알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

Summary

우리는 ovalbumin 유도된 알레르기기도 염증의 설정에서 ovalbumin에 대한 응답으로 폐 돌기 세포의 성숙 및 마이 그 레이션을 모니터링하는 전략을 설명합니다. 이 전략은 감염의 설정에서 폐 돌기 세포의 이주를 평가하기 위해 수정할 수 있습니다.

Abstract

돌기 세포 (DC가)는 항원에 특정한 T 세포를 활성화하여 적응 면역 반응의 개시에 관여 핵심 선수입니다. DC가가 안정된 상태에서 말초 조직에 존재 있지만 항원 자극에 대한 응답으로, DC가이 항원을 가지고 급속하게 그들이 항원에 대한 T 세포 ^1,2 응답을 시작 배수 림프절로 마이 그 레이션. 또한 DC가 또한자가 면역 질환뿐만 아니라 알레르기 면역 반응 ³ 시작에서 핵심 역할을한다.

DC가이 폐 환경 ⁴ 설정에서 관용의 면역 반응과 유도의 두 개시에 필수적인 역할을한다. 폐 환경은 환경 항원 ^5의 광대한 배열과 노출로 인하여, 크게 tolerogenic입니다. 그러나 어떤 사람은 알레르기와 천식의 유도로 연결 오차의 휴식,있다. 본 연구에서 우리는기도의 DC 성숙과 미그을 모니터링하는 데 사용할 수있는 전략을 설명sensitization에 사용되는 항원에 대한 반응으로 배급. 기도의 DC 성숙 및 마이 그 레이션의 측정은기도 알레르기 염증시 면역 반응의 동력학의 평가를 허용하며 기본 메커니즘과 함께 이후의 면역 반응의 정도를 이해하는데 도움이됩니다.

우리의 전략 sensitizing 대리인으로 ovalbumin의 사용을 기반으로합니다. Ovalbumin 유도된 알레르 기성 천식은기도 eosinophilia, 폐의 염증과 천식 ^6,7 중 발견된 상승된 IGE 수준을 재현하기 위해 널리 사용되는 모델입니다. sensitization 후, 마우스는 이해의 ovalbumin기도 DC가 특정 라벨링을 허용 FITC 분류 ovalbumin의 비강 전달에 의해 도전을하고 있습니다. 다음으로 여러 DC 특정 마커를 사용하여, 우리는 이러한 DC가의 성숙을 평가할 수 있으며 유동세포계측법를 채용하여 배수 림프절 자신의 마이 그 레이션을 평가할 수 있습니다.

Protocol

1. Ovalbumin으로 마우스의 Sensitization

1. OVA (학년 V, 시그마, MO)의 솔루션을 준비 한 MG / ML의 농도에서 멸균 PBS에서 (솔루션은 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.)
2. OVA-명반 혼합물을 준비하기 위해 튜브에서 명반을 가지고 1시 1분의 비율로 튜브를 vortexing하면서 dropwise 패션 OVA 솔루션을 추가합니다. 30 분간 혼합 저어과 믹싱 후 바로 사용하십시오.
3. 1 ML의 주사기를 사용하여, 마우스 복막 캐비티로 혼합물의 0.2 ML 주사 2 주 후에 다시 주사를 반복합니다.

2. FITC 라벨 Ovalbumin와 마우스의 비강 도전

1. OVA-명반의 두 번째 주사 후 칠일은 마우스 OVA-FITC와 intranasally 도전을받을 준비가 된 것입니다.
2. -80에서 1 밀리그램 / ML 및 aliquots의 저장소의 농도에서 멸균 PBS를 사용 OVA-FITC (시그마)의 솔루션 ° C를 준비
3. 50 ML 팔콘 튜브의 하단과 화학 H의 멸균 거즈를 놓으십시오ood는 거즈에 Aerrane의 5 ML에 추가합니다. 생쥐를 마취하기 위해, 약 5-10초위한 튜브로 동물을 직접.
4. 직립 자세 및 멸균 피펫 팁, 드롭 현명한 패션의 생쥐의 nares 진입 OVA-FITC 솔루션의 피펫 100 μl를 사용하여 anesthetized 동물을 잡아.
5. 앞으로 이틀 동안 OVA-FITC와 비강 도전을 반복합니다.

3. 단일 세포 폐로부터 정학 및 배수 림프절의 작성

1. Euthanyl의 intraperitoneal 주사를 이용하여 생쥐를 희생.
2. 직류 분석을 복잡 수있는 대식 세포 오염을 줄이기 위해, 폐 세척이 수행됩니다. 폐를 세척하려면 마우스 tracheas는 잠시 카테터와 주사기로 노출되어 cannulated하고, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 더 낮은 호흡 기관을이 폐포 공간에서 세포를 제거하는 3 번 씻어서있다.
3. 10 U / ML hepar를 포함하는 PBS의 10 ML과 폐가 Perfuse심장의 우심실 통해에서 폐 vasculature에서 혈액 세포를 제거합니다. 폐 혈액 세포의 대부분의 제거는 지표로, 흰색으로 바뀝니다까지 perfusions을 수행합니다. 이것은 말초 혈액의 오염 세포를 제거하려면 특히 중요합니다.
4. 폐를 해부하고 mediastinal 림프절 (MLN)를 제거하고 별도의 접시에있는 림프절을 넣으십시오. (FITC 형광 반응의 담금질을 방지하기 위해 나가기 위해서 조직의 노출을 최소화하기 위해보십시오.)
5. 배양 접시에 폐를 놓고 가위를 사용하여 말하다. 다음 37 25 분 동안 폐가 소화 ° collagenase 활동을 중지하려면 다음 5 분 동안 250 U / ML Collagenase D (로슈)와 추가 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10 MM 최종 농도)를 사용하여 C #.
6. 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 소화 폐의 조각을 통과하고 적혈구를 제거하는 hypotonic 용해를 수행합니다. 단일 세포 현탁액은 DC가의 자세한 분석을위한 준비가되었습니다.
7. MLN, T에서 단일 세포 현탁액을 준비하기 위해서는셀 스트레이너를 통해 긴장이어서 위에서 설명한대로 collagenase와 미세 바늘 및 다이제스트를 사용하여 MLN를 완화.

4. DC위한 염색법은 성숙 / 마이 그 레이션을 평가하기 위해 마커

1. 폐의 DC가를 파악하기 위해, 염색법는 CD11c 및 CD11b에 대해 수행됩니다. 또한 성숙을위한 평가, 염색법은 DC가가 성숙을 받다으로 upregulated되는 CD86과 CD80를 위해 수행됩니다. MLN에서 CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^{+ 세포는} 허파로부터 OVA기도 도전에 대응 MLN로 마이 그 레이션 폐 DC가로 식별됩니다.
2. 10 × 10 ⁶ 세포 / ML FACS 버퍼에 (1 % FBS 및 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS)와 FACS의 염색법에 대한 세포 현탁액 / 관 나누어지는 150 μl의 농도에서 세포를 일시 중지합니다. 폐 DC가의 확인 내용은 다음과 같은 얼룩이 필요합니다 : 흠없는 제어 (OVA-FITC에 노출되지 생쥐의 폐 세포), OVA-FITC 제어, CD11c 단일 제어, CD11b 단일 제어, CD11b⁺ CD11c ⁺ 이중 제어, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ 이중 제어, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ 이중 제어, MHC II OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ MHCII에 대해 묻다 단일 제어, CD86 단일 제어, CD80 단일 제어 및 샘플 ⁺ , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ 및 OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. , DC 마이 그 레이션을 평가 MLN에서 단일 세포 현탁액의 절대 셀 계산을 수행하고 이후에 다음과 같은 튜브를 준비하려면 : CD11c 흠없는 제어 (OVA-FITC에 노출되지 생쥐에서 MLN 세포), OVA-FITC 제어, ⁺ 단일 제어, CD11b를 ⁺ 이중 제어, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ 이중 제어, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ 이중 제어 및 CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^{+ 샘플.}

5. 대표 결과

기도 알레르기 염증을 유발해서 intraperitoneal sensitization에 필요한 시간은 지점이 중요하며 그림 1에 묘사된대로 실시해야합니다. 기도 알레르기 염증의 유도를 확인하기 위해 intraperitoneal sensitization과기도 OVA의 도전을 이어, 일부 쥐들이 희생 수 있으며 그림 2와 같이 histological 분석은 폐 섹션에서 수행 할 수 있습니다. 염증성 세포의 존재는 Hematoxylin & Eosin 얼룩으로 확인하실 수 있습니다 (그림 2A) 및 점액 생산의 존재는 정기 - 산 - 쉬프 얼룩 (그림 2B)로 평가됩니다. 다 합해서 이것이 OVA-sensitized 생쥐 ⁸ OVA 도전에 따라 알레르기기도 염증의 유도를 확인합니다. 반대로, 염분 취급 생쥐의 폐 부분은 어떤 점액 생산의 부재와 함께 염증 무료 것으로 예상된다. 또한 다음 OVA 도전, 폐 DC가 unde rgo의 성숙과 배수 림프절에 대한 후속 마이 그 레이션. sensitized 및 OVA 맡고 생쥐에서 mediastinal 림프절 (MLN)에서 CD11c ⁺ 세포의 분석은 식염수 - 취급 생쥐 (그림 3A)에 비해 CD11c ⁺ 세포의 높은 비율을 보여주 것으로 예상된다. 또한, CD11c ⁺ CD11b의 절대 셀 카운트의 분석 OVA-sensitized과 도전 생쥐의 MLN에서 ⁺ OVA-FITC ⁺ 세포 (몇 배 더 높은 IE) 상당히 높은 수를 보여주 것으로 예상되는 염분 처리된 생쥐 (의 대응 그림 3B).

그림 1. ovalbumin의 유도 (OVA) FITC 라벨이 ovalbumin (OVA-FITC)와기도 도전과 함께 생쥐에서 유도된 알레르기기도 염증에 대한 실험적 프로토콜.

fig2.jpg "/>
OVA기도 도전 다음에 그림 2. OVA sensitization은 ()에 표시 폐 섹션 Hematoxylin & Eosin 염색법에 의해 식별과 같은기도 알레르기 염증의 유도에 이르게하고 또한 폐의 정기 산성 쉬프의 염색법으로 식별기도의 점액 생산에 이르게 (B)와 같이 섹션.

그림 3. OVA-FITC 도전은 허파에서 mediastinal 림프절 (MLN)에 직류 마이 그 레이션을 유도합니다. () 유동세포계측법의 플롯은 컨트롤이나 OVA-sensitized 생쥐의 MLN에서 CD11c ⁺ 세포의 비율을 묘사. (B) 염분이나 OVA-sensitized 생쥐의 MLN에서 CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^{+ 세포의} 절대 건의. * P <0.05. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

Discussion

여기에 제시된 방법은기도 도전 OVA-FITC의 제공을 바탕으로 폐 DC가를 분석하기위한 유동세포계측법 기반 접근 방식을 제공합니다. 이것은 OVA-FITC을 가지고 감시 따라서 직류 인구가 효과적으로 OVA 유발 알레르기기도 염증 과정 중에기도 면역 반응에 참여하는 사람들입니다 폐동맥 DC가의 선택적 모니터링을 허용합니다. 컨트롤 마우스에서 알레르기기도 염증의 부재에서, MLN에서 확인된 철새 DC가의 숫자 (OVA-FITC + DC가)는 크게 증가의 결과로 알레르기기도 염증에 대한 응답으로 가속 DC 이주의 기저 속도의 지표로 MLN의 OVA-FITC + DC가의 절대 개수. 분석 짧은 타임 스팬에서 수행하고 효율 / 감도가 훨씬 높다 수 있기 때문에 설명하는 전략은 전통적인 immunostaining / immunohistochemical 기반의 접근 방법을 통해 이점을 제공합니다. 따라서 전자는방법에서 설명한대로 적절한 컨트롤이 유동세포계측법 분석 기간 동안 고용되는 것을 보장하기 위해 qually 중요합니다. 결과에 영향을 미칠 수있는 다른 매개 변수는 폐암에서 단일 세포 현탁액의 준비입니다. 또한 이상 소화 폐의 효소 소화하는 동안 촬영해야합니다 그래서 치료는 그것이 OVA-FITC와 치료의 형광에 영향을 미칠 수있는 위해 나가기 위해서 조직의 상당한 노출을 방지하기 위해 이동해야하는 것은 세포에서 표면 마커의 절단으로 이어질 수있는 다운 스트림 분석에 영향을줍니다. 폐포 macrophages와 DC가 추가로 폐결핵의 DC 인구 ⁹ 분석을 복잡 표면 마커의 유사한 세트를 공유할 수 있습니다. 따라서 그것은 직류 분석을 방해할 수 폐포 macrophages를 제​​거하는 폐 세척에 매우 중요합니다.

알레르기기도 염증 동안 폐 직류 이주의 분석 이외에 설명된 방법론은 잠재적으로 서로에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 수정할 수 있습니다특정 항원은 형광 염료로 분류하며 intranasally 전달할 수 있습니다 약자 tigens. 위에서 설명한대로 그 후 유사한 분석은 폐의 직류 반응을 평가하기 위해 실시 할 수 있습니다. 항원이 붙어 있구 수없는 경우에는 항원 전달, FITC-dextran 또는 CFSE 이전 몇 시간은 생쥐에게 전달할 수 있습니다. 그 후, 항원 전달 후, 분석은 FITC-dextran 또는 특정 항원 ^10,11과 접종에 따라 폐 직류 이주의 속도론을 나타내는 것입니다 MLN에 DC가를 분류 CFSE의 마이 그 레이션을 모니터링하기 위해 실시 할 수 있습니다. 이전 작품에서 우리는 adenoviral 유전자 치료 벡터 ^10의 전달에 대한 응답으로 성숙 / 폐 DC가 마이 그 레이션을 평가하려면이 전략을 고용했습니다. DC가 다음 유동세포계측법으로 모니터할 수 있습니다 폐 DC가에 의한 빠른 이해에 FITC-Dextran 결과의 phagocytic, 비강 전달되기 때문입니다. 경우에 따라 폐 plasmacytoid DC가의 모니터링이 원하는 위치, CFSE가 emplo되어야plasmacytoid DC가가 이해 FITC-Dextran 등 효율적 등 다른 폐 직류 하위 집합 ^10을하지 않으므로 yed.

그것이기도 염증 과정 중에 폐동맥의 DC 성숙 / 마이 그 레이션의 정량 분석​​을 제공을 위해 개의 설명된 전략은 다른 전통적인 접근법 이상의 장점을 제공합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience