Summary
抗微生物或抗癌的应用，如半导体量子点（量子点）的纳米粒子可以被用于创建photoactivatable代理。此技术演示如何水溶解碲化镉（碲化镉）量子点，他们共轭抗生素，并执行基于生长曲线和平板计数的细菌抑制法。
Abstract
量子点（量子点）的大小取决于发射光谱荧光半导体纳米可以通过广泛的波长选择兴奋。量子点成像，诊断和治疗，由于其明亮，稳定的荧光1,2 3,4,5吸引了很多人的兴趣。量子点可以结合多种生物活性分子结合到细菌和哺乳动物细胞6。
量子点也被广泛的调查，有针对性的杀死细菌的细胞毒性药物。乘耐药菌株的出现，正在迅速成为一个公共健康危机，特别是在7革兰阴性菌的情况下。由于众所周知的某些纳米材料，特别是银的抗菌效果，有数以百计的研究研究纳米粒子的毒性细菌8。与其他类型的半导体纳米粒子，以及进行细菌研究，ESPECially纳米TiO 2 9,10-11，而且氧化锌12和其他包括CuO的13。在这些研究中一些比较菌株已执行，通常比较，用革兰氏阳性的革兰阴性应变。所有这些粒子毒性的机制是由于氧化作用：无论是光学生成的活性氧（ROS）的颗粒或直接释放的金属离子可以引起氧化毒性。即使这些材料，不同的研究结果差异很大。在一些研究中的革兰氏阳性的测试应变据说超过革兰氏阴性10敏感;有些是相反的14。这些研究已审查15。
在所有纳米研究，颗粒组成，大小，表面化学，样品老化/击穿，和波长，功率，光线照射的时间都可以显着影响的结果。此外，甲醇合成小号的副产品和溶剂必须考虑16 17。高通量筛选技术需要能够制定有效的新的纳米药物。
CdTe量子点有18单独或与抗生素联合抗微生物作用。在先前的研究中，我们发现，抗生素的耦合，以碲化镉可以增加对细菌的毒性，但下降到哺乳动物细胞的毒性，由于减少活性氧的生产共轭19。虽然这是不太可能将批准供人类使用含镉化合物，这类制剂可用于表面或水的杀菌消毒。
在这个协议中，我们给出一个简单的方法，以巯基丙酸（MPA）的溶解与CdTe量子点。量子点是准备在一个小时之内使用。然后，我们证明耦合抗菌剂。
该协议的第二部分演示了96抑菌试验用结合和游离量子点。读了许多小时的光密度，允许QD加法和光线照射后恢复期间，以及立即进行评估的影响。我们也说明了量化细菌生存的殖民地计数。
Protocol
1。量子溶
这是一个对于CdTe的适当方法。类似的方法可以用来与其他类型的量子点，如磷化铟/硫化锌20和硒化镉/硫化锌21。
- 准备在15μM（光密度= 2.5在第一激子峰）的甲苯CdTe量子点的解决方案。
- 200μL此股票转移到玻璃小瓶。不要使用塑料！
- 加入800μL的甲苯，1 mL的200 mM硼酸盐缓冲液（pH值9）和11.5米巯基丙酸（MPA）2μL。
- 例小瓶和大力摇晃30-60秒。
- 水和有机溶剂相分离油然而生。水相，将成为量子点的颜色。为了避免甲苯层，删除它，抛弃它。然后转移到一个干净的小瓶水相。
- 四次使用500微升，10000分子量截止离心机的过滤清洗/过滤净化溶解量子点。过滤器应在13分钟3000 XG纺。至少在过去两年清洗，用理想的最终缓冲区。
- 最后一次洗涤后，暂停50 mM硼酸盐缓冲液洗过的量子点所需的pH值并储存在4°C他们将是稳定为1-2周。
- 吸收和发射光谱测量来估计基于公布的公式22的浓度。
代表结果：图1 CdTe量子点的图像显示紫外灯照射下，发射光谱，溶水前后帽交换微不足道的变化。大小的值是通过电子显微镜的核心直径测量。
2。量子点共轭以抗生素
本协议的一部分，是适用于任何带负电荷的水溶解的纳米粒子，包括最商业的量子点，金属颗粒，和更多的19。
- 任何分子将工作，eith呃自组装到带负电荷的溶解量子点，或具有活性基团，如伯胺，可以结合。在这个例子中，我们使用的是多粘菌素B（港航局），这是带正电荷和自组装，而不需要对共轭试剂。 60微米，溶解在H 2 O的港口及航运局。 （如果选择的抗生素是不溶于H 2 O，溶于DMSO或乙醇浓度在0.1-1毫米）。这将是10倍的解决方案（H2O）或100倍溶液（溶剂）。
- 计算需要多少量子点的解决方案，你会为细菌的毒性试验。为0.3毫升，每口井在一式四份的96孔板，需要0.5毫升的200 nm的共轭。准备两管含100μL1微米量子点在50毫米的硼酸盐缓冲。
- 如果耦合小学胺，准备了19毫克/毫升（100毫米），1 -乙基-3 - [3 -二甲氨基]碳二亚胺盐酸溶液中H 2 O（东区区议会） EDC是在溶液中不太稳定;使用立即抛出的休息带走。
- 加入50μL10抗生素溶液（H 2 O）或5μL的100倍溶液（溶剂）的共轭管。为港口及航运局：碲化镉共轭摩尔比30:1，加入50μL60μM的港口及航运局。 H 2 O或溶剂的QD只控制管。
- 如果需要，添加共轭管EDC原液1μL。
- 带来了相应的缓冲区（硼酸盐缓冲或PBS，如Tris，不含有胺缓冲区，因为它们会抑制的EDC）共轭量0.5毫升。
- 盾构管光铝箔，并在1小时nutator或摇杆的地方。如果发生聚集，重复共轭用低浓度的抗生素。滴定的浓度上升，直到颗粒不总额。
- 通过适当的过滤器的清洗标记。 10000截留分子量对大多数抗生素，但不适用于蛋白质或抗体。 根据分子，不同的方法可以用来估计每个量子点抗生素分子吸收或荧光光谱，凝胶电泳，或傅立叶变换红外光谱（FTIR）。
代表性的结果。在这个例子中，港口及航运局共轭的特点是由量子点发射光谱的变化。 图2显示了与港口及航运局除了CdTe量子点的光谱。
3。 96屏幕的制备细菌抗生素的IC 50的测定;
这是适用于几乎所有的菌株生长在适当的培养基18。确切的时间记录应继续长度取决于细菌的增长速度。在我们的例子中，我们使用大肠杆菌溶源性肉汤（LB）培养基中生长。
- 为了选择适当的QD共轭浓度，重要的是要知道IC的抗生素50是共轭，如果量子点本身是有毒的。这应开始前2天，共轭实验。在晚上，从一个全新的殖民地种子10毫升细菌生长的培养基，使用正确的消毒和生物安全技术。
- 第二天，实验前1-2小时，填补近最大金额的生长介质板一个明确的底部96井。使用多道移液器，种子，每口井的细菌培养与1-50μL（浓度将取决于特定菌株的生长速度有多快，将需要您的实验室校准）。
- 放进酶标仪板，将它设置为读2小时，每隔10分钟，在一个确定的波长（通常是600纳米）。监控板，使细菌不生长过于密集，太快。
- 当细胞达到外径= 0.1-0.15，从酶标仪板和停止录音。
- 单独添加药物和量子点独自一人不同浓度至少一式三份。使用板的一面，作为一个“黑暗”的控制和一半被照亮。 图3给出了一个建议布局。浓度应跨越一个足够宽的范围内包括的浓度，抑制细菌很少，并杀死他们。
- 屏蔽铝箔板的一侧的“黑暗”。揭露对方在所需波长的灯。我们使用一个自定义的96孔，440纳米灯从2.4兆瓦的发光二极体（ 图4）照射30-60分钟。有明确的底部的黑色板，帮助未曝光的细菌免受杂散光。暴露和未暴露双方之间也可以使用一个空列。
- 光线照射后，放入酶标仪和纪录外径600取决于增长率为5-12小时，每10分钟的板块。保持温度<32℃，如果可能的话，以避免干燥的文化。
- 绘制生长曲线在选定的时间点与日志[浓度]和确定的IC 50对抗生素的使用希尔方程：
其中 H为Hill系数，Y 最大的增长（位于高原）的最高点，并Ÿ 分是零点，在高原也理想。这是不可能单独量子点表现出很大的毒性，在使用浓度的细胞，因此将无法确定一个值。
有代表性的成果。在录音期间结束时，明确井将显示完整的细胞死亡，细胞密度梯度应该一起出现的药物浓度增加。细菌应该显示出S形的生长曲线（ 图5）;高原最大的位置将有很大的差别应变应变，也依赖于温度。可以是一个给定的时间点为代表的选择和值绘制与日志[抗生素]给的IC 50（ 图5）。来评估量子点的毒性，生存与日志[量子点也可以被绘制，但与量子点实现显着的细菌杀死，仅仅是罕见（ 图5）。
4。细菌与抗生素/量子点的屏幕为96的制备
- 一天前的试验，种子10毫升到适当的营养丰富的培养基从一个全新的殖民地文化，用正确的消毒和生物安全技术。 QD抗生素共轭应准备在这一天，除非它是非常不稳定的。
- 实验前1-2小时，填补近最大金额的生长介质板一个明确的底部96井。 1-50细菌培养液使用多道移液器，种子，每口井。
- 放进酶标仪板，将它设置为2小时，每10分钟在相同的波长，在第3部分读。
- 当细胞达到外径= 0.1-0.15，从酶标仪板和停止录音。
- 至少一式四份中添加不同浓度的量子点标记。使用板的一面，作为一个“黑暗”的控制和一半被照亮。 图6给出了一个建议布局。一个细菌只控制条应始终包括在文化，温度的情况下问题，影响生长条件。一种药物只单一带和QD只也应列入，以确保它们符合以前完成控制盘。其余的井都致力于标记，以便为良好的统计。
- 屏蔽铝箔板的一侧的“黑暗”。揭露对方在所需波长的灯。
- 光线照射后，放入酶标仪和600记录外径为5-12小时，每10分钟的板块。保持温度<32°C，如果可能，以避免博士英文化。
有代表性的成果 。量子点和抗生素的结合，可能是抗生素的毒性小于单独同样有毒或毒性更大。这是可以量化的生长曲线和IC 50测量。 图7显示了一个例子，同样作为抗生素的毒性标记，更有毒的标记，例如。
5。平皿计数
- 选择一个或多个井治疗的96孔板，可用于连续稀释和菌落计数。
- 使每个PBS或生理盐水溶液（0.9％氯化钠）与选定的细菌样本的连续稀释。转移20μL的细菌溶液和180μL盐水稀释，改变枪头，混合和转移20μL180μL盐水稀释细菌的解决方案。重复6次。
- 10μL，在适当采取从每个稀释和平板固体介质板。一个样品的全部8浓度可能被镀上了10厘米的圆形培养皿，虽然矩形菜是首选，因为它是更容易办事。
- 让它干上15分钟的替补。然后在适当的温度为您的细菌孵化16个小时。
- 计数菌落，计算菌落形成单位（CFU）根据（＃殖民地x稀释倍数）/体积镀CFU /毫升。
图8显示了一个例子菌落形成单位板。
6。代表结果
图1。CdTe量子点。 （一）八CdTe量子点的准备照亮紫外棒（365纳米）。 （二）五大小选定前，后水溶解吸收和发射光谱。虚线是在甲苯中的光谱，实线是水。
files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg“/>
图2。QD-港航结合物的光谱和凝胶分析。橙色发光CdTe量子点用于这个例子，对其他类型的量子点的影响将需要为每个实验评估。 （一）典型的吸光度（灰线）和发射光谱（黑线）的量子点之前，港口及航运局和发射后的160个港口及航运局的摩尔等值除了（虚线）的共轭。 （二）港航比和量子点发光强度（正方形）和峰值波长位置（三角形）之间的关系。
图3。建议板控制生长板的布局。代表一个广泛的港口及航运局和QD浓度。辐照板的二分之一（高亮蓝色），相同的一半是由轻保护。 点击这里查看大图。
图4。自96 LED灯板照射均匀，显示和外观关闭。一个典型的手持式紫外灯也可能被使用，但不会覆盖整个板均匀。
图5。控制生长板的例子结果。 （一）代表不同的药物浓度与细菌生长曲线，从0到完成细胞死亡。开放的符号是港口及航运局只用浓度定;坚实的符号是没有辐射的CdTe，港口及航运局和半满的符号与辐照碲化镉，港口及航运局。照射没有港航局只样品的效果，因此这些曲线，为清晰起见，省略。所有港口及航运局的CdTe标记是30:1港口及航运局：量子点比率。 （二）符合地块生长曲线值在200分钟与日志[港航]和式。 （1）。到CONTROL光线的影响，曲线是抗生素，只用灯光照射30分钟。 （三）在200分钟与CdTe量子点，量子点浓度的细菌生存。一定的毒性被曝光，但过于不大确定的IC 50值。 点击这里查看大图 。
图6。建议共轭测试板的布局。蓝色突出显示一半的板块应暴露在光线下，保护的unhighlighted一半。 点击这里查看大图 。
图7例共轭测试板的结果。在200分钟的生长曲线值分别为PLotted和适合式。 （1）。 （一），碲化镉，港口及航运局的标记显示增加对港航单独的毒性。 （二）黄金纳米金港航局共轭不超过港航仅增加毒性。
图8。的菌落形成单位板块为例。E.在96孔板接种大肠杆菌与QD-港航治疗或未经照射30分钟。然后在32°C孵育4小时。每个细菌样品连续稀释用生理盐水溶液，10μL100×10 7 X稀释琼脂平板上接种。培养板在37°C和殖民地后16小时计算。板显示沿指示行的稀释;列是：（一）港口及航运局2纳米CdTe的0.06微米，（二）0.12微米的PMB + 4 nm的碲化镉（三）0.2μM的港口及航运局+ 6.7纳米CdTe的，（四） 0.06微米港口及航运局+ 2 nm的碲化镉照射，（五）0.12微米港航+ 4 nm的碲化镉照射（F）0.2μM的港口及航运局+ 6.7纳米CdTe的照射diated。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
纳米粒子代表一个充满希望的方式来创造新的抗微生物药物。生长曲线分析是一种方法来监测细菌细胞密度区分积极从生长抑制细胞生长的细胞。加上平板计数时，它可以让一个共轭抗生素潜力的深入分析。 96格式允许浓度相对高通量变化和其他条件，如光线照射;后者是光活化剂，如量子点是至关重要的。这个基本的方法上的许多变化是可能的，使它成为一个纳米毒理学的通用的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由NSERC个人发现程序的NSERC / CIHR协作的健康研究计划（CHRP）和NSERC的CREATE加拿大天体培训计划（CATP）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borate Buffer Component #1 | Fisher | Boric acid A-74-1 | |
| Borate Buffer Component #2 | Sigma-Aldrich | Sodium Tetraborate B9876 | |
| MPA | Sigma-Aldrich | M5801 | |
| Vivaspin 500 | GE Healthcare | 28-9322 | Various MWCO available |
| Glass vials | Fisher | 03-338C | |
| EDC | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P1004 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #1 | Fisher | NaCl S271 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #2 | BD | Tryptone 211705 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #3 | BD | Yeast Extract 211929 | |
| Lamp for light exposure | Custom | ||
| Clear-bottom 96-well plates | Fisher | 07-200-567 or 07-200-730 | |
| Fluorescence spectrometer | Molecular Devices | ||
| Absorbance plate reader | Molecular Devices | ||
| BactoAgar for solid media | Bioshop | AGR001.1 | |
| Petri dishes round | Fisher | 08-75-12 | |
| Petri dishes rectangular | Fisher | 08-757-11A |
References
- Michalet, X. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Jamieson, T.
- Asokan, S. The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods. Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).
- Chan, W. C. W. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).
- Chan, W. C. W., Nie, S. M. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science. 281, 2016-2018 (1998).
- Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging. Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).
- Boucher, H. W. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).
- Morones, J. R. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).
- Mitoraj, D. Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide. Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).
- Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings. J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).
- Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).
- Nair, S. Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Rincon, A. G., Pulgarin, C. Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater. Catal. Today. 101, 331-344 (2005).
- Neal, A. L. What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).
- Kovochich, M. Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition. Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).
- Hoshino, A. Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates. Nanotechnology. 22, 185101 (2011).
- Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production. Nanoscale. 2, 114-121 (2010).
- Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies. Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).
- Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots. Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).
