Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

Summary

В этой работе мы объясняем, изготовление и использование смесителя микрофлюидных способны смешения двух решений в ~ 8 мкс. Мы также продемонстрировать использование этих смесителей с спектроскопического обнаружения с использованием УФ-флуоресценции и флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET).

Abstract

Процесс, посредством которого белок сворачивается в свою нативную конформацию имеет самое непосредственное отношение к биологии и здоровье человека еще до сих пор плохо изучены. Одна из причин этого является то, что складной происходит в широком диапазоне временных масштабов, от наносекунд до нескольких секунд или дольше, в зависимости от белков ^1. Обычные остановил поток смесители позволили измерения складной кинетика, начиная примерно в 1 мс. Недавно мы разработали микрофлюидных микшер, который разбавляет денатуранта ~ 100 раз в ~ 8 мс ^2. В отличие от остановленного потока смесителя, это миксер работает в режиме ламинарного потока, в котором турбулентности не происходит. Отсутствие турбулентности позволяет точно Численное моделирование всех потоков в смесителе с отличным соглашение экспериментировать ^3-4.

Ламинарного потока достигается при числах Рейнольдса Re ≤ 100. Для водных растворов, для этого требуется геометрии микронных размеров. Мы используем твердый субстрат, таких как кремний или плавленого кремнияса, чтобы каналы 5-10 мкм в ширину и 10 мкм глубоко (см. Рисунок 1). Самый маленький размер, на входе в смесительный области, составляет порядка 1 мкм. Чип с печатью тонкого стекла или плавленого кремнезема покровное для оптического доступа. Типичные общего линейной скорости потока ~ 1 м / с, что дает Re ~ 10, а потребление белка только ~ 0,5 нл / с или 1,8 мкл / час. Концентрация белка зависит от метода обнаружения: Для флуоресценции триптофана типичный концентрации 100 мкМ (на 1 Trp / белок) и FRET-типичная концентрация составляет ~ 100 нм.

Складной процесс инициируется быстрого разведения денатурации от 6 м до 0,06 М гидрохлорида гуанидина. Белка в высоком денатуранта стекает центральный канал и встретился с обеих сторон в области смешения буферными без денатурации перемещение ~ 100 раз быстрее (см. Рисунок 2). Такая геометрия приводит к быстрому сужению белка поток в узкомструи ~ 100 нм. Распространение света денатурации молекулы очень быстро, в то время как распространение тяжелых молекул белков происходит гораздо медленнее, распространяя менее 1 мкм в 1 мс. Разница коэффициента диффузии и денатурации белков приводит к быстрому разбавлению денатурации белка из потока, снижение эффективной концентрации вокруг денатурации белка. Белок струйных течений с постоянной скоростью по каналу наблюдения и флуоресценции белка при складывать можно наблюдать с помощью сканирующего конфокальной микроскопии ^5.

Protocol

1. Изготовление микрофлюидных смешивания фишки

На рисунке 3 показаны основные этапы производства.

1. Очистите 4 дюйма (100 мм) пластин кремния плавленого свежим раствором Piranha (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O _2): а) тепло серной кислоты до 130 ° С, затем влить в перекиси водорода. Обратите внимание, что шероховатость поверхности и плоскости расплавленного пластин кремния использовались играют важную роль для окончательного шага связи. II) Погрузите пластин, по крайней мере 30 минут. III), промыть в течение 5 минут с водой и сухим. Применение поликристаллического кремния (поли) покрытием, ~ 1 мкм на каждый предназначены 10 мкм глубина окончательный микрофлюидных каналов, с помощью низкого давления, химического осаждения паров (LPCVD) печи.
2. Очистите пластины и маску, используя протокол Piranha в шаге 1.1. Очистите маску, так же, затем смойте ацетон, метанол и изопропанол и сушить немедленно. Высушить пластин на горячей плите на 150 ° С в течение ~ 10 минут (использовать палатку алюминиевой фольгой, чтобы частицы езды) или 120 ° С духовке в течение по крайней мере, 120 мин (на ночь предпочтительнее). Для увеличения адгезии фоторезиста, сразу же подвергать теплые вафли в HMDS пар в течение 5 минут. Спин покрытие пластин с ~ 900 нм слоем фоторезиста AZ5214 и мягкие выпекать при температуре 90 ° C непосредственно на плите в течение 1 минуты или в духовке при 110 ° С в течение 30 мин (рис. 3, п. 1).
3. Совместите маску и принять нелегкое и отсоса воздуха. Подвергать воздействию ультрафиолетового излучения в течение нескольких секунд (полная энергия: ~ 103 мДж / см ²⁾ (рис. 3, п. 2). Разработать с AZ400K разработчик, разбавляют водой 4:01 DI на ~ 50 секунд (пока фоторезист полностью разработан), а мягко агитацию. Промыть водой в течение 2 минут. Проверьте черт с микроскопом (рис. 3, пункт 3). Если функции плохо решена, лишить фоторезиста и начните снова с 1.2. Жесткий выпекать 115 ° C непосредственно на плите в течение 2минут.
4. Descum вафли с Ашер или O ₂ плазмы в течение 2,5 минут при 100 Вт мощности РФ. С помощью глубокого реактивного ионного гравер (DRIE), травления поликремния слой на всем пути до плавленого кварца ниже. Снимите оставшийся фоторезист с PRS2000 противостоять зачистки при 75 ° С в течение 10 минут. Промойте и высушите. Измерить глубину травления, чтобы обеспечить это все путем поли покрытием (рис. 3, п. 4).
5. Использование оксида способны DRIE таких как ULVAC НЛД-6000 гравер, травления кварцевого стекла на глубину ~ 10 мкм на микрон толщины покрытия пола (рис. 3, шаг 5). Это покрытие пола будут стерты во время травления, так что может быть необходимо, чтобы проверить целостность покрытия периодически во время процесса травления. Если намеренно безликие районы поверхности пластины стали голые защитные покрытия пола в процессе травления, поверхность, скорее всего, стали без косточек и больше не подходит для склеиванияВ заключительных этапах производства. В этом случае пластины, скорее всего, больше не жизнеспособна. Очистите с матрицей Ашер в течение 4 минут, 100 Вт ВЧ-мощность. Снимите поликремния с XeF ₂ гравер (рис. 3, пункт 6). Это может быть необходимо повторить шаг 1,4 и этот шаг несколько раз, чтобы удалить все фоторезиста и поли покрытий.
6. Спиновая слой пластины с новыми ~ 1 мкм слой фоторезиста для защиты каналов во время последующей обработки. Просверлите входа и выхода отверстия в каждом чипе с помощью компьютера управлять алмазные сверла или вручную с помощью пескоструйного аппарата (рис. 3, пункт 7). Если с помощью сверла, установите пластину (функция стороной вниз) на жертвенный стекло использованием Аква Бонд 55, заботясь, чтобы сохранить полуторный без пузырьков. Охладите дрель с микро-90 чистящий раствор. Это делает небольшие кусочки стекла от прилипания к каналам, которые затем забивают чипа во время использования.
7. Промыть пластины с DI воды с помощью шприца вводят WВодный в каждое отверстие. Замочите в мыльной воде в течение часа. Удаление фоторезиста и Аква Бонда с PRS 2000 года 60 ° С в течение нескольких часов, пока поверхность была чистой. Промыть пластины с DI воды и теплой мыльной воде. Промыть каждую лунку снова с помощью шприца, избегая травления особенности. Сухие пластины с азотом и в вакуумную печь установлена ​​в 120 ° C. Осмотрите отверстия, чтобы обеспечить их свободный песка и повторить очистку шаги по мере необходимости. Измерить глубину каналов либо с оптическим или механическим поверхности профилирования (рис. 3, шаг 8).
8. Чистая пластин и такое же количество 170 мкм плавленого стекла крышка кремнезема 1) Piranha решение (1-2 часов в соответствии с процедурой, описанной в 1.1), 2) RCA 2 (5:01:01 DI: HCl: H ₂ 0 ₂ ) решение в течение 10 минут при температуре 75 C, 3) RCA 1 решение (5:01:01 DI: NH ₄ OH: H ₂ 0 ₂₎ в течение 22 минут при 75C). Промыть водой DI в течение 5 минут между каждым решением.
9. Поместите один особенности пластины вверх на вершинуСтек 3-4 салфетки чистых помещений размещены в верхней части твердую плоскую поверхность, например, небольшой стекло. Сухие пластины полностью с азотом, по крайней мере 5 минут. Повторите с остеклением. Поднимите крышку стекла края и перевернуть так, что полированной стороной вниз, проведенных за пластины и выравнивания плоских краях. Аккуратно опустить крышку стекла на подложке и дайте ему отстояться. Сдвинуть только по горизонтали, чтобы настроить выравнивание. Надавите пальцем на центр пластины. Надо было видеть перед связи начинают излучать наружу. В случае необходимости, применить дополнительное давление на другие должности около пластины для продвижения связей передних (рис. 3, пункт 9).
10. Поместите запечатанном пластин в печи высокой температуры, установленной нарастить от комнатной температуры до 800 ° С в течение 3 часов, то от 800 - 1100 ° C в течение еще 1,2 часа. Держите при температуре 1100 ° С в течение 2 часов, а затем нарастить до комнатной температуры в течение еще 1,5 часа.
11. Кости с пластины перетасовки видел я вndividual чипов (рис. 3, пункт 10).
12. В протоколе описывается изготовление каналов в довольно необычной плавленый кварц субстрата, необходимого для обнаружения УФ. Но этот протокол также может быть адаптирована к кремниевой подложке, которая требует только одного травления шаге ^2. Стекла (но не плавленный кварц) покровного стекла могут быть связаны с использованием пластин анодной связи.

2. Установка и загрузка фишки

1. Многообразие проводить смешение Чип и решения могут быть выполнены из пластика, таких, как Lexan или оргстекла или алюминия для регулирования температуры (рис. 4). При использовании алюминия, решение резервуары должны быть покрыты Parylene для предотвращения растворения алюминия в растворах солей в водоемы. Температура всего многообразия решений и чип можно управлять с помощью термоэлектрического устройства, установленные по бокам и электронный контроллер.
2. Чип в паре с манираз малые кольца и удерживается на месте с стопорного кольца, что позволяет четко оптический вид на центр чипа. Уплотнительное кольцо пазы должны быть мельче, чем стандартные для обеспечения хорошего брачного без применения слишком большого давления на чип, то есть 002 уплотнительное кольцо должно быть 0,025 "глубоко. Когда чип установлен, добавить решения в центре и боковых резервуаров , заботясь, чтобы освободить всех захваченных пузырьков в нижней части скважины.
3. Потому что объемы, используемые в этом смесителе настолько малы, поток можно управлять с помощью давления воздуха применяется над раствором скважины. На рисунке 4 показана напорный коллектор в паре с верхней части чипа многообразия уплотнительные кольца. Напорный коллектор соединен с компьютерным управлением датчики давления, которые могут поддерживать давление от ~ 2-80 PSI. Чип был разработан так, что равное давление на центр и боковые каналы производят ~ 100 раз соотношение в линейных скоростях потока. На 20 PSI, линейная скорость потока на выходе канала ~ 1 м/ С.
4. Поместите многообразия на инвертированный микроскоп и изучить смешение региона окуляр или изображения с камеры. Лампы фонарика размещены в верхней части коллектора обеспечит достаточное количество света. Использование красителя или высокий показатель преломления раствора (т.е. 6 М гуанидина гидрохлорид) в центральный канал, чтобы посмотреть струи.
5. При равном давлении в центре и боковых каналов, струя будет трудно увидеть, так что глаза начинают с напорной стороны канала 0 PSI и медленно увеличивать на равный давлению. Если одна из сторон канала забиты, струя будет толкнул одну из стен выхода канала. Если видимые помехи Оказывается, это может быть выбит, применяя давление или вакуум к выходу канала с помощью шприца.
6. Если белка или других органических материалов забивает чип, он может быть очищен путем замачивания в растворе Pirhana ночь.

3. Сбор данных

На рисунке 5 показана основная оптическая схема прибора.

1. Возьмите с собой коллимированный лазерный луч в научно-класс микроскоп помощью дихроичных зеркала внутри или в непосредственной близости от микроскопа. Совместите лазер так, чтобы фокус можно увидеть в окуляр камеры или несколько рядом смешения региона.
2. Флуоресценции белка в смеситель собраны объективные и передается через дихроичных зеркала, фокусируется линзой в отверстие и отображается на счетчик фотонов. Сканирование чипов с помощью пьезоэлектрических сканера в х и у изображения смешения области (типичный размер шага составляет 2 мкм). Выберите позицию по струе и сканирования в х и г найти фокус по центру канала по вертикали. Глубина резкости микроскопа значительно меньше глубины канала и расход равномерно в канале, за исключением в 1 мкм стен. Таким образом, временное разрешение наблюдаемой флуоресценции определяется прежде всего размером конфокальной месте.
3. Сканирования по горизонтали в выходном канале (типичный шаг сИзе составляет 0,2 мкм поперек струи, 2 мкм вдоль струи) в 100 мкм шагом вдоль струи, наблюдая за ~ 1 мс в положение (см. рисунок 6). Перемещение столика микроскопа на 80-90 мкм вдоль струи, чтобы захватить более поздние времена.
4. Кроме того, свет может быть обнаружена с помощью спектрографа и ПЗС после дихроичных зеркала с помощью линзы для фокусировки света на входной щели. Поскольку сбор данных происходит медленнее, чем на счетчик фотонов (1 секунда в положении), как правило, струи отображаемого сначала счетчик фотонов, а затем точки вдоль струи измеряется с спектрографа (см. Рисунок 7).
5. Данные счетчика фотонов анализируется путем суммирования 3-5 пикселей вокруг струи на каждой позиции для создания сюжета интенсивности от расстояния. Время рассчитывается исходя из расстояния с использованием рассчитанных скоростей на основе приложенных давлений (см. рисунок 8).
6. Данные спектрографа можно проанализировать несколько способов. Для FRET, каналLs обозначены как «донор» и «акцептором» может каждый суммируются и близость соотношение E = I / (I + _D I _D), рассчитанный (см. Рисунок 9). Кроме того, одно разложение значения могут быть выполнены, чтобы посмотреть на независимых спектральных компонент в зависимости от времени, такие как сдвиг в спектре излучения триптофана, как белка складки.
7. Расстояние в выходном канале может быть преобразован в время, используя постоянную скорость потока определяется из приложенного давления в сторону канала. В течение первых 2 мкм на выход канала, расход белка ускоряет струю ~ 100х и время в этом регионе должны быть рассчитаны с анализа методом конечных элементов тока (производство времена приведены на рисунке 8). Это ускорение вызывает смещение ~ 1-2 мкс после скорости становится постоянным и, как правило, игнорируются при измерении кинетики гораздо медленнее, чем перемешивание.

4. Представитель Результаты

На рисунке 6 показан контур участка интенсивности в области смешения измеряется счетчик фотонов. Фона в выходном канале вне струи должны быть близки к шумов детектора и, как правило, не вычитаются. Выше фона может свидетельствовать о плохой выравнивания или, что белок придерживается стенки канала. Струи, которая выглядит перегибов или криво, особенно вблизи смешивания регионе, указывает на плохой травления из сопла.

На рисунке 7 показана время разрешенные спектры от белка ацил-коэнзим А-связывающий белок (ACBP) помечены Alexa Alexa 488 и 647. Эти данные были вычтены фон для удаления темных заряда и лазерный сигнал. Фонового сигнала было принято с давлением центрального канала установлен в 0 PSI.

Время перемешивания может быть измерена с помощью измерения быстрого реагирования, что значительно быстрее, чем смешение таких как тушение флуоресценции Trp бу К.И. или крах одноцепочечной ДНК, меченные FRET-красителей, при добавлении NaCl. Поскольку струя меньше, чем оптическое разрешение микроскопа, существует большое падение интенсивности перемешивания региона струи формы. Этот инструмент ответ может быть удалена путем контрольного измерения, в которых без изменения решение условиях. На рисунке 8 показано соотношение смешивания (в 400 мМ KI) и несмешивающихся эксперименты N-ацетил флуоресценции амид триптофан. Линия показывает предсказанные концентрации К.И. из COMSOL моделирования. Время перемешивания, измеренная как время для концентрации на снижение 80%, 8 мкс.

Так как данные, собранные в 100 мкм шагом по 500 мкм длиной выход канала, данные должны быть склеены из нескольких представлений. Есть иногда небольшие смещения сигнала между этими взглядами, вероятно, из-за небольших изменений в фокусе чип перемещается столик микроскопа. Перемещая стадии 80 или 90мкм на взгляд, эти смещения могут быть устранены путем исследования перекрывающихся данных. Обычно данные собираются, по крайней мере двум показателям расхода и данные объединяются для подтверждения любой сигнал изменения связаны с реальной спектроскопические изменения в белке, а не оптический или поток эффектов. На рисунке 9 показано лад изменения в белке ACBP после разбавления денатурации от 6 м до 0,06 М. Эти данные не нужен контрольный эксперимент с лада уже отношение и инструмент ответ уже удален. Быстрый скачок вблизи T = 0 представляет собой быстрое изменение FRET-сигнала в пределах времени перемешивания.

Рисунок 1. Схема смешивания области измеряется с помощью электронного микроскопа.

Рисунок 2. Схема смешивания гидродинамическим изучения сворачивания белков. Белка,растворяется в высоком денатуранта развернуть его, стекает вниз по центральному каналу в направлении смешения регионе, где она встречается буфера текущей ~ 100 раз быстрее. Ламинарного потока заставляет белок поток в узкий струи из которых денатурации молекулы могут быстро диффундируют. Как струя течет вниз по выходному каналу, белок можно наблюдать с высоким пространственным и временным разрешением помощью конфокальной микроскопии.

Рисунок 3. Изготовление плавленого кварца. 1) Процесс начинается с полированной 500 мкм плавленый подложки диоксида кремния (а) в слое поликристаллического кремния (поли), нанесенных на верхней и нижней поверхностей (б) и спин-покрыта слоем фоторезиста (с). 2) фотошаблонов (е) принес Int о жестком контакте с подложки и фоторезиста подвергается воздействию ультрафиолетового излучения (г). 3) пластина помещается в ванну и разработчик модели проявляется в фоторезиста. 4) пластина помещается в DRIE и особенности выгравированы в верхней поли покрытием. Фоторезиста удаляется. 5) поли затем действует в качестве маски, когда пластина помещается в оксид гравер и особенности травления 10 - 40 мкм на подложке плавленого кварца. 6) поли покрытие удаляется в XeF ₂ гравер. 7) пластины связаны с жертвенной стекло с тепло-активированной герметик (г), особенности стороной вниз, и немного алмазного бурения (е) абразивно сверла сквозные отверстия с тыльной стороны. 8) поверхность профилирования (ч), то непосредственно измеряет глубину травления функцию. 9) A 170 мкм плавленый кварц пластины покровным непосредственно связан с верхней поверхности пластины. 10) пластины на отдельные кубики микрожидкостных чипов.

3976/3976fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Смеситель многообразии. Микрофлюидных-чип крепится к решению многообразие с обработанной лицевой панели алюминием и четыре уплотнительные кольца при ~ 200 мкл водоемов. Большое отверстие обрабатывается через центр многообразия непосредственно над смешивания области прикреплены микрофлюидных-чип, позволяющий избыток ультрафиолетового света бежать без обратного рассеяния, подавляя любые авто-флуоресценции от самого многообразия и предоставления прямого освещения чип на глаз или камеры для выравнивания. Воздушный коллектор уплотнения каждого из водохранилищ, что давление воздуха в каждой можно управлять с помощью внешнего устройства регулирования давления.

Рисунок 5. Схема оптической конфокальной микроскопии.

Рисунок 6. Контур участок триптофанафлуоресценции в микрофлюидных смесителя. Смешение область расположена на ~ 90 мкм на оси ординат.

Рисунок 7. Зависит от времени флуоресцентные спектры собранных в смеситель. Зеленые и красные столбики длиной волны назначенного в качестве донора и акцептора каналов, соответственно.

Рисунок 8. Смешивание время, измеряемое тушение флуоресценции триптофана калия йодида (точки и правая шкала) и рассчитанные на анализ методом конечных элементов (линии, левая ось).

Рисунок 9. FRET-изменения измеряются в процессе сворачивания белков ACBP. Быстрый рост вблизи Т = 0 представляет собой взрыв в фазе смешения времени и медленный рост представляет собой постепенное накоплениеТион структуры в качестве белкового складки. Данные, принятые на двух разных скоростях потока и обложил, что приводит к различной плотности измерений в разное время.

Discussion

Быстрое перемешивание было одной из целей развития в области сворачивания белка в течение многих лет, потому что уже давно признано, что молекулярные процессы биомолекул происходит на временных масштабах от пикосекунд до нескольких секунд. Обычные остановил поток смесители имеют мертвый время 1-5 мс который в основном ограничивается турбулентность. Турбулентных смесителей непрерывного потока с перемешивания 30-300 мкс были разработаны в течение последних 15 лет небольшое количество групп, но как правило, требуют больших расходов для достижения этих перемешивания и, следовательно, использовать много образцов ^6-8.

Этот протокол описывает использование микрофлюидных смешивания чипов для достижения быстрого разведения в режиме ламинарного потока. Есть несколько преимуществ в работе в этом режиме, но основной из них является возможность моделировать весь процесс смешивания с высокой точностью, которая позволяет изменять смешения ответ. T-смесители, разработанные другими группами с простой геометриейetries показали, время перемешивания 100-200 мкс, что было в первую очередь ограничивается размером каналов ^9-10. По масштабирования размера каналов до 10 мкм Knight сократить время смешивания до ~ 10 мкс ^11. Яо и Bakajin показали, что небольшие изменения в геометрии может привести к значительному улучшению перемешивания ^4. Тем не менее, эта работа показала, что ускорения перемешивания также может привести к медленной фазы, а также. Конструкция, используемая в этой работе ^12-13 представляет собой компромисс между двумя лучшими проектами в работе ^4, чтобы минимизировать медленный экспоненциальный спад в денатуранта концентрации, а также сделать функцию более воспроизводимые в DRIE травления.

Там были некоторые разногласия в области сверхбыстрой смешивания по определению времени перемешивания. Важно понимать разницу между "перемешивания" и "мертвое время". Мертвое время определяется в турбулентном смесителе, как время, за которое ИЗМЕРЕНИЯт не может быть и на самом деле может быть значительно больше, чем фактическое время перемешивания. Это, как правило, определяется путем измерения несколько псевдо-первого порядка бимолекулярной реакции (такие как тушение флуоресценции триптофана N bromosuccinate) в различных концентрациях. Наблюдаемое экспоненциальный распад крепятся к сходятся в одном значении считать т = 0 с, а время между этой точкой и первым измеряется Дело в том, мертвое время. Для смесителей ламинарного потока, измерения могут быть сделаны во время процесса смешивания, поэтому нет мертвого времени, только время перемешивания. Время перемешивания просто время, чтобы объединить два решения, пока достаточное единообразие будет достигнута. Ранее мы уже определили время смешивания, чтобы быть 90/10 время, время для концентрации денатуранта сократится с 90% до 10% от несмешанных значение. Тем не менее, форма кривой смешения не является идеально симметричным хвост распадов с малым экспоненциальным компонента. Кроме того, сворачивание белков имееточень нелинейная зависимость от денатурации концентрации, так что складной часто может начинаться даже при денатурации только уменьшается в два раза. Поэтому мы совсем недавно определил время перемешивания, как раз для уменьшения денатуранта концентрации на 80%. Конечно, другие определения могут быть использованы в зависимости от требований эксперимента.

Использование данного смесителя для изучения сворачивания белков последовательно показали удивительные результаты. Складные цитохрома с и apomyoglobin давно изучены, чтобы иметь несколько складных шаги и первые результаты с непрерывным потоком смесители показал распад происходит на ~ 100 мкс сроки ^10,14-15. Наши измерения показали, этот микшер есть по меньшей мере, 2 шага на этом графике, очень быстро, скорее всего, неспецифические, коллапс (при измерении флуоресценции Trp спектральный сдвиг) в течение времени перемешивания смесителем следует медленнее фазы (как измеряется закалки от общего числа выбросов Trp), которые, скорее всего, ережде формирование нативной структуры ^5. Мы также наблюдали 50 мкс процесса в B1 домен белка L, опрокидывание традиционной интерпретации, что этот белок является 2-государство папка ^13.

Преимущество такого быстрого микшер, что он может исследовать складывающиеся из самых складной белки, которые, как правило, только были измеримы наносекундной T-прыжок инструментов. T-прыжок обычно требует наблюдения складывания / развертывания релаксации вблизи температуры плавления белка и, следовательно, никогда не следует складывания всего населения. С помощью этого миксера мы рассмотрели складывания γ-репрессор (λ ^6-86) с обеих выбросов Trp общего и спектрального сдвига так и не нашли доказательств того, что белок имеет никаких препятствий для складывающиеся под сильным складной условия, которые не были доступны для предыдущего T -переход измерений ^12. Наконец, мы измерили складывания головной убор villin HP-35, один из тОн быстро папки еще измеряется и обнаружили, что скорость измеряется складной после смешивания составляет ~ 5 раз медленнее, чем измеряется T-прыжок на тех же условиях ^16. Это означает, что складной кинетики зависит от начальных условий, опрокидывания основные предположения в этой области.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AZ P4110 Photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K Developer	AZ Electronic Materials
Baker PRS 2000 photoresist stripper	Avantor Performance Materials
AquaBond	AquaBond Technologies	AquaBond 55
500 μm cover wafer	SENSOR Prep Services		: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides
170 μm cover wafer	SENSOR Prep Services	7980 2G Wafers	: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides
Deep reactive ion etcher for oxides	ULVAC	ULVAC NL-6000
Argon Ion Laser	Cambridge Laser Laboratories	Lexel 95-SHG	λ=258 nm
Argon Ion Laser	Melles Griot		λ=488 nm
Microscope	Olympus Corporation	IX-51
Microscope Objective	Thorlabs Inc.	OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA	λ= 258 nm
Microscope Objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW 1.2 NA	λ=488 nm
Nanopositioner	Mad City Labs	Nano-LP100
Motorized Translation Stage	Semprex Corp	KL-Series 12-6436
GaAsP Photon Counter	Hamamatsu Corp.	H7421-40
Monochrometer	Horiba Instruments Inc	MicroHR
CCD camera	Andor	iDus 420A-BU
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505