポリオウイルスの二次濃縮操作によって作成され、最終的な濃縮されたサンプル量（FCSV）で定量した。オーシストは免疫蛍光（MeriFluor クリプトスポリジウム及びジアルジアの検出キット、メリディアンライフサイエンス社、シンシナティ、オハイオ州）により可視化した。 サルモネラ菌は、XLD寒天上にメッキによりFCSVで定量した（Remel、オーバーランドパーク、カンザス州）と、コロニー形成カウントユニット。
グラスウールフィルタは、鳥インフルエンザウイルス（表2）に集中するのに有効である。低病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N2）は、アラスカ州のいくつかの場所から水に播種し、abovを説明したように回収率が計算されたE。二次濃縮および核酸の手順は、ポリオウイルスと同様に行われた。ウイルスは、スパックマンらに記載のプライマーとプローブを用いて、定量PCRにより定量した4。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
グラスウールフィルタは、そのような完成した飲料水7、地下8,9、地表水10、海の水11、排水12として水のさまざまなソースからの人間の腸管系ウイルスを濃縮するためにいくつかの研究チームが3,5,6で使用されており、農業排水13。ここでは、それぞれのフィルタはまた、鳥インフルエンザウイルスを濃縮することで効果的なだけでなく、細菌や原生動物病原体サルモネラ （血清型Typhimuriumの）とクリプトスポリジウムです報告します。 Deboosere らは最近、鳥インフルエンザウイルス14のグラスウールの濃度を報告した。
フィルタは、水行列の広い範囲で使用可能な、移植性の高い、安価な、そして水中の病原体の多くの種類を集中するのに有効であるという点で有利である。彼らは、研究のニーズに応じて、任意のサイズに構築することができます。駆除後のイオン、フィルターハウジングは再利用可能です。
グラスウールフィルタは、しかし、制限を持っている。ウイルス吸着（例えば、1MDSフィルタ、CUNO社、メリデン、CT）のelectropositively充電メディアに依存している任意のウイルス濃縮法と同様に、フィルタの効果は、周囲の水のpHに依存しています。我々の研究室では、水のpHを連続的にサンプリングの際に、フィルタの入力ラインに0.25 M HClをポンプで下方に調整されている上に、カットオフとして、pHが7.5を選択しました。高pH水はpH調整せずにサンプリングが、フィルタの効果3の費用ですることができます。別の制限は、貯蔵寿命です。我々は、4℃で保存されているフィルタに示されている病原体濃度の効果が（未発表データ）減少していないことを6週間°C。それにもかかわらず、より長い貯蔵時間は、データ品質を確保するために、控えめなので、テストされていない、我々は30日以上経過したフィルタを使用しないでください。通常、フィルタは必要に応じて作られています。いくつかのcountrie内の別の潜在的な障害sは以前の論文で指定されたフランスのソースからグラスウールを取得しています。最近、我々は標準unfacedグラスファイバー断熱材を実証同等に有効であり、これは（材料のリストはオンラインで参照してください）ハードウェアまたはホームセンター店から容易に入手可能です。
すべての実験のために、それはコントロールの2つのセット、グラスウールフィルタはフィルタが設計どおりに動作することを確認するための建設及び回復制御中に汚染されていないことを確認するための装置を空白にして実行することが重要です。これらのコントロールは、任意の水系病原体濃縮法に必要です。
グラスウールフィルタを使用すると、蛇口に取り付けると、タップをオンにするような単純なまたはポンプ、pH調整し、目詰まりを防ぐためにプレフィルターを必要とし、遠隔地に土砂を含んだ川のサンプリングのように複雑にすることができます。我々の研究グループでは、グラスウールフィルタを使用しての最大の利点は、水サンプルの数千を収集し、分析する機能です。13,15より高価、複雑な方法で実現可能とされていませんでした環境での病原体量と分布に関するデータを得、人間と家畜の病原体のS。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の競合は、宣言されません。
Acknowledgments
我々は、ビデオのナレーションのためにウィリアム·T·エッカートに感謝します。グラスウールプロトコルの開発は、米国環境保護庁（EPA）STARグラントR831630によって資金を供給腸リスク（WAHTER研究）のためのウィスコンシン州の水と衛生試験の一部であった。アラスカのサンプルは、USGSからの財政支援とA.リーブス、A.ラミー、AとB Meixellによって収集された。貿易、製品または会社名のいずれかを使用するだけの記述を目的としており、米国政府による是認を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
