Summary
היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.
Protocol
1. פלייט תמונה הכנה
- INS1 התרבות התאים RPMI התקשורת המכילים 10% תקן בסרום שור עוברית, 1% לפניצילין, סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 5 מ"מ NaHCO 3, 2 HEPES מ"מ, חומצה pyruvic 2 מ"מ, ו 11 גלוקוז mM עד המפגש 80%.
- Trypsinize את בתרביות תאים INS1 עם טריפסין 0.05% ואת צלחת אותם על פולי-D-ליזין coverslip קרקעית צלחות מצופה הדמיה (מפגש 30-40%).
- לאפשר צלחות להגיע מפגש 60-80% (~ 2 ימים) ולהוסיף מטריקס המיטוכונדריה ממוקד (COXVIII) adenoviral PA-GFP של 24 שעות (משרד הפנים = 5). שערי המדיה המאפשרים לתאים לגדול עוד 2 ימים לפני הדמיה.
- ביום הדמיה, להוסיף 7-15 TMRE nM ללוחות הדמיה, וכן לאזן דקות לפחות 45.
- במהלך סיבוב הפעם חממה (השלב העליון החממה נעשה שימוש כאן) ולאפשר מיקרוסקופ כדי לאזן ל 37 מעלות צלזיוס במשך שעה בערך 1. הפעל CO 5% 2.
2. הדמיה פרמטרים של מיקרוסקופ LSM 710 Zeiss Confocal
- לאחר מיקרוסקופ יש equilibrated, בכרטיסייה רכישה, לחץ על "כלים להראות ידני", פתח הדמיה להקים הפאנל, ובחר "מצב הערוץ" ולעבור לעקוב אחר כל "מסגרת".
- בלוח נתיב האור, בחר LSM מצב הערוץ. עבודה מסמל את הדגימה כלפי מעלה, בחר "אחוריים", MBS 690 +, ו-MBS 488. בחלק התחתון של הפאנל, בחר "T-PMT" כדי לאפשר הדמיה של שדה בהיר או ערוץ DIC.
- סיום התאמת פרמטרים נתיב האור על ידי הגדרת טווח עבור צבע GFP כדי 490-540 ננומטר ל 580-700 ננומטר עבור צבע TMRE.
- במצב הרכישה, השתמש 512 × 512 פיקסלים סריקה שדה, 4x הממוצע, ולבחור גורם הזום (אשר מומלץ לשמור על עקביות לצורך כיול).
3. אופטימיזציה של פרמטרים הדמיה
- באמצעות תוכנית apochromat 100x (1.4 NA) העדשה אובייקטיבי, focלנו התאים באור הלוגן, לא אור ניאון, כדי להגן על המיטוכונדריה של phototoxicity.
- מסך PA-GFP להביע תאים באמצעות חריר פתוח מקסימאלי וסריקה למצוא את התאים שנמצאים ירוק בהיר יותר.
- מצא את ההספק הנמוכה ביותר של לייזר 2-פוטון צריך להפעיל את PA-GFP לייעל את הפרמטרים הדמיה להבטיח כי האות לא להרוות את הגלאי. בדוק את האות PA-GFP colocalizes עם האות TMRE עבור כמה Z-Series. איבוד אות TMRE מציין שלילת קוטביות phototoxicity המיטוכונדריאלי, או, ותאי מציג מאפיינים אלה לא אמור לשמש לניתוח.
- מצא את התא PA-GFP להביע ולציין גורם הזום.
- הגדר את טווח Z-Series לאסוף 6 פרוסות (טווח זה צריך לספק את כל 10 תאים מסוים, אלא אם כן Z-להתמקד נקבע כל עמדה).
- שמור את שיטת הדמיה עבור כל תא (תא 1, תא 2 וכו ').
4. התאם את אוטומציהפרשת ד 'של התוכנית וציין את 10 תאים האם תבואי עבור Assay 1 התוך מיטוכונדריאלי שעה אחת
- בפאנל השמאלי של חלון multitime, בחר את לוח "חיסכון", וציין את המיקום שבו הקבצים יישמרו.
- בלוח "רכישה", טען את שיטת הרכישה הציל לתא 1 בתצורת סריקה, וסמן את התיבה מחסנית z. גם לבחור "סימנה Z הבינוני של מחסנית Z".
- בלוח "בלוקים", בחר "בלוק אחד במקום אחד". לחץ על "בלוקים להוסיף" עבור מרווח זה כדי להימדד.
- בלוח "העיתוי", בחר "להמתין מרווח" והקלד "0" ב "מרווח ההמתנה לפני בלוק במקום הראשון בלבד". אבני 2-4 יהיה "15 דקות" בסעיף זה.
- בלוח הודעות, בחר "להעביר את המוקד לטעון עמדה בין מקומות" ו "עומס לסרוק config כאשר" לעבור לוק 'או' הבא loc "לחיצה. תחת" רשימת מקומות ערוך "בחר" לנקות את כל "ולאחר מכן לבחור" מספר רב של מקומות ממונע הבמה ".
- Undאה פאנל "Bleach", לחץ על התיבה "אקונומיקה", וציין את קובץ ההגדרות של "config" לנתץ התפריט, יועד בחלון הראשי של התוכנה. לאחר מכן, בחלון "הלבנה", שמור את השיטה photoactivation המתאים. בלוח אזורים, בחר את ההחזר על ההשקעה עבור תא מסוים, ולהוסיף את ההחזר על ההשקעה על מנת multitime על ידי בחירת "האזור הנוכחי להוסיף לרשימה את ההחזר על ההשקעה" חלון. הקפד לבחור את המיקום אותו "החזר השקעה" לנתץ התפריט.
לעיתוי לעבוד כראוי עבור כל תא יש מרווח 15 דקות, שתי שיטות צריך להישמר. ברשימת בלוקים, הראשון יהיה בתצורת "אמיתי" photoactivation, והשאר יהיו בתצורת "מדומה" שאינו עושה שימוש בלייזר שני הפוטונים. בלוק 1 יהיה גם לחסום רק שאין עיכוב (BKIntv = 0). לכן, השיטה מתחילה סריקה 1 הבסיס, ולאחר מכן סריקה photoactivation. שאר הבלוקים יש 900 שניות BkIntv, ובכל נקודת זמן יש שתי סריקות בדיוק כמו בכל פעם 0 שניות בלבד, כדי לשמור על עקביות העיתוי.
- עבור כל אחד 10 תאים להיות שלאחר לאורך זמן, לבצע את הרצף:
מצא PAGFP להביע תאים לשמירת שיטת ההדמיה שלה
מיקום לוח-לסמן את מיקום הבמה, ציין שיטת הדמיה
ראשי לוח-ROI לבחור אזור של אינטרס להיות בליץ photoactivated לוח-להציל את ההחזר על ההשקעה ספציפי גם לטעון אותו בתיבה ההחזר על ההשקעה:
למחוק את ההחזר על ההשקעה ולאפס זום סריקה עד 1
מצא את התא הבא להגדיר את הזום
חזור על התהליך עבור 9 תאים הבאות
בדוק כי כל מיקום הבמה את כל הלבנים יש את שיטת הדמיה המתאים (סריקה תצורה) קשורים. כמו כן לוודא כי בלוק 1 במיקום זה מתאים לשיטה photoactivation המתאים ואילו השאר מכילים שיטת "מדומה". לבסוף, בחר באפשרות "הפעל".
5. לנתח את עוצמת PA-GFP אותות
- ואז לייצא את הנתונים ל-Excel ולחשב את עוצמת הממוצע של Z-ערימות בכל נקודת זמן. מחק חלקים אופטיים שאין להם האות.
- למדוד את דילול האות בערימה-Z זה על ידי חישוב אחוז האות photoactivated המקורי.
כל נקודת נתונים נסרק והקליט פעמיים, וכתוצאה מכך המידע Z-מחסנית כפול עבור כל נקודה בזמן. בדוק את Z-מחסנית ערכים מסכים. אם לא, זה מעיד על בעיה (למשל, מוקד התנועה התא).
6. נציג תוצאות
כאשר האירוע מתרחש היתוך בין פעיל ולא פעיל PA-GFP mitochondrion, PAGFP בתוך המטריקס המיטוכונדריאלי מתערבב עם המטריצה הלא מסומן הופך מדולל על פני שטח גדול יותר, ולהקטין את האותעוצמת (איור 1 א). בתא INS1, ירידה משמעותית בעוצמת האות מתרחשת כל 15 דקות, עד איזון של היתוך המיטוכונדריה הושג (כ 1 שעה). ראוי לציין, כי תא איור 1B מציג colocalization כמעט שלם של PA-GFP אותות TMRE. ב מבחני אלה ריכוז נמוך מאוד של TMRE (15 ננומטר) משמש כדי לסייע למקד photoactivation של PAGFP, וגם כדי לפקח על בריאות התא. תאים עם שפע של המיטוכונדריה depolarized יהיה colocalization שלם של PAGFP ו TMRE ולא יש לנתח כי זה מציינת phototoxicity או תאים במצב גוסס.
זמן איזון היתוך המיטוכונדריה הוא בדרך כלל 1 שעות ב INS1 תאים, כאשר ~ 15% של נפח המיטוכונדריה מופעל. לפעמים, גם אם שטח קטן מואר, רוב המיטוכונדריה להיות photoactivated בשל היותו ברשת מאוד, ובמקרה זה היתוך נוספת קשה לזהות. סוגי תאים אחרים עשויים להפגין פעמים איזון שונים יש לבדוק במרווחי זמן קצרים יותר על פני תקופה ארוכה יותר כדי לאפיין את הדינמיקה המיטוכונדריה. כדי לעכב את היתוך המיטוכונדריה, תאים יכולים להיות ממוקמים בתוך סביבה lipotoxic. זה בעבר הראו כי 0.4 מ"מ palmitate שברי המיטוכונדריה, ומעכב היתוך המיטוכונדריה 9. השפעה זו ניתן לראות באיור 2, שבו המיטוכונדריה הם מקוטעת, אך את עוצמת האות של mtPAGFP לא משנה עד כמה בתנאים רגילים (איור 1). לפיכך, דילול של אות PA-GFP הוא ככל הנראה עקב היתוך המיטוכונדריה ולא ביקוע. ב סוגי תאים אחרים, מומלץ להשתמש בדרכים ידועות אחרות כדי להשרות הפיצול המיטוכונדריה, כגון להשתיק OPA1 אשר הכרחי היתוך המיטוכונדריה 14.
באיור 1. א PA-GFP הופך בהדרגה דימר בשל תופעות היתוך המיטוכונדריה המובילים דילול של החלבון על פני שטח גדל והולך כמו שניתן לראות את התמונות המוקרנות 6 חלקים אופטיים לכמת כל 15 דקות. ב TMRE עם PA-GFP מראה כי המיטוכונדריה פועלים ולא depolarized. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 2. היתוך מיטוכונדריאלי עכבות עם palmitate 0.4 מ"מ מפחית את דילול של PA-GFP. תחזיות א של 6 חלקים אופטיים מראה המיטוכונדריה קצר עם עוצמת האות משתנה עם הזמן. Colocalization ב 'של PA-GFP עם TMRE המיטוכונדריה מראה כי הם לא דהמקוטב. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Discussion
שיטה זו מאפשרת הדמיה של כ 10 תאים בכל פעם, אם הרכישה מתרחשת כל 15 דקות לאחר photoactivation. מספרם המדויק של תאים יהיה תלוי כמה מהר 1 הוא מסוגל לאתר ולסמן את התאים המבטאים mtPAGFP בתוך צלחת התרבות, וכמה מהר אפשר להגדיר את כל הפרמטרים תוכנה. כדי לבצע אוטומציה לפעול בצורה חלקה גם שכבת התאים יש להשתמש משום המיועדים Z-מחסנית שולי יחולו על כל התאים.
גודלו של אזור זה photoactivation הראשונית תנחה את הזמן איזון. כדי להיות מסוגלים למדוד היתוך המיטוכונדריה, חשוב photoactivate רק 10-20% של הרשת, כך התפשטות האות לשאר הרשת ניתן לפקח לאורך זמן. אם יותר מדי של הרשת הוא photoactivated, יתכן איחוי מלאה תתרחש מהר מדי, האירוע לא ליפול בפח.
במשנה זהירות יש לנקוטלהתאים את כוח לייזר לייזר של שני הפוטונים, כמו גם ריכוז TMRE להימנע phototoxicity שמוביל שלילת קוטביות המיטוכונדריה. להבטיח את האות mtPAGFP colocalizes עם האות TMRE יכול לעזור בהערכת phototoxicity ובריאות כללית תא 8,15. תאורה באור epifluoerescent יש להימנע. במהלך חיפוש בתאים המבטאים mtPAGFP, חריר צריך להיות פתוח מקסימאלי תוך סריקה באמצעות עירור צריכת חשמל נמוכה 488nm. התאמת כוח שני פוטונים לייזר photoactivate מספיק PA-GFP כדי למדוד את האות יותר משעה 1 אך לא oversaturate כל התאים יכול להיות מסובך 8. עם זאת, הפעם יש בילה בשלב זה אופטימיזציה, כי תוכנית אוטומטית פעם אחת הוא התחיל, זה מייגע לעצור את זה, לבחור תאים נוספים, וכן לחדש.
עבור בקרת איכות, רכישת בניגוד ההפרש התערבות (DIC) תמונה (או אור מסור) כדי לפקח על התמקדות התאים יכול להיות מאודמועיל גם דרך טובה לזהות בועות שנוצרו בשמן טבילה במהלך הסריקה, זה קורה לפעמים בין התנועות של הבמה.
אמנם בשיטה זו mtPAGFP אוסף נתונים על תנועה חד כיווני של חלבונים מטריקס המיטוכונדריה של המיטוכונדריה photoactivated לאלה שאינם מסומנים, מתקבל על הדעת להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד תהליכים אחרים. לדוגמה, fluorochromes מסוימים ניתן לחבר חלבונים בממברנה לצפות התנועה הספציפי שלהם במהלך האירועים היתוך, כפי שהוכח על ABC-ME, שילוב של המתרחש על הזמן בקנה מידה שונה ערבוב של חלבונים מסיסים מטריקס 15.
Disclosures
הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Zeiss, Inc
Acknowledgments
אנו מודים מרכז טאפטס למדעי המוח המחקר, p30 NS047243 (ג'קסון), מחקר המיטוכונדריה זיקה שיתופית (mtARC) נתמך על ידי מרכז אוונס למחקר ביו הבינתחומי באוניברסיטת בוסטון רפואי קמפוס, רפואה Corporation קישור ולאחר Zeiss לתמיכה העבודה הזאת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COXIII-adenoviral PA-GFP | Dr. Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocal | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
- Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
- Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
- Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
- Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
- Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
- Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
- Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
- Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
- Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100 (2011).
- Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
- Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
- Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
- Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
- Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
- Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).
