Summary
尽管转型期文化无饲养层条件下的不断努力，人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的推导和文化仍然在很大程度上依赖于文化与的小鼠胚胎馈线（MEF中）。在这里，我们展示了一种新的方法，快速去除饲养者从人类胚胎干细胞培养实验前。
Abstract
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）被用来建立人胚胎干细胞（胚胎干细胞）培养后，囊胚隔离1。馈线系统维护人类胚胎干细胞进行自发分化过程中细胞的扩张。然而，这种合作培养法是劳动密集型的，需要训练有素的人员，和产量低的人类胚胎干细胞纯度4。许多实验室已尝试的数目最小化胚胎干细胞培养在饲养细胞（ 即将基质被覆菜肴或其他的饲养细胞类型5-8）。这些修改后的文化系统已经显示了一些希望，但还没有取代以减缓不必要的自发分化的人类胚胎干细胞培养与丝裂霉素C-处理的鼠标embyronic成纤维细胞培养的人类胚胎干细胞的标准方法。因此，饲养层细胞分化实验用于人类胚胎干细胞扩张的过程中被删除。虽然有几种技术可用于纯化的人类胚胎干细胞的共同从馈线lonies（FACS，MACS，或使用的药物产生抗药性向量），这些技术是劳动力密集型的，昂贵的和/或破坏性的人类胚胎干细胞。这个项目的目的是净化发明了一种方法，使一个的素净人口的人类胚胎干细胞的收获。我们观察到，在一个融合的人类胚胎干细胞培养，的MEF人口可以被删除，使用简单，快速的愿望的MEF表的。这种去除是依赖于几个因素，包括横向结合的细胞 - 细胞间的MEF，有一个较低的苯乙烯培养皿结合亲和力，和的能力的干细胞集落的成纤维细胞的生成期间的自己向外推“利基“。 SSEA-4，Oct3 / 4和茶1-81表达的人类胚胎干细胞，然后检查MEF切除后10天，以确保维持多能性。此外，人类胚胎干细胞菌落能够去除后，MEF将继续增长，到更大的排兵布阵，提供其他级别的人类胚胎干细胞扩张。
Protocol
1。制备小鼠胚胎喂料机的
- 胚胎干细胞的共培养物中所用的的MEF应预先通过照射或丝裂霉素C抑制细胞分裂处理。
- 前两个小时到MEF播种，大衣各60毫米的等离子体处理的培养皿中，用2毫升0.05％明胶。
- 解冻处理的MEF和板在约20000个细胞/ cm 2的小瓶。
- 使细胞粘附过夜。
2。共同播种到MEFs细胞的人类胚胎干细胞
- 新的殖民地，可以开始从冷冻保存文化或传代文化到新的MEF涂层的菜肴，如下图所示。
- 含有大的胚胎干细胞的菌落进行传代1次，用3毫升温热的1倍PBS洗板。
- 加入3毫升的胶原酶IV / PBS溶液（1毫克/毫升），并保温5-10分钟，在37℃下（注：这些细胞将不会成为不同的或球向上看到用胰蛋白酶）。
- 虽然细胞仍处于胶原酶，用5毫升的枪头的边缘，创建一个格子图案的殖民地，打破他们的小细胞团块。
- 使用的枪头（持以垂直方式的培养板）的端部刮将培养板的底部，从表面撞出的所有单元格。
- 成Falcon管和自旋（1000转）5分钟收集细胞。
- 离心后，吸出介质的Falcon管中，留下细胞沉淀。
- 吸出MEF MEF中镀前一天的介质。
- 重板的细胞从原板在1:3的比例，和饲料用3毫升的人类胚胎干细胞培养基中
3。消耗MEFs细胞共培养
注：人类ESC文化必须是在高密度，通常在10至14天的培养。
- 放置的板的边缘处的吸移液管的尖端，并允许吸入轻轻拉起MEF的片材的边缘。
- ŕemove媒体的菜，让尖赶上细胞片，慢慢地将尖端的圆弧板以上述方式。注：片材可能会堵塞中的移液管的前端，但是，这是没有问题的，因为它应该不能阻止用户从手动拉动片材从培养板的表面。如果细胞被卡住的吸气结束时，您可以使用上方的培养皿中，打破了电池板的完整的愿望。
- 立即取代人类胚胎干细胞介质，并把盘子放回孵化器。
4。代表性的成果
最终的结果的MEF去除过程中产生的小不受干扰的人类胚胎干细胞集落（ 图1D），同时保持多能性的制造商SSEA-4的表达，能经受重大扩展到非常大的菌落（ 图2），月¾，和茶1-81（ 图3）。
图1。 ESC之前和之后的MEF去除。在播种后到培养皿A）第1天，B）第2天的人类胚胎干细胞集落。C），高密度的菌落形态 人类胚胎干细胞集落（H7）MEFs细胞所包围。这两个胚胎干细胞集落概述红色虚线D）MEF使用抽吸技术去除后，我们只剩下很少MEF中的一个孤立的人类胚胎干细胞的殖民地，周围的完整的殖民地。
图2。 ESC MEF去除殖民地扩张后10天。原始的人类胚胎干细胞克隆后，立即MEF消耗（左）扩展到一个非常大的殖民地（右）适当ximately 800微米，10倍。请注意，在相同的放大倍数（10倍）作为复合菌落成像原始菌落。
图3。免疫组织化学染色的MEF-耗尽的人类胚胎干细胞集落。免疫荧光鉴定后10天MEF消耗的殖民地，殖民地保持其多能性标志物表达的明显十月¾，SSEA-4，TRA-1-81染色。此外，这些胚胎干细胞的殖民地并没有表现出分化的Flk-1的情况下向中胚层的命运，A，E，I，M）的透射光图像的immunoflouscently染色的殖民地，20日，10日，10日和2倍，分别B，F，J，和N）示出的核- DAPI染色的细胞的免疫荧光染色的菌落，20，10，10和2x，分别，CD）显示的表达人干细胞标记物仅SSEA-4，和合成图像，20倍。GH）示出的表达的人类干细胞标记物10月¾只，合成图像，10倍。KL）显示人干细胞标记物的表达，仅茶1-81和合成图像，10倍。MP）的最后一行，如果图像描绘了一个殖民地，塑造了典型的平滑看到这个放大倍数2倍，而这些殖民地的边界并没有明示O）FLK-1，中胚层分化的早期标志物，也没有他们P）包含任何的情况下，DDR2染色成纤维细胞。
的补充视频。取出成纤维细胞的表吸入。 点击这里观看电影 。
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Discussion
这个手稿中提出的方法，提供了一个快速和成本更低的替代，以消除从人类胚胎细胞培养的成纤维细胞饲养细胞。除去的成纤维细胞的成功依赖于存在的紧密，开发在较长的干细胞培养这些细胞的汇合单层。 7-10天之后，生长的胚胎干细胞的菌落将在向外的方向上推送纸器的成纤维细胞，生成之间菌落越来越致密的成纤维细胞单层。很强的细胞，细胞内的成纤维细胞单层的附件允许其迅速清除的细胞片。应该仔细注意的是，此纯化技术建议使用MEF，除去从人类胚胎干细胞的方法，作为只，而不是用于常规扩张培养实验之前。
另外，也可以利用该纯化技术来拯救质量差的干细胞集落。一个高品质的分销商应该表现出人类胚胎干细胞的殖民地NCT自己和饲养细胞之间的边界。然而，如果干细胞集落都发生部分分化，呈现良好定义的集落的边界，则此方法也可用于除去部分分化的胚胎干细胞的菌落一起MEF细胞片，然而，物理分离胚胎干细胞菌落吸管尖端可能会对需要任何人类胚胎干细胞的连接与不想要的分化的细胞或MEF分隔。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由新教师奖由美国加州再生医学研究所（RN2-00921-1），和美国国立卫生研究院资助的国家研究奖（F32-HL104924）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
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