Summary
למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.
Abstract
פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שמשו להקמת תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) תרבויות לאחר בידוד הבלסטוציסט 1. מערכת זו שומרת על מזין hESCs מעובר התמיינות ספונטנית במהלך התרחבות תא. עם זאת, שיטה זו משותפת התרבות היא עבודה אינטנסיבית, דורשת כוח אדם מיומן, וטוהר hESC נמוך תשואות 4. מעבדות רבות ניסו למזער את מספר התאים מזינים בתרבויות hESC (כלומר שילוב מנות מטריצה מצופות או סוגי תאים אחרים מזין 5-8). מערכות תרבות שונות אלו הראו תוצאות מבטיחות, אבל עדיין לא החליפו את השיטה הסטנדרטית לhESCs culturing עם fibroblasts embyronic עכבר C שטופל בmitomycin כדי לעכב בידול ספונטני לא רצוי של תרבויות hESC. לכן, התאים המזינים המשמשים בהרחבת hESC יש להסיר במהלך ניסויי בידול. למרות מספר טכניקות זמינות לטיהור שיתוף hESClonies (FACS, מקים, או שימוש בסמי וקטורים עמידים) ממתקני האכלה, טכניקות אלה הן עבודה אינטנסיביות, יקרים ו / או הרסני לhESC. מטרתו של פרויקט זה הייתה צריך להמציא שיטה לטיהור שמאפשרת הקצירה של אוכלוסייה טהורה של hESCs. אנו מציינים כי בתרבות hESC מחוברת, אוכלוסיית MEF ניתן להסיר באמצעות שאיפה פשוטה ומהירה של גיליון MEF. הסרה זו תלויה במספר גורמים, כולל קשירה לרוחב תא לתא של MEFs שיש זיקה מחייבת נמוכה למנת תרבות סטירן, והיכולת של מושבות תאי הגזע לדחוף את fibroblasts החיצוני בדור שלהם " נישה ". HESC היה אז נבדק לSSEA-4, Oct3 / 4 ו1-81 ביטוי Tra עד 10 ימים לאחר הסרת MEF כדי להבטיח תחזוקה של pluripotency. יתר על כן, מושבות hESC היו מסוגלות להמשיך ולצמוח מהם לתצורות גדולות יותר לאחר הסרת MEF, מתן רמה נוספת של התרחבות hESC.
Protocol
1. הכנה מתעלקת עכבר עוברי
- MEFs שימוש בשיתוף תרבות hESCs יש לטפל קודם לכן על ידי הקרנה או mitomycin-C כדי לעכב את התאים עוברים מחטיבה.
- שעות לפני זריעת MEF, מעייל כל פלזמה 60 מ"מ טופלו מנת התרבות עם 2 מ"ל של 0.05% לטין.
- הפשר בקבוקון של MEFs טופל וצלחת ב~ 20,000 תאים / 2 סנטימטר.
- אפשר התאים לדבוק בן לילה.
2. hESCs שיתוף זריעה על MEFs
- מושבות חדשות יכולות להיות יזם מתרבויות cryopreserved או תרבויות הנוכחיות passaging על מנות חדשות MEF מצופים, כלהלן.
- לשטוף את הצלחת המכילה מושבות hESC הגדולות להיות passaged זמן 1 עם 3 מ"ל של 1x PBS המחומם.
- הוסף 3 מ"ל של collagenase IV / PBS פתרון (1 מ"ג / מ"ל), ודגירה במשך 5-10 דקות בשעת 37 ° C. (הערה: התאים לא יהיו ברורים או כדור כפי שראיתי עם טריפסין).
- בעוד שהתאים עדיין בcollagenase, השתמש קצה קצה pipet 5 מ"ל ליצירת דוגמת רשת על המושבות, הפרדתן לגושי תאים קטנים.
- השתמש בקצה של קצה pipet (שנערך באופן מאונך לצלחת התרבות) כדי לגרד את התחתית של צלחת התרבות, ומסלק את כל התאים מפני שטח.
- לאסוף את התאים לתוך צינור וספין פלקון ב( 1000 סל"ד) למשך 5 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב את המדיום, ומשאיר את התא גלול ב צינור פלקון.
- לשאוב את מדיום MEF מMEFs המצופה היום קודם לכן.
- Re-צלחת תאים ביחס 01:03 מהצלחת המקורית, ולהאכיל עם 3 מ"ל של מדיום hESC
3. Depleting MEFs משיתוף התרבות
הערה: תרבויות ESC אדם חייבות להיות בצפיפות גבוהה, בדרך כלל בין 10 עד 14 ימים של התרבות.
- הנח את קצה pipet aspirating בשולי הצלחת ולאפשר היניקה משוכה בעדינות את הקצה של גיליון MEF.
- R סר התקשורת מהצלחת, ולאפשר את הקצה כדי לתפוס את גיליון התא ולהזיז את הקצה לאט בצורה קשתית מעל לצלחת. הערה: הגיליון עלול לסתום בקצה pipet, אבל זה לא בעייתי כמו שזה לא צריך למנוע מהמשתמש מושך את הסדין באופן ידני מפני השטח של צלחת התרבות. אם התאים תקועים לסוף aspirator, אתה יכול להשתמש בחלק העליון של צלחת התרבות לשבור את גיליון התא לשאיפה מלאה.
- החלף בינוני hESC באופן מיידי, והחזרת את הצלחת לאינקובטור.
4. נציג תוצאות
התוצאה הסופית של תהליך הסרת MEF מייצרת מושבות קטנות ללא הפרעה hESC (1D איור) מסוגלות לעבור הרחבה משמעותית במושבות גדולות מאוד (איור 2), תוך שמירה על ביטוי של מקבלי pluripotency SSEA-4, אוקטובר ¾ וTra 1-81 (איור 3).
ין עמודים = "תמיד"> 
איור 1. מורפולוגיה מושבת ESC לפני ואחרי הסרת MEF. מושבות אדם תאי גזע עוברי ב) 1 יום ו ') יום 2 לאחר זריעה על צלחות תרבית. ג) בצפיפות גבוהה מושבות אדם תאי גזע עוברית (H7) מוקפות MEFs. שתי מושבות hESC מפורטות במקפים אדומים. ד ') לאחר הסרת MEF באמצעות טכניקת השאיפה תארה, אנחנו נשארים עם מושבת hESC מבודדת עם מעט מאוד MEFs מקיפה את המושבה ללא פגע.
איור 2. הרחבת מושבת ESC 10 ימים לאחר הסרת MEF. מושבת hESC המקורית מייד לאחר דלדול MEF (משמאל) מותרת להרחיב למושבה גדולה מאוד (מימין) approximately 800 מיקרומטר, 10x. שים לב שהמושבה המקורית צלמה באותו הגדלה (10x) כמושבה מורכבת.
איור 3. Immunostaining מושבות hESC MEF-מדולדלת. זיהוי Immunofluorescent מושבות עד 10 ימים לאחר דלדול MEF מראה כי מושבות לשמור על ביטוים של סמני pluripotency כפי שמשתקף מאוקטובר ¾, SSEA-4, והמכתים Tra-1-81. יתר על כן, מושבות hESC אלה אינן מציגות בידול כלפי גורל mesodermal, שצוין על ידי היעדר flk-1., E, I, ו-M) הן תמונות העברת אור של מושבות immunoflouscently המוכתמות, 20, 10, 10 ו 2x, . בהתאמה B, F, J, ו-N) מראה גרעינים -. התאים מוכתמים DAPI של מושבות immunofluorescently המוכתמות, 20, 10, 10 ו 2x, בהתאמה CD) מראה ביטוי שלסמן תאי גזע אנושי SSEA-4 בלבד, ותמונה מורכבת, 20x. GH) מראה ביטוי של אדם תאי גזע הסמן אוקטובר ¾ בלבד, ותמונה מורכבת, KL 10x.) מראה ביטוי של סמן תאי גזע האנושי טרה 1-81 בלבד , ותמונה מורכבת, 10x. MP) השורה האחרונה אם תמונות מתארות מושבה מגלמת את הגבולות החלקים הטיפוסיים ראו בהגדלה זו, 2x, ומושבות אלה לא הביע O) flk-1, סמן מוקדם של בידול מזודרם, וגם לא הם P) מכילים fibroblasts כפי שמוצגים על ידי העדר צביעת DDR2.
וידאו המשלים. הסרת פיברובלסטים על ידי שאיפת גיליון. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שהוצגה בכתב היד הזה מציעה אלטרנטיבה מהירה וזול יותר לחיסול תאים מזינים פיברובלסטים מתרביות תאים עובריות אנושיות. ההסרה המוצלחת של fibroblasts תלויה בקיומו של monolayer חוזקה confluent של תאים אלה שמתפתחים בתרביות תאי גזע ארוכות יותר. לאחר 7-10 ימים, מושבות hESC הגוברות לדחוף את fibroblasts המזין בכיוון החוצה, שהניבה monolayer פיברובלסטים צפופים יותר ויותר בין מושבות. מצורף תא לתא החזק בתוך monolayer פיברובלסטים תאפשרו ההסרה המהירה שלה כגיליון תא. יש לציין בזהירות כי טכניקת טיהור זה הציע לשימוש כשיטה להסרת MEF מhESC לפני ניסויים בלבד, ולא ישמשו להתרחבות התרבות שגרתית.
כמו כן ניתן לנצל טכניקת טיהור זה כדי להציל את מושבות של תאי גזע באיכות ירודה. מושבת hESC איכות גבוהה צריכה להפגין distiNCT גבולות בין עצמם ואת התאים המזינים. אם, לעומת זאת, המושבות של תאי הגזע שעברו התמיינות חלקית, מציגים גבולות פחות מוגדרים היטב מושבה, אז שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להסיר את מושבות hESC חלקית הבדיל יחד עם גיליון תא MEF, אולם הפרדה פיזית של מושבות hESC עם טיפ pipet ייתכן שיהיה צורך להפריד שום קשרי hESC עם תאים המובחנים הרצויים או MEF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי פקולטה לפרס שני חדשה ממכון קליפורניה לרפואת הרגנרציה (RN2-00921-1), ופרס לאומי למחקר NIH במימון (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
