Summary
हम ovalbumin प्रेरित एलर्जी airway सूजन की सेटिंग में ovalbumin के जवाब में परिपक्वता और फेफड़े के वृक्ष के समान कोशिकाओं के प्रवास पर नजर रखने के लिए एक रणनीति का वर्णन. इस रणनीति के संक्रमण की सेटिंग में फेफड़े के वृक्ष के समान कोशिकाओं के प्रवास का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Abstract
वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) कुंजी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के द्वारा अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा में शामिल खिलाड़ी हैं. DCs को स्थिर अवस्था में परिधि के ऊतकों में मौजूद हैं, लेकिन प्रतिजन उत्तेजना के जवाब में DCs प्रतिजन ले और तेजी से draining लिम्फ नोड्स जहां वे प्रतिजन 1,2 के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए ओर पलायन. इसके अतिरिक्त, DCs भी रूप में अच्छी तरह के रूप में autoimmune एलर्जी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3 की शुरुआत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं.
DCs और फेफड़ों 4 पर्यावरण की सेटिंग में सहिष्णुता के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरण के दोनों दीक्षा में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं. फेफड़ों के वातावरण काफी हद तक tolerogenic, पर्यावरण 5 प्रतिजनों के विशाल सरणी के लिए जोखिम के कारण है. हालांकि, कुछ व्यक्तियों में सहिष्णुता में एक को तोड़ने, जो एलर्जी और अस्थमा की प्रेरण की ओर जाता है. इस अध्ययन में, हम एक रणनीति है, जो airway के डीसी परिपक्वता और मिग की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णनसंवेदीकरण के लिए इस्तेमाल किया प्रतिजन के जवाब में राशन. airway के डीसी परिपक्वता और प्रवास की माप की airway एलर्जी सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स के दौरान मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और भी अंतर्निहित तंत्र के साथ साथ बाद में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की भयावहता को समझने में मदद करता है.
हमारी रणनीति एक संवेदनशील एजेंट के रूप में ovalbumin के उपयोग पर आधारित है. Ovalbumin प्रेरित एलर्जी अस्थमा एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया airway के eosinophilia, फेफड़े सूजन और ऊंचा IgE 6,7 अस्थमा के दौरान पाया स्तर को पुन: पेश करने के लिए मॉडल है. संवेदीकरण के बाद, चूहों FITC लेबल ovalbumin intranasal वितरण, जो airway के जो तेज ovalbumin DCs के विशिष्ट लेबलिंग के लिए अनुमति देता है के द्वारा चुनौती दी है. अगला, कई डीसी विशिष्ट मार्कर का उपयोग करते हुए, हम इन DCs की परिपक्वता का आकलन और भी draining के लिम्फ नोड्स के लिए अपने प्रवास कर सकते हैं प्रवाह cytometry को रोजगार से आकलन कर सकते हैं.
Protocol
1. Ovalbumin साथ चूहे की संवेदीकरण
- ओवीए (ग्रेड वी, सिग्मा, एमओ) की एक समाधान तैयार बाँझ पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में (समाधान -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है).
- आदेश में ओवीए - फिटकिरी मिश्रण तैयार करने के लिए, एक ट्यूब में फिटकिरी ले और जोड़ने ओवीए एक dropwise फैशन में समाधान जबकि 1:1 के अनुपात में ट्यूब vortexing. 30 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ और सही मिश्रण के बाद दूर का उपयोग करें.
- 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, माउस peritoneal गह्वर में मिश्रण का 0.2 मिलीग्राम इंजेक्षन और इंजेक्शन 2 सप्ताह के बाद फिर से दोहराने.
2. FITC लेबल Ovalbumin साथ चूहे की intranasal चैलेंज
- ओवीए - फिटकिरी के दूसरे इंजेक्शन के बाद 7 दिन, चूहों intranasally ओवीए FITC साथ चुनौती दी जा करने के लिए तैयार हैं.
- ओवीए FITC (सिग्मा) के 1 मिलीग्राम / एमएल और aliquots में दुकान की एकाग्रता में एक समाधान -80 पर बाँझ पीबीएस डिग्री सेल्सियस का प्रयोग कर तैयार
- एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब के तल पर और एक रासायनिक घंटे में एक बाँझ धुंध के प्लेसood, धुंध पर Aerrane की 5 मिलीलीटर जोड़ें. आदेश में चूहों को चतनाशून्य करना करने के लिए, लगभग 5-10 सेकंड के लिए ट्यूब में पशु प्रत्यक्ष.
- एक ईमानदार स्थिति में है और बाँझ विंदुक युक्तियाँ, पिपेट एक ड्रॉप वार फैशन में ओवीए FITC चूहों की nares के समाधान पर की 100 μl का उपयोग संवेदनाहृत पशु पकड़ो.
- ओवीए FITC साथ अगले दो दिनों के लिए intranasal चुनौती दोहराएँ.
3. फेफड़े से एकल कोशिका निलंबन और draining लिम्फ नोड्स की तैयारी
- Euthanyl की intraperitoneal इंजेक्शन का प्रयोग चूहों बलिदान.
- आदेश में बृहतभक्षककोशिका संदूषण, जो डीसी विश्लेषण जटिल हो सकता है कम करने के लिए की, फेफड़ों के पानी से धोना किया जाता है. फेफड़ों को पानी से धोना, माउस tracheas संक्षिप्त और उजागर कर रहे हैं cannulated एक कैथेटर और एक सिरिंज के साथ, 5 मिमी EDTA के साथ बहुत ठंडा पीबीएस का उपयोग, कम श्वसन पथ 3 बार वायुकोशीय रिक्त स्थान से कोशिकाओं को हटाने से rinsed है.
- पीबीएस की 10 मिलीलीटर 10 यू / मिलीलीटर hepar है युक्त के साथ फेफड़ों छिड़कनादिल की सही वेंट्रिकल के माध्यम से, वाहिका संरचना से फेफड़ों की रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए. प्रदर्शन करना perfusions तक फेफड़ों, सफेद रक्त कोशिकाओं की सबसे हटाने के संकेत बारी. परिधीय रक्त से contaminating के कोशिकाओं को हटाने के लिए यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
- फेफड़ों काटना और mediastinal लिम्फ नोड्स (mln) को हटाने और एक अलग पकवान में लिम्फ नोड्स जगह है. (ऊतकों का जोखिम FITC प्रतिदीप्ति के शमन को रोकने के प्रकाश को कम करने की कोशिश करें.)
- एक पेट्री डिश पर फेफड़ों प्लेस और कैंची का उपयोग क़ीमा. अगले 37 में 25 मिनट के लिए फेफड़ों ° अगले 5 मिनट के लिए 250 / यू में मिलीलीटर Collagenase डी (Roche) और जोड़ने EDTA (10 मिमी अंतिम एकाग्रता) का उपयोग Collagenase गतिविधि को रोकने के सी. पचाने में
- एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पचा फेफड़ों के टुकड़े दर्रे और hypotonic सेल करने के लिए एरिथ्रोसाइट्स हटाने. एकल कक्ष निलंबन DCs के आगे के विश्लेषण के लिए तैयार है.
- आदेश में mln, टी से एक सेल निलंबन तैयार करने के लिएCollagenase साथ ठीक सुई और पचाने का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित एक सेल झरनी के माध्यम से तनाव के बाद mln कम.
4. डीसी के लिए धुंधला हो जाना / परिपक्वता प्रवास आकलन मार्करों
- आदेश में फेफड़ों में DCs की पहचान करने के लिए, धुंधला CD11c और CD11b के लिए किया जाता है. इसके अलावा करने के लिए परिपक्वता के लिए आकलन, धुंधला CD86 और CD80, जो के रूप में DCs परिपक्वता से गुजरना upregulated कर रहे हैं के लिए किया जाता है. CD11c + CD11b mln में ओवीए - FITC + कोशिकाओं फुफ्फुसीय फेफड़ों से ओवीए airway के चुनौती के जवाब में mln पलायन DCs के रूप में पहचाने जाते हैं.
- X 10 10 6 कोशिकाओं / FACS बफर में मिलीलीटर (1% FBS और 1mm EDTA के साथ पीबीएस) और अशेष भाजक सेल / FACS धुंधला के लिए निलंबन ट्यूब की 150 μl की एकाग्रता में कोशिकाओं को निलंबित करें. फेफड़ों के DCs की पहचान के लिए, निम्नलिखित दाग की जरूरत है: बेदाग नियंत्रण (उजागर ओवीए - FITC नहीं चूहों से फेफड़ों की कोशिकाओं), नियंत्रण ओवीए - FITC CD11c एकल नियंत्रण, CD11b एकल नियंत्रण, CD11b+ + + डबल नियंत्रण CD11c, CD11b + ओवीए - FITC + डबल नियंत्रण, नियंत्रण CD11c + ओवीए - FITC + डबल, MHC द्वितीय एकल नियंत्रण, CD86 एकल नियंत्रण, CD80 एकल नियंत्रण और नमूने ओवीए - FITC + CD11c + CD11b + MHCII के लिए दाग + ओवीए - FITC + CD11c + CD11b CD86 + + और ओवीए - FITC + CD11c + CD11b CD80 + +.
- डीसी प्रवास का आकलन करने के लिए, mln से एकल कक्ष निलंबन की पूर्ण कोशिकाओं की गिनती करने और बाद में निम्नलिखित ट्यूबों तैयार: बेदाग नियंत्रण (mln चूहों उजागर ओवीए - FITC नहीं से कोशिकाओं), ओवीए - FITC नियंत्रण, CD11c + एकल नियंत्रण, CD11b + डबल नियंत्रण, CD11b + ओवीए - FITC + डबल नियंत्रण, CD11c + ओवीए - FITC + डबल नियंत्रण और CD11c + CD11b + ओवीए FITC से अधिक नमूने.
5. प्रतिनिधि परिणाम
समय intraperitoneal संवेदीकरण के लिए आवश्यक अंक करने के लिए airway एलर्जी सूजन प्रेरित महत्वपूर्ण है और किया जाना चाहिए के रूप में चित्र 1 में दर्शाया है. Intraperitoneal संवेदीकरण और airway ओवीए चुनौती के बाद, की airway एलर्जी सूजन के शामिल होने की पुष्टि की, कुछ चूहों और बलिदान किया जा सकता है ऊतकीय विश्लेषण फेफड़ों वर्गों पर किया जा सकता है के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. Hematoxylin और लाल भामसान रंग दाग भड़काऊ कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि की जा सकता है (2A चित्रा) और बलगम उत्पादन की उपस्थिति समय - समय पर एसिड शिफ़ दाग (चित्र 2 बी) के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. कुल मिलाकर इस ओवीए - अवगत 8 चूहों के ओवीए चुनौती के बाद की airway एलर्जी सूजन के शामिल होने की पुष्टि करेगा. इसके विपरीत, खारा इलाज चूहों से फेफड़ों के वर्गों के लिए किसी भी बलगम उत्पादन के अभाव के साथ साथ किसी भी सूजन से मुक्त होने की उम्मीद कर रहे हैं. इसके अलावा, निम्नलिखित ओवीए चुनौती, फेफड़े DCs unde RGO परिपक्वता और draining के लिम्फ नोड्स के बाद प्रवास. CD11c + कोशिकाओं अवगत है और ओवीए के साथ चुनौती दी चूहों से mediastinal लिम्फ नोड्स (mln) में विश्लेषण CD11c + कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात खारा इलाज चूहों (चित्रा 3A) की तुलना में दिखाने के लिए उम्मीद है. इसके अलावा, CD11c CD11b की पूर्ण सेल गिनती का विश्लेषण + ओवीए - FITC ओवीए अवगत और चुनौती दी चूहों के mln में कोशिकाओं, एक महत्वपूर्ण उच्च दिखाने (यानी कई गुना अधिक) गिनती उम्मीद है कि खारा इलाज (चूहों से समकक्षों 3B चित्रा).
चित्रा 1 ovalbumin की प्रेरण (OVA) प्रेरित, FITC ovalbumin लेबल (OVA FITC) के साथ airway चुनौती के साथ साथ चूहों में एलर्जी airway सूजन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल.
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चित्रा 2. ओवीए ओवीए airway चुनौती से पीछा संवेदीकरण airway के फेफड़ों (ए) में दिखाया गया वर्गों के Hematoxylin और लाल भामसान रंग धुंधला द्वारा पहचान के रूप में एलर्जी सूजन के शामिल होने के लिए होता है और भी वायुमार्ग में बलगम उत्पादन के रूप में फेफड़ों के आवधिक एसिड शिफ़ धुंधला द्वारा की पहचान की जाती है (बी) में दिखाया वर्गों के रूप में.
चित्रा 3 ओवीए FITC चुनौती डीसी फेफड़ों से mediastinal लिम्फ नोड्स (mln) प्रवास लाती. (ए) प्रवाह cytometry भूखंडों नियंत्रण या ओवीए अवगत चूहों की mln में CD11c + कोशिकाओं का अनुपात चित्रण. (बी) CD11c + CD11b खारा या ओवीए अवगत चूहों के mln में ओवीए - FITC + कोशिकाओं के निरपेक्ष मायने रखता है. * पी <0.05. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
यहां प्रस्तुत विधि फेफड़े DCs, ओवीए - FITC की airway के चुनौती के लिए वितरण पर आधारित विश्लेषण के लिए एक प्रवाह cytometry आधारित दृष्टिकोण प्रदान करता है. यह फेफड़े DCs, जो ले ओवीए FITC और इसलिए डीसी आबादी है, जो निगरानी कर रहे हैं प्रभावी ढंग से कर रहे हैं कि लोगों को airway के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में ओवीए प्रेरित एलर्जी airway सूजन के दौरान भाग ले रहे हैं चयनात्मक निगरानी के लिए अनुमति देता है. नियंत्रण चूहों में एलर्जी airway सूजन की अनुपस्थिति में, प्रवासी DCs की संख्या (OVA - FITC DCs +) mln में पहचान डीसी प्रवास के बेसल दर है जो एलर्जी की airway सूजन में उल्लेखनीय वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप के जवाब में से accelerates का संकेत कर रहे हैं ओवीए FITC mln + DCs का पूर्ण गिनती. वर्णित रणनीति, है परंपरागत / immunohistochemical Immunostaining है आधारित दृष्टिकोण से अधिक लाभ प्रदान करता है क्योंकि कम समय अवधि में विश्लेषण बाहर ले सकते हैं और दक्षता / संवेदनशीलता बहुत अधिक है. इसलिए यह ई हैqually करने के लिए सुनिश्चित करें कि उचित नियंत्रण तरीकों में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry विश्लेषण के दौरान कार्यरत हैं के लिए महत्वपूर्ण है. एक अन्य पैरामीटर है कि परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं फेफड़ों से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी है. इसलिए देखभाल करने के लिए ऊतक के महत्वपूर्ण जोखिम के प्रकाश के लिए यह ओवीए - FITC और देखभाल की प्रतिदीप्ति को प्रभावित कर सकते हैं रोकने के लिए लिया जाना चाहिए के ऊपर पाचन के लिए फेफड़ों के enzymatic पाचन के दौरान भी लिया जाना चाहिए कोशिकाओं पर सतह मार्कर की दरार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो, बहाव विश्लेषण को प्रभावित करेगा. वायुकोशीय मैक्रोफेज और DCs सतह मार्कर, जो आगे फेफड़े डीसी 9 आबादी के विश्लेषण पेचीदा के समान सेट का हिस्सा हैं. इसलिए यह फेफड़ों Lavage वायुकोशीय मैक्रोफेज जो डीसी विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटाने के लिए महत्वपूर्ण है.
एलर्जी airway सूजन के दौरान फेफड़े के डीसी प्रवास के विश्लेषण के अलावा, वर्णित पद्धति संभावित अन्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन संशोधित कर सकते हैंtigens, जिससे विशिष्ट एंटीजन एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल किया जा सकता है और intranasally दिया. बाद में इसी तरह विश्लेषण के रूप में ऊपर वर्णित किया जा सकता है फेफड़े डीसी जवाब का आकलन है. मामलों में जहां प्रतिजन लेबल नहीं किया जा सकता है, कुछ प्रतिजन प्रसव, FITC dextran या CFSE के से पहले घंटे, चूहों के लिए दिया जा सकता है. बाद में, प्रतिजन प्रसव के बाद, विश्लेषण से बाहर किया जा सकता है FITC dextran या mln है, जो विशिष्ट प्रतिजन 10,11 के साथ टीका के बाद फेफड़े डीसी प्रवास के कैनेटीक्स का संकेत करने के लिए DCs लेबल CFSE के प्रवास पर नजर रखने के. हमारे पिछले काम में, हम इस रणनीति adenoviral जीन थेरेपी 10 वैक्टर प्रसव के लिए प्रतिक्रिया में परिपक्वता / फेफड़े DCs के प्रवास का आकलन कार्यरत है. चूंकि DCs phagocytic, फेफड़े DCs, जो तब प्रवाह cytometry द्वारा नजर रखी जा सकता है के द्वारा FITC Dextran परिणामों में तेजी से तेज की intranasal वितरण कर रहे हैं. मामलों में, जहां फेफड़े plasmacytoid DCs की निगरानी वांछित है, CFSE emplo होना चाहिएyed बाद से plasmacytoid DCs FITC Dextran तेज के रूप में कुशलतापूर्वक अन्य फेफड़े डीसी सबसेट 10 नहीं है.
कुल मिलाकर, वर्णित रणनीति अन्य परंपरागत दृष्टिकोण से अधिक लाभ प्रदान करता है के लिए यह airway सूजन के दौरान फेफड़े डीसी परिपक्वता / प्रवास के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम के CIHR और सीएफ़ डॉ. जिम हू कनाडा अनुदान और पीएचडी छात्रवृत्ति सीएफ़ कनाडा राहुल कुशवाह द्वारा सम्मानित किया गया द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Alum | Thermo Scientific | 77161 | |
| OVA-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Antibodies | e-Bioscience |
References
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