Summary
In dit werk leggen we de fabricage en het gebruik van een microfluïdische mixer voor het mengen van twee oplossingen in ~ 8 ps. We tonen ook aan het gebruik van deze mixers met spectroscopische detectie met behulp van UV-fluorescentie en fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET).
Abstract
Het proces waarbij een eiwit vouwen in zijn natieve conformatie zeer relevant is voor de biologie en de gezondheid van de mens toch nog steeds slecht begrepen. Een reden hiervoor is dat vouwen plaatsvindt over een breed scala van tijdschema van nanoseconden tot seconden of meer, afhankelijk van de proteïne 1. Conventionele gestopt-flow mixers hebben toegestaan meting van het vouwen van kinetiek vanaf ongeveer 1 ms. We hebben onlangs een microfluïdische mixer die verdunt denatureringsmiddel ~ 100-voudig in ~ 8 ps 2. In tegenstelling tot een gestopt-flow mixer deze mixer werkt in de laminaire stroming regime waarvan turbulentie niet optreedt. De afwezigheid van turbulentie zorgt voor een precieze numerieke simulatie van alle stromen in de mixer met een uitstekende overeenkomst om te experimenteren 3-4.
Laminaire stroming wordt bereikt voor de Reynolds getallen Re ≤ 100. Voor waterige oplossingen, dit vereist micron schaal geometrieën. We gebruiken een harde ondergrond, zoals silicium of gesmolten silica, om kanalen 5-10 um breed en 10 urn diep (zie figuur 1). De kleinste afmeting, bij de ingang van het mengen regio, in de orde van 1 pm groot. De chip is afgesloten met een dunne glazen of fused silica dekglaasje voor optische toegang. Typische totale lineaire debieten ~ 1 m / s, waarbij Re ~ 10, maar het eiwit consumptie slechts ~ 0,5 nL / s en 1,8 pi / hr. Eiwitconcentratie afhankelijk van de detectie werkwijze: voor tryptofaan fluorescentie de gebruikelijke concentratie 100 uM (voor een Trp / eiwit) en FRET de gebruikelijke concentratie ~ 100 nM.
Het vouwen proces wordt gestart door snelle verdunning van denaturerend van 6 M tot 0,06 M guanidine hydrochloride. Het eiwit met hoge denatureringsmiddel stroomt een centraal kanaal en wordt voldaan aan weerszijden van het mengen regio buffer zonder denatureringsmiddel bewegen ~ 100 keer sneller (zie figuur 2). Deze geometrie zorgt snelle vernauwing van het eiwit stroom in een smallejet ~ 100 nm breed. Verstrooiing van het licht denaturerende moleculen zeer snelle diffusie van terwijl de zware eiwitmoleculen veel trager, diffusie minder dan 1 micrometer 1 ms. Het verschil in diffusieconstante van het denatureringsmiddel en het eiwit resulteert in een snelle verdunning van het denatureringsmiddel van het eiwit stroom, waardoor de effectieve concentratie van het denatureringsmiddel rond het eiwit. Het eiwit jet stroomt met een constante snelheid naar beneden waarneming kanaal en fluorescentie van het eiwit tijdens het vouwen kan worden waargenomen met behulp van een scanning confocale microscoop 5.
Protocol
1. Fabricage van Microfluïdische mengen Chips
Figuur 3 toont de basis fabricagestappen.
- Maak 4 inch (100 mm) fused silica wafers met verse Piranha-oplossing (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) Verwarm het zwavelzuur tot 130 ° C en giet er dan de peroxide. Merk op dat de ruwheid en de vlakheid van het kwartsglas wafers die een belangrijke rol voor de uiteindelijke hechting stap. ii) Dompel de wafers ten minste 30 minuten. iii) Spoel gedurende 5 minuten met water en droog. Breng een polysilicium (poly) coating ~ 1 pm dikke per elke bestemd 10 pm diepte van de uiteindelijke microfluïdische kanalen, met een lage druk chemische dampafzetting (LPCVD) oven.
- Maak de wafels en het masker met behulp van de Piranha-protocol in stap 1.1. Reinig het masker op dezelfde manier en spoel na met aceton, methanol en isopropanol en onmiddellijk föhnen. Dehydrateer de wafels op een hete plaat bij 150 ° C gedurende ca. 10 minuten (een aluminium folie tent weg te houden deeltjes) of 120 ° C oven gedurende ten minste 120 min (s nachts bij voorkeur). Om fotolak de grip te verbeteren, direct bloot te leggen van de warme wafels te HMDS damp gedurende 5 minuten. Spin laag de wafers met een ~ 900 nm dikke laag fotoresist AZ5214 en zachte bak bij 90 ° C rechtstreeks op een kookplaat voor 1 minuut in een oven bij 110 ° C gedurende 30 min (figuur 3, stap 1).
- Breng het masker en het is een harde en vacuüm contact. Bloot te stellen aan UV-licht een aantal seconden (totale energie: ~ 103 mJ / cm 2) (figuur 3, stap 2). Ontwikkelen met AZ400K ontwikkelaar, verdund 4:01 met DI-water voor ~ 50 seconden (tot fotolak volledig is ontwikkeld), terwijl voorzichtig roeren. Afspoelen met water gedurende 2 minuten. Inspecteer functies met microscoop (figuur 3, stap 3). Als functies worden slecht opgelost, strip de fotolak en opnieuw te beginnen van 1,2. Hard bak 115 ° C direct op een kookplaat voor 2minuten.
- Descum wafels met Asher of O 2 plasma voor 2,5 minuten bij 100 W RF-vermogen. Met behulp van een diepe reactief ion etser (DRIE), etsen de polysilicium laag helemaal door naar de fused silica hieronder. Strip de resterende fotolak met PRS2000 weerstand stripper bij 75 ° C gedurende 10 minuten. Spoel en droog. Meet de ets diepte om ervoor te zorgen het is helemaal door de poly coating (figuur 3, stap 4).
- Met een oxide kan DRIE zoals een ULVAC NLD-6000 etser etch kwartsglas met een diepte van ca. 10 pm per micron dikte van de poly coating (figuur 3, stap 5). Deze poly coating afstand gedragen tijdens het etsen, zodat het kan moet worden nagegaan de integriteit van de bekleding tijdens het etsen. Als opzettelijk monotone gebieden van het waferoppervlak geworden ontdaan van de beschermende coating poly tijdens het etsen is het oppervlak waarschijnlijk worden putjes en niet meer geschikt voor het verlijmenin de laatste fase van de productie. In dit geval wafer waarschijnlijk niet meer mogelijk. Reinigen met de Matrix Asher gedurende 4 minuten, 100 W RF-vermogen. Strip de polysilicium met een XeF 2 etser (figuur 3, stap 6). Het kan noodzakelijk stap 1.4 en deze stap een aantal malen te herhalen om alle fotolak en poly coatings te verwijderen.
- Spin laag wafers een nieuwe ~ 1 pm laag fotolak de kanalen beschermen tijdens latere hantering. Boor-en uitgang gaten in elke chip met behulp van een computergestuurde diamantgereedschap boor of handmatig met een zandstraler (figuur 3, stap 7). Bij gebruik van een boor, monteer de wafer (functie-kant naar beneden) op een offer glazen plaat met behulp van Aqua Bond 55, de zorg om de bonder vrij van luchtbellen. Koel de boor met micro-90 reinigingsoplossing. Dit houdt kleine glasscherven hechten aan de kanalen die vervolgens de chip verstoppen tijdens gebruik.
- Spoel de wafer met DI-water met behulp van een spuit te w injecterenater in elk gat. Geniet in een sopje voor een uur. Verwijder fotoresist en Aqua Bond PRS 2000 60 ° C gedurende enkele uren tot schoon is. Spoel wafer met DI-water en warm water en zeep. Weer Spoel elk gat met een spuit, het vermijden van geëtst functies. Droog wafer met stikstof en in een vacuümoven gezet tot 120 ° C. Inspecteer de gaten te zorgen dat ze vrij zijn van grind en het reinigen van de stappen als nodig te herhalen. Meet de diepte van de kanalen met een optische of mechanische oppervlak profiler (figuur 3, stap 8).
- Schoon wafels en een gelijk aantal van 170 micrometer dik fused silica deksel glazen met 1) Piranha-oplossing (1-2 uur volgens de procedure in 1.1), 2) RCA 2 (5:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) oplossing gedurende 10 minuten bij 75 C, 3) RCA een oplossing (05:01:01 DI: NH4OH: H 2 0 2) voor 22 minuten bij 75C). Spoelen met DI-water gedurende 5 minuten tussen elke oplossing.
- Plaats een wafer functies kant naar boven op de top vaneen stapel van 3-4 cleanroom doekjes bovenop een harde ondergrond, zoals een ruit. Droog de wafer grondig met stikstofgas tenminste 5 minuten. Herhaal dit met deksel glas. Neem dekking van glas door de rand en keer zodanig dat de gepolijste kant naar beneden gehouden over de wafer en lijn de platte randen. Voorzichtig laten vallen van de dekking van glas op de wafer en laat het bezinken. Verschuiven horizontaal slechts aanpassing te passen. Druk met een vinger op het midden van de wafer. Men moet zien een hechting voor naar buiten beginnen te stralen. Indien nodig, extra druk op andere plaatsen rondom de wafer aan de bonding voorzijde (figuur 3, stap 9) te bevorderen.
- Plaats de verzegelde wafers in een hoge temperatuur oven, ingesteld met het opvoeren van kamer temp tot 800 ° C gedurende 3 uur, daarna 800 tot 1100 ° C boven de andere 1,2 uur. Houden op 1100 ° C gedurende 2 uur, en opvoeren tot kamertemperatuur gedurende nog eens 1,5 uur.
- Dice met een wafer blokjes zag in iNDIVIDUELE chips (figuur 3, stap 10).
- Het protocol wordt de fabricage van kanalen in het zeer ongebruikelijk kwartsglas substraat die nodig is voor UV detectie. Dit protocol kan worden aangepast voor een siliciumsubstraat die slechts een etsstap nodig 2. Een glas (maar niet gesmolten silica) dekglas kunnen worden gebonden aan de wafer met anodische binding.
2. Montage en laden Chips
- Het spruitstuk de menging chip en oplossingen houden kan worden gemaakt van kunststof, zoals Lexan of plexiglas, of aluminium temperatuurregeling (zie figuur 4). Bij gebruik van aluminium, moet de oplossing reservoirs worden bedekt met parylene de ontbinding van aluminium te voorkomen door het zout-oplossingen in de reservoirs. De temperatuur van het gehele spruitstuk en-chip kan worden bediend met thermo-elektrische inrichtingen aangebracht aan de zijkanten en een elektronische besturing.
- De chip is gekoppeld aan de manivoudige door kleine o-ringen en op zijn plaats gehouden met een vasthoudring die duidelijk optische het centrum van de chip toelaat. De o-ring groeven zou moeten zijn ondieper dan de standaard om een goede dekking te garanderen zonder toepassing van te veel druk op de chip, dat wil zeggen dat een 002 o-ring zijn 0.025 "diep. Zodra de chip is gemonteerd, oplossingen toe te voegen aan het centrum en aan de zijkant reservoirs , zorg om luchtbelletjes gevangen op de bodem van de putten vrij.
- Omdat de hoeveelheid in deze menger zo klein zijn, kan de stroom worden met luchtdruk aangebracht boven de oplossing putjes. Figuur 4 toont de Manifold gekoppeld aan de bovenzijde van de chip verdeelstuk door O-ringen. De druk spruitstuk is aangesloten op de computer-gestuurde druk transducers die kunnen handhaven druk van ~ 2-80 PSI. De chip is ontworpen dat even druk op het midden en zijgeleiders a ~ 100-voudige verhouding in het lineaire debiet produceren. Bij 20 PSI de lineaire stroomsnelheid in de uitgang kanaal ~ 1 m/ S.
- Plaats spruitstuk op een omgekeerde microscoop te onderzoeken en te mengen regio met het oculair of camera-uitgang. Een gloeilamp zaklamp boven op het spruitstuk voldoende zorgen voor licht. Gebruik een kleurstof of een hoge brekingsindex oplossing (dwz 6 M guanidine hydrochloride) in het centrum kanaal te bekijken van de jet.
- Bij gelijke druk op het centrum en aan de zijkant kanalen, zal de jet moeilijk te zien zijn op het oog dus met de zijkant kanaal druk op 0 PSI starten en langzaam op gelijke druk. Als een zijkanaal verstopt zal de straal worden gedrukt tegen een van de wanden van de uitgangskanaal. Als zichtbaar klomp weergegeven kan worden verdreven door druk of vacuum naar de uitgang kanaal met een injectiespuit.
- Indien eiwit of ander organisch materiaal verstopt de chip kan worden gereinigd door onderdompelen in Pirhana oplossing overnacht.
3. Data Collection
Figuur 5 toont de basis-optisch instrument lay-out.
- Breng een gecollimeerde laserstraal in een onderzoek-grade microscoop met behulp van een dichroïsche spiegel binnen of net buiten de microscoop. Lijn de laser, zodat de aandacht te zien in het oculair en camera enigszins bij het mengen gebied.
- Fluorescentie van het eiwit in de menger door het objectief en die via de dichroïsche spiegel, gefocusseerd door een lens met een pinhole en afgebeeld op een fotonen. Scan de chip met behulp van een piëzo-elektrisch scanner in x en y om het imago van de regio mengen (typische stap grootte is 2 micrometer). Kies een positie op de straal scan x en z de focus vinden in het midden van het kanaal vertikaal. De scherptediepte van de microscoop is veel kleiner dan het kanaal diepte en het debiet uniform in het kanaal behalve binnen 1 pm van de wanden. Daarom de temporele resolutie van de waargenomen fluorescentie wordt hoofdzakelijk bepaald door de grootte van de confocale plaats.
- Scan horizontaal binnen de afslag (typische stap size is 0,2 um in over de jet, 2 micrometer langs de jet) in 100 micrometer stappen langs de jet, met inachtneming van voor ~ 1 ms per positie (zie figuur 6). Verplaats de microscoop podium met 80-90 micrometer langs de jet naar latere tijden vast te leggen.
- Als alternatief kan het licht worden gedetecteerd door een spectrograaf en CCD na de dichroïsche spiegel met behulp van een lens om het licht op de ingangsspleet scherp te stellen. Omdat het verzamelen van gegevens is langzamer dan voor de foton teller (1 seconde per positie), wordt meestal de waterstraal EERSTE afgebeeld met het foton teller en zijn de punten langs de straal worden gemeten met de spectrograaf (zie figuur 7).
- Gegevens van het foton teller wordt geanalyseerd door het optellen van 3-5 pixels rond de jet op elke positie op een perceel van intensiteit vs afstand te creëren. Wordt berekend op afstand met een snelheid berekend op de toegepaste drukken (zie figuur 8).
- Gegevens uit de spectrograaf kan worden geanalyseerd op een aantal manieren. Voor FRET, Channels aangeduid als "donor" en "acceptor" elk kunnen worden opgeteld en de nabijheid verhouding E = I A / (I D I + D) berekend (zie figuur 9). Als alternatief kan een waarde ontleding uitgevoerd om te zien onafhankelijk spectrale componenten versus tijd, zoals verschuiving tryptofaan emissiespectrum een eiwit plooien.
- Afstand in de uitgangskanaal kan worden omgezet in met de constante stroomsnelheid bepalen van de toegepaste druk van de zijgeleiders. In de eerste 2 pm van het uitgangskanaal, het debiet van de jet-eiwit versnelt ~ 100x en de tijden dat gebied worden berekend met eindige elementen analyse van de stroomlijnen (om het malen uitgezet in figuur 8). Deze versnelling levert een offset van ~ 1-2 ps na de snelheid constant wordt en kan meestal worden genegeerd in het meten van kinetiek veel trager dan mengen.
4. Representatieve resultaten
Figuur 6 toont een contourdiagram van de intensiteit in het gebied mengen gemeten door de fotonen. De achtergrond in de uitgang kanaal buitenkant van de jet moet dicht bij de ruisvloer van de detector te zijn en is meestal niet worden afgetrokken. Een hogere achtergrond kan aangeven slechte aanpassing of het eiwit vast aan de wand van het kanaal. Een straalvliegtuig dat ziet er geknikt of krom, vooral in de buurt het mengen regio, wijst op een slechte etsen van de sproeiers.
Figuur 7 toont de tijd opgeloste spectra van het eiwit acyl-enzym A-bindend eiwit (ACBP) gemerkt met Alexa 488 en Alexa 647. Deze gegevens zijn achtergrond afgetrokken van de donkere lading en laser-signaal te verwijderen. De achtergrond signaal werd genomen met het centrale kanaal druk op 0 PSI.
De mengtijd kan gemeten worden door een snelle reactie die veel sneller dan mengen zoals Trp fluorescentie quenching by KI of instorten van enkelstrengs DNA, voorzien FRET kleurstoffen, door toevoeging van NaCl. Omdat de jet kleiner is dan de optische resolutie van de microscoop, is er een grote intensiteit daling in de menginrichting regio de straal vormen. Dit instrument reactie kan worden verwijderd door een controlemeting waarin geen oplossing omstandigheden veranderen. Figuur 8 toont de verhouding van het mengen (in 400 mM KI) en niet-mengen experimenten N-acetyl tryptofaan amide fluorescentie. De lijn geeft de voorspelde concentratie van KI van COMSOL simulaties. De mengtijd, gemeten als de tijd dat de concentratie 80% verminderen, is 8 ps.
Aangezien de gegevens worden verzameld in 100 micrometer stappen langs de 500 pm lang afslag kanaal, moeten de gegevens worden geplakt samengesteld uit meerdere weergaven. Er zijn af en toe kleine offsets in signaal tussen deze opvattingen, waarschijnlijk het gevolg van kleine veranderingen in de focus als de chip wordt bewogen door de microscoop podium. Door de fase 80 tot 90um per-view, kunnen deze offsets worden geëlimineerd door het onderzoeken van overlappende data. Typisch worden verzameld ten minste twee stromen en de gegevens worden gecombineerd met elk signaal wijzigingen te bevestigen zijn vanwege werkelijke spectroscopische veranderingen in het eiwit, in plaats van optische effecten of stroom. Figuur 9 toont de FRET veranderingen in het eiwit ACBP na verdunning denatureringsmiddel van 6 M tot 0,06 M. Deze lijst heeft geen behoefte aan een controle-experiment omdat de FRET is al een verhouding en het instrument reactie is al verwijderd. De snelle sprong in de buurt van T = 0 staat voor een snelle verandering in FRET signaal binnen de mengtijd.
Figuur 1. Lay-out van het mengen regio gemeten met behulp van elektronenmicroscopie.
Figuur 2. Schematische voorstelling van hydrodynamische mengen met het vouwen van eiwitten te bestuderen. Het eiwit,opgelost in hoge denatureringsmiddel om het te ontvouwen, naar beneden stroomt het centrum kanaal naar de meng-regio waar het voldoet aan buffer stromen ~ 100 keer sneller. Laminaire stroming dwingt het eiwit stroom in een smalle straal van waaruit denatureringsmiddel moleculen kunnen zich snel verspreiden. Omdat de straal naar beneden stroomt de afrit kanaal, kan het eiwit worden waargenomen met een hoge ruimtelijke en tijdsresolutie met behulp van een confocale microscoop.
Figuur 3. Kwartsglas fabricage. 1) Het proces begint met een gepolijst 500 urn dikke fused silica substraat (a) met een laag polysilicium (poly) afgezet op de bovenste en onderste oppervlakken (b) en spin-coating een laag fotolak (c). 2) Een masker (e) wordt gebracht int o hard contact met de wafel en de fotolak wordt blootgesteld aan UV-licht (d). 3) De wafel wordt geplaatst in een ontwikkelaar bad en het patroon wordt geopenbaard in de fotolak. 4) De wafel wordt in een DRIE en de eigenschappen worden geëtst in de bovenste poly coating. De fotolak wordt dan verwijderd. 5) De poly fungeert dan als masker bij de wafer wordt in een oxide etser en de eigenschappen worden geëtst 10-40 pm in het kwartsglas substraat. 6) De poly coating wordt verwijderd in een XeF 2 etser. 7) de wafer wordt gebonden aan een offer glazen plaat met een warmte-geactiveerde afdichtmiddel (g) valt omlaag en een diamantboor (f) abrasief boren doorgaande gaten van de achterzijde. 8) Een oppervlak profiler (h) dan direct meet de geëtst functie diepte. 9) A 170 urn dikke gesmolten silica dekglaasje wafer is direct gebonden aan het bovenoppervlak van de plak. 10) De wafer wordt in blokjes gesneden in individuele microfluïdische chips.
3976/3976fig4.jpg "/>
Figuur 4. De mixer spruitstuk. De microfluïdische-chip is bevestigd aan de oplossing spruitstuk met een aluminium voorpaneel en vier o-ringen onder de ~ 200 pi reservoirs. Een groot gat wordt bewerkt door het midden van het spruitstuk direct boven het mengen gebied van de aangebrachte microfluïdische-chip, de overtollige UV licht om te ontsnappen zonder terugstrooiing, remmen een auto-fluorescentie van het spruitstuk zelf en waarbij directe belichting van de chip op het oog of camera voor de uitlijning. De lucht spruitstuk afdichtingen elk van de reservoirs, zodat de luchtdruk in elk kan worden via een uitwendige overdruk schakelkast.
Figuur 5. Schematische voorstelling van optische confocale microscoop.
Figuur 6. Contour plot van tryptofaanfluorescentie in de microfluïdische mixer. Het mengen gebied ligt in ~ 90 pm op de y-as.
Figuur 7. Tijdsafhankelijke tl-spectra verzameld binnen de mixer. De groene en rode rechthoeken geven de golflengtes die als donor en acceptor kanalen, respectievelijk.
Figuur 8. Mengtijd gemeten met behulp van fluorescentie quenching van tryptofaan door kaliumjodide (punten en rechts-as) en berekend door de eindige elementen analyse (lijn-en linker as).
Figuur 9. FRET veranderingen gemeten tijdens het plooien van het eiwit ACBP. De snelle stijging in de buurt van t = 0 staat voor een burst fase binnen de mengtijd en de langzamere stijging is een geleidelijke accumulatieAN structuur als het eiwit plooien. De data werd op twee verschillende snelheden en bedekt, waardoor verschillende dichtheden van metingen op verschillende tijdstippen.
Discussion
Snelle menging is een ontwikkeling doel voor het gebied van het vouwen van eiwitten voor vele jaren, omdat het is al lang bekend dat de moleculaire processen van biomoleculen na verloop van tijd schalen variërend van picoseconden tot seconden. Conventionele gestopt-flow mixers hebben dode tijden van 1-5 ms die vooral wordt beperkt door turbulentie. Turbulente continue stroom mixers met mengtijden van 30-300 ps zijn ontwikkeld in de afgelopen 15 jaar door een klein aantal groepen, maar vereisen over het algemeen hoge debieten om deze mengtijden te bereiken en daarom gebruik maken van veel van het monster 6-8.
Dit protocol beschrijft het gebruik van microfluïdische mengen chips snelle verdunning mogelijk in de laminaire stroming regime. Er zijn verschillende voordelen die binnen dit stelsel, maar primair men de mogelijkheid om het gehele mengproces met hoge nauwkeurigheid waarmee men wijzigen mengen reactie simuleren. T-mixers ontwikkeld door andere groepen met eenvoudige geometries gebleken mengtijden van 100-200 microseconden die voornamelijk zijn beperkt door de omvang van de kanalen 9-10. Door het schalen van de grootte van de kanalen 10 urn Knight verminderd mengtijd to ~ 10 microseconden 11. Yao en Bakajin toonde aan dat kleine veranderingen in de geometrie kan leiden tot aanzienlijke verbeteringen in de mengtijd 4. Maar dat werk is gebleken dat versnelling van het mengen kan ook leiden tot tragere fasen ook. Het ontwerp in dit werk 12-13 is een compromis tussen de twee beste ontwerpen in referentie 4 de langzamere exponentiele verval denatureringsmiddel concentratie ook minimaliseren en om de functie meer reproduceerbaar DRIE etsen.
Er is enige controverse het gebied van ultrasnelle mengen over de definitie van de mengtijd. Het is belangrijk te herkennen het verschil tussen "mengtijd" en "dode tijd". De dode tijd wordt bepaald in een turbulente mixer als de tijd waarin een METINGt kunnen worden gemaakt en in feite aanzienlijk langer dan de werkelijke mengtijd. Het is typisch bepaald door verschillende maten van een pseudo eerste orde bimoleculaire reactie (zoals quenching van fluorescentie van tryptofaan N bromosuccinate) bij verschillende concentraties. De waargenomen exponentiële vervalt zijn voorzien van naar elkaar toe in een enkele waarde uitgegaan van t = 0 s en de tijd tussen dat punt en het eerste gemeten punt is de dode tijd. Voor laminaire stroming mixers, kunnen metingen worden verricht tijdens het mengproces, zodat er geen dode tijd, alleen een mengtijd. De mengtijd bedraagt slechts de tot twee oplossingen te combineren tot voldoende homogeniteit bereikt. Wij hebben eerder gedefinieerde mengtijd een 90/10, de tijd voor de concentratie van denaturerende op 90% dalen tot 10% van de ongemengde waarde. De vorm van de curve mengen niet volledig symmetrisch met de staart van het verval met een exponentiële component. Bovendien eiwitvouwing eenniet-lineair afhankelijk denatureringsmiddel concentratie zodat vouwen kan beginnen vaak zelfs indien het denatureringsmiddel alleen verminderd tweeledig. Daarom hebben we sinds kort gedefinieerd de mengtijd als de tijd om de denatureringsmiddel concentratie te verminderen met 80%. Zeker andere definities kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de eisen van het experiment.
Het gebruik van deze mixer om het vouwen van eiwitten te bestuderen heeft steeds onthuld verrassende resultaten. Vouwen van cytochroom c en apomyoglobin al lang bestudeerd om meerdere inklapbare trap en de eerste resultaten te hebben met voortdurende stroom mixers toonde instorting voor te komen op de ~ 100 microseconden tijdschaal 10,14-15. De metingen met de mixer bleken er ten minste twee stappen dit tijdsbestek een zeer snelle, waarschijnlijk niet-specifieke, collaps (gemeten Trp fluorescentie spectrale shift) binnen de mengtijd van de menger, gevolgd door een tragere fase (zoals gemeten door de afkoeling van de totale emissie Trp) die waarschijnlijk de fEERSTE vorming van natieve structuur 5. We hebben ook waargenomen 50 ps proces in de B1 domein eiwit L, kantelen de conventionele interpretatie dat dit eiwit is een 2-state map 13.
Een voordeel van deze snelle mixer is dat het sonde het vouwen van de snelste vouwen eiwitten gewoonlijk slechts zijn meetbaar door nanoseconde T-sprong instrumenten. T-sprong vereist normaliter waarneming van vouwen / ontvouwen ontspanning bij de smelttemperatuur van het eiwit en dus nooit volgt het vouwen van de gehele populatie. Met deze mixer hebben we gekeken naar het vouwen van γ-repressor (λ 6-86) met zowel Trp totale emissie en spectrale verschuiving en hebben bewijs gevonden dat het eiwit geen belemmering voor vouwen onder sterke vouwen voorwaarden die niet toegankelijk waren naar de vorige T heeft -springen metingen 12. Tenslotte hebben wij gemeten vouwen van de zendspoel villin HP-35-tHij snelste mappen nog gemeten en vastgesteld dat de vouwen snelheid gemeten na het mengen is ~ 5 keer langzamer dan gemeten door T-sprong onder dezelfde voorwaarden 16. Dit suggereert dat vouwen kinetiek afhankelijk van de beginvoorwaarden, kantelen grote aanname in het veld.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door National Science Foundation glasvezelnet (NSF EF-0623664) en IDBR (NSF DBI-0754570). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële steun van National Science Foundation glasvezelnet Grant 0623664 beheerd door het Centrum voor Biofotonica, een NSF Wetenschap en Technologie Centrum, beheerd door de Universiteit van California, Davis, onder samenwerkingsovereenkomst PHY 0120999. Het onderzoek van Lisa Lapidus, Ph.D. wordt gedeeltelijk ondersteund door een Career Award op het Wetenschappelijk Interface van de Burroughs Welcome Fonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A.
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
