Summary
Descriviamo un saggio di fluorescenza giornalista per identificare rapidamente e caratterizzare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento.
Abstract
Pluripotenza e di auto-rinnovamento sono due caratteristiche che definiscono le cellule staminali embrionali (cellule ES). Comprendere il meccanismo molecolare agevolerà notevolmente l'uso di cellule staminali embrionali per gli studi di biologia dello sviluppo, modelli di malattia, scoperta di farmaci, e la medicina rigenerativa (recensione in 1,2).
Per velocizzare l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi regolatori di manutenzione delle cellule ES e di auto-rinnovamento, abbiamo sviluppato una fluorescenza giornalista-based test per misurare quantitativamente il self-renewal stato in cellule staminali embrionali di topo usando le cellule Oct4GiP 3. Le cellule Oct4GiP esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo della regione del promotore del gene Oct4 4,5. Oct4 è necessaria per cellule ES auto-rinnovamento, ed è altamente espressa nelle cellule ES e rapidamente down-regolato durante la differenziazione 6,7. Come risultato, l'espressione della GFP e fluorescenza nelle cellule del reporter correla fedelmentecon l'identità della cellula ES 5, e fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) analisi può essere utilizzato per monitorare attentamente la auto-rinnovamento stato delle celle a livello di singola cellula 3,8.
Accoppiato con RNAi, il saggio giornalista Oct4GiP può essere utilizzato per identificare rapidamente e studiare regolatori di manutenzione cellule ES e auto-rinnovamento 3,8. Rispetto ad altri metodi per saggiare auto-rinnovamento, è più conveniente, sensibile, quantitativa, e di costo inferiore. Essa può essere effettuata in 96 - o 384 pozzetti per studi su larga scala, quali ad alto rendimento schermi o analisi epistasi genetica. Infine, utilizzando altri lineage-specifici reporter di linee cellulari ES, il saggio qui descritte possono anche essere modificato per studiare il destino specifica durante la differenziazione delle cellule ES.
Protocol
1. Oct4GiP mouse cellule ES di manutenzione
Cellule Oct4GiP sono stati gentilmente forniti dal Dr. Austin Smith. Essi sono stati ricavati dai topi portatori di una 129/Ola Oct4-GFPiresPac transgene 4,5. Essi sono mantenuti in piastre rivestite con tessuti gelatina coltura nella più completa clonale ESGRO grado medio (Millipore), o nel mezzo M15: DMEM (Invitrogen) supplementato con 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x non aminoacidi essenziali (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), e 10 pM β-mercaptoetanolo.
- Ricoprire piastre con 0,1% di gelatina (Sigma) a temperatura ambiente per 30 minuti (0,1 ml soluzione di gelatina / cm 2).
- Oct4GiP cellule a piastre rivestite di gelatina in piastre a ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Dividere le celle ogni due giorni con tripsina 0,05%.
2. Transfection siRNA in cellule Oct4GiP
Il saggio giornalista Oct4GiP è più convenienTLY effettuata in gelatina rivestita con fondo piatto 96 - o 384 pozzetti (Corning o BD) in mezzo M15. La procedura generale è illustrato nella figura 1.
- siRNA-lipidi complessi assembly:
- Per la trasfezione in piastre da 96 pozzetti, assemblare siRNA-lipidi complessi a U-bottom piastre a 96 pozzetti.
- In ogni pozzetto, miscelare 10 microlitri OptiMEM (Invitrogen) e 0,3 pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 5 pmol siRNA al lipide-OptiMEM miscela e incubare per altri 15 minuti. Il siRNA: rapporto di lipidi è 100 pmol: 6UL.
- Trasferire i siRNA-lipidi complessi in OptiMEM dalla U-piastra inferiore alla gelatina-rivestito a fondo piatto piatto con una pipetta multicanale.
- Per la trasfezione in piastre da 384 pozzetti, preparare i siRNA-lipidi complessi che utilizzano 0,1 microlitri Lipofectamine 2000 e del 2 siRNA pmol OptiMEM in 10 microlitri.
Nota: la concentrazione finale di siRNAle trasfezioni è di 50 nM. Effettuare biologica 3-4 repliche per ogni trasfezione siRNA. Impostare miscele master dei siRNA-lipidi complessi della U-piastra inferiore e aliquota nel fondo piatto rivestito di gelatina piatto.
- Oct4GiP placcatura cella e trasfezione:
- Per la trasfezione in piastre da 96 pozzetti, raccogliere le cellule Oct4GiP e risospendere in mezzo fresco M15 a 9 x 10 4 cellule / ml.
- Aggiungere 100 pl della sospensione cellulare a ciascun pozzetto usando una pipetta multicanale.
- Mescolare la sospensione cellulare con le pre-aliquotati siRNA di lipidi complessi nel bene Pipette su e giù per 3-5 volte. Modificare suggerimenti per trasfezioni diversi siRNA.
- Per la trasfezione in piastre a 384 pozzetti, le cellule Oct4GiP risospendere a 6 x 10 4 cellule / ml e la sospensione cellulare aliquota 30 microlitri in ciascun pozzetto.
Nota: La densità ottimale placcatura cellulare è di solito 3 x 10 5 cellule / cm 2, ma may richiedono ulteriore ottimizzazione per i siRNA che drammaticamente influenzano la crescita delle cellule o la vitalità. Bassa densità di placcatura porterà alla sopravvivenza delle cellule poveri durante trasfezione. Alta densità di placcatura porterà a sfondo elevato a causa di elevata differenziazione confluenza cellulare indotta. Se necessario, placcatura densità prova tra 2-4 x 10 5 cellule / cm 2.
- Cambio medio:
- Rimuovere vecchio mezzo con multi-canale aspiratore (Corning) o il vuoto bacchetta (VP-scientifico). Fare attenzione a non graffiare le cellule nella parte inferiore delle piastre.
- Alimentare le cellule con mezzo fresco cellule ES (100 microlitri per piastra a 96 pozzetti e 30 microlitri per piastra a 384 pozzetti) usando pipetta multicanale ogni giorno.
3. FACS analisi
- Dissociazione cellulare:
- Quattro giorni dopo la transfezione, rimuovere media multi-canale con aspiratore (Corning) o il vuoto bacchetta (VP-scientifico).
- Per piastre a 96 pozzetti, lavare una volta con cellule 100μl PBS.
- Aggiungere 25 microlitri tripsina 0,25% ad ogni pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione occasionale, e ispezionare visivamente per garantire il completo distacco delle cellule.
- Aggiungere 90 microlitri di PBS con 10% FBS per inattivare la tripsina e dissociare cellule in una sospensione singola cella pipettando ripetuta.
- Per piastre a 384 pozzetti, dissociare le cellule con 10 microlitri tripsina e quench con 30 pl PBS con 10% FBS.
- FACS analisi:
- Analizzare la fluorescenza GFP sull'analizzatore BD LSRII FACS dotata dell'unità HTS o altro analizzatore analogamente dotato FACS (come Accuri o Intellicyt).
- Utilizzare la modalità high-throughput sul HTS e analizzare 10 microlitri di sospensione cellulare. Impostare la soglia conteggio a 1.0 x 10 4 cellule.
- Regolare la tensione di PMT e la soglia di catturare le cellule nella trama in avanti rispetto al side-scatter. Porta per la popolazione di cellule dal vivo nel DeviazioneARD vs side-scatter plot.
- Creare un grafico a istogramma per il canale GFP. Impostare la porta nel canale GFP in modo che circa il 10% delle cellule risultano GFP-negativi nelle cellule di controllo o finti-siRNA transfettate.
- Determinare sulla GFP-negativi cellule provenienti da ogni trattamento: le cellule differenziate sulla =% GFP-negativi cellule. Confronta le cellule sulla differenziate tra sperimentali-e control-siRNA trasfezioni con due code t-test, e segnare i successi positivi con valori di p <0.01.
4. Risultati rappresentativi
Oct4, Nanog, Sox2 e sono tre geni che giocano un ruolo critico nel mantenimento delle cellule ES auto-rinnovamento 6,7,9-11. La figura 2 mostra che il saggio giornalista Oct4GiP può facilmente rilevare la differenziazione causato da mettere a tacere questi fattori nel Oct4GiP cellule ES.
La figura 2A mostra le cellule staminali embrionali sono Oct4GiP GFP-positive quando mantenuti ES cellule. Figura 2B mostra la dispersione in avanti contro lato e l'istogramma del canale GFP delle cellule Oct4GiP trasfettate con il controllo o Oct4 di siRNA. E 'necessario cancello per le cellule vive nel grafico a dispersione in avanti rispetto a lato, come le cellule morte e detriti sono GFP-negativi e aumenterà sfondo. D'altra parte, doppietto discriminazione di escludere possibili grumi di cellule non è sempre necessaria. Nelle controllo siRNA cellule trasfettate, la stragrande maggioranza delle cellule deve essere GFP-positive. Se ovvie GFP-negativi popolazioni sono presenti nei pozzi di controllo siRNA trasfettate, le cellule Oct4GiP di partenza o la procedura di trasfezione può essere stata compromessa e il risultato non può essere interpretabile.
La figura 2C mostra il grafico a barre delle cellule sulla differenziate (cellule differenziate sulla =% cellule GFP-negativi) dal controllo-,-Oct4, Nanog-e Sox2-siRNA cellule trasfettate.
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Figura 1. Schema del saggio giornalista Oct4GiP.
Figura 2. Saggio giornalista Oct4GiP in grado di rilevare la differenziazione delle cellule ES causato da Nanog, Oct4, Sox2 e silenziamento. A) E14Tg2a (wild-type, linea nera) e Oct4GiP (linea verde), le cellule sono stati analizzati mediante FACS. Istogramma della GFP-canale dimostra che le cellule sono Oct4GiP GFP-positivi. B) Oct4GiP cellule sono state trasfettate in piastre da 96 pozzetti con il controllo-o-Oct4 siRNA e FACS analizzati 4 giorni dopo la trasfezione. Forward vs grafici a dispersione laterali e istogrammi della GFP-canale delle cellule trasfettate sono mostrate. C) Oct4GiP cellule sono state trasfettate con il controllo-,-Nanog, Oct4-, o-Sox2 siRNA. Le celle sulla dissociati è stata determinata dalla% GFP-negativo celle 4 giorni dopo la transfezione, ed è stata tracciata come media + / - errore standard della media (n = 4).f = target "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
Il saggio giornalista Oct4GiP abbiamo descritto sopra può misurare quantitativamente il grado di auto-rinnovamento vs differenziazione. Rispetto ad altri metodi disponibili, come la morfologia a base 12 e la proliferazione / vitalità saggi basati, offre maggiore sensibilità e velocità, nonché una misura più diretta dello stato della cellula ES. E 'quindi adatto per i grandi schermi e analisi epistasi genetica. In effetti, noi e altri hanno utilizzato con successo il saggio giornalista Oct4GiP per la genome-wide schermi RNAi 3,8. Come tutti i saggi, tuttavia, ha anche limitazioni. Può essere utilizzato solo per studiare geni che direttamente o indirettamente regolano Oct4 attività di promotore, e può falsamente identificare i geni che influenzano l'espressione della GFP, la stabilità, o funzione post-trascrizionale. Pertanto, saggi aggiuntivi o schermi secondarie, come la colorazione fosfatasi alcalina 13 (Millipore, SCR004) e colorazione per immunofluorescenza o quantitativa RT-PCR dei marcatori pluripotenziali 3,8,12,14 sono necessari per confermare i risultati ottenuti da questo metodo.
Il saggio si basa su giornalista Oct4GiP silenziamento genico efficiente. SiRNAs efficaci e trasfezioni siRNA efficienti sono la chiave per il successo del test. Anche se abbiamo descritto solo utilizzo del saggio reporter con trasfezioni siRNA, il saggio può essere eseguita anche con trasfezioni DNA di silenzio o esprimono molti geni di interesse. Trasfezione efficienza DNA è solitamente inferiore a quello di siRNA e può ridurre la resistenza del fenotipo.
Oltre a quanto descritto in questo protocollo, il saggio giornalista Oct4GiP può essere modificato per identificare e caratterizzare i geni che regolano negativamente auto-rinnovamento pure. In tal caso, le cellule possono essere trasfettate con siRNAs e coltivate in condizioni di differenziazione. Mettere a tacere di regolatori negativi di auto-rinnovo aumentare l'auto-rinnovamento e sostenere l'espressione della GFP, che può essere detected da FACS similmente a quanto descritto nel protocollo corrente.
Oltre cellule reporter Oct4GiP, altre linee cellulari del reporter utilizzando promotori specifici delle cellule ES, come Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) e Rex1-GFP 19 celle, sono anche stati generati. Possono anche essere usati per studiare cellula ES automantenimento e manutenzione utilizzando la stessa strategia. Tuttavia, poiché non vi è differenza notevole l'attività e la specificità di questi promotori di geni marcatori di cellule staminali embrionali, queste linee di cellule reporter di comportarsi in modo diverso in termini di livello di fondo e la sensibilità e in tal modo si completano a vicenda. Infine, utilizzando altri lineage-specifici reporter di linee cellulari staminali embrionali, la nostra strategia può essere modificato per studiare il destino-specifica delle cellule ES e facilitare l'uso di cellule ES come un modello in vitro per le prime fasi dello sviluppo dei mammiferi.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Brad Lackford per la lettura e la modifica del manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Research Programma intramurale Z01ES102745 (a GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
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