Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

Summary

Verfahren genau zu erzeugen und umfassend charakterisieren Morphologie Fadenpilz

Abstract

Der filamentöse Pilz A. niger ist ein weit verbreitetes Stamm in einem breiten Bereich industrieller Prozesse aus der Nahrung der pharmazeutischen Industrie. Eines der faszinierendsten und oft unkontrollierbaren Merkmale dieser filamentösen Organismus ist seine komplexe Morphologie. Es reicht von dichten kugelförmigen Pellets zu zähflüssig Myzelien (Abbildung 1). Verschiedene Prozessparameter und Zutaten sind dafür bekannt, Pilz-Morphologie ¹ zu beeinflussen. Da eine optimale Produktivität korreliert stark mit einer bestimmten morphologischen Form, die Pilz-Morphologie stellt oft den Engpass bei der Produktivität in der industriellen Produktion.

Ein geradlinig und elegante Methode zur präzisen Steuerung morphologische Form ist der Zusatz von anorganischen unlöslichen Mikropartikel (wie wasserhaltiges Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Titan-Silikat-Oxid) zu dem Kulturmedium Beitrag zur höheren Enzymproduktion ^2-6. Da es eine obvdene Korrelation zwischen Mikro-Partikel abhängig Morphologie und Enzymproduktion ist es wünschenswert, mathematisch zu verknüpfen Produktivität und morphologische Erscheinungsbild. Daher ist eine genaue quantitative und ganzheitliche morphologische Beschreibung wird angestrebt.

So stellen wir eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung von Mikro-Partikel abhängig morphologischen Strukturen und zur Pilz-Morphologie mit der Produktivität (Abbildung 1), die möglicherweise trägt zu einem besseren Verständnis der Morphogenese von fadenförmigen Mikroorganismen zu korrelieren.

Der rekombinante Stamm A. niger SKAn1015 wird 72 h in einem 3 l Rührkessel Bioreaktor. Durch Zugabe von Talk Mikropartikel in einer Konzentration von 1 g / l, 3 g / l und 10 g / l vor der Inokulation eine Vielzahl von morphologischen Strukturen reproduzierbar erzeugt. Sterile Proben werden nach 24, 48 und 72 Stunden zur Bestimmung der Wachstumsprozess und die Aktivität des hergestellten Enzyms gemacht. Diegebildete Produkt ist der hochwertige Enzym β-Fructofuranosidase, ein wichtiger Biokatalysator für neo-Zucker-Bildung in Lebensmitteln oder pharmazeutischen Industrie, die unter anderem katalysiert die Reaktion von Saccharose zu Glucose ^7-9. Daher bedeutet die Quantifizierung von Glucose nach Zugabe von Saccharose die Menge des produzierten β-Fructofuranosidase. Glukose wird durch eine Quantifizierung GOD / ^{POD-Assay-10,} die für High-Throughput-Analyse in 96-well Mikrotiterplatten modifiziert wird.

Pilz-Morphologie nach 72 Stunden wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Dabei werden Partikelform Faktoren für Pilz-Makro-Morphologie wie Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität mit dem Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm ImageJ berechnet. Relevante Parameter werden auf einer dimensionslosen Zahl Morphologie (Mn) ^11, die eine umfassende Charakterisierung ermöglicht kombiniertPilz Morphologie. Die enge Korrelation der Morphologie Anzahl und Produktivität werden durch mathematische Regression hervorgehoben.

Protocol

1. Reactor-Setup und Beginn der Kultivierung

4 Bioreaktor-Kultivierungen insgesamt durchgeführt werden.

1. Verwenden Sie ein 3 L Rührkessel-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 2,2 L für die Kultivierung von A. niger SKAn1015.
2. Gießen 72,6 g Glucose-Monohydrat in den Reaktor und füllen Sie ihn mit 1,9 l entionisiertem Wasser.
3. Installieren des Reaktors Geräte wie 3 Schikanen, zwei Sechs-beschaufelten Scheibe Turbinenrades, eine pH-Elektrode, einen Gaseinlaß mit Luftfilter, ein Kühlfinger, einem Abgas-Luft-Kühler mit Luftfilter, ein Tauchrohr zur sterilen Probenahme mit Luftfilter und Zulaufschläuche für mittlere, Inokulum, Säure und Base.
4. Autoklav den Reaktor bei 121 ° C für 20 min.
5. Verbinden Sie den Reaktor mit dem Säure-Basen-Reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) und den entsprechenden Pumpen und die Einrichtung eines pH-Wert von 5,0 ± 0,05 pH-Wert mit dem Steuergerät.
6. Verknüpfen Sie den Reaktor mit dem Kühlwasser-System und setzen Sie den Heizmantelin den Reaktor.
7. Installieren Sie den Temperaturfühler mit entsprechender Steuerung und Einrichtung einer Temperatur von 37 ± 0,1 ° C bei der Temperatur Steuereinheit.
8. Montieren Sie den Motor Agitation der Spitze des Reaktors und bringen sie in Betrieb mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 min ^-1.
9. In dem sterilen ein minimales Wachstum Medium ¹¹ Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (250 ml). Für mittlere Vorbereitung alle Komponenten wurden bei 121 ° C für 20 min autoklaviert und miteinander vermischt. Drei Kulturen die Komponenten umfassen Talkum (3MgO • 4SiO ₂ • H ₂ O) in den Konzentrationen von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Vor der Verwendung erneut zu suspendieren die Mikropartikel in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5) und fügen sie in den sterilen Medium. In Kontrollkulturen (ohne Partikel) ersetzen Sie den Mikro-Suspension mit 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5).
10. Fügen Sie die Sporensuspension (Inokulum) eines vorbereitet in Wucherpfennig et. al (2011) ¹¹ Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (50 ml), so dass die Konzentration von Sporen beträgt 1x10 ⁶ ml ^-1. Die Impfung stellt den Beginn des Anbaus (h = 0 h).
11. Starten Sie die Belüftung mit einer Rate von 1,0 L min ^-1.

2. Sterile Probenahme nach 24, 48 und 72 h Kultivierung

1. Nehmen 50 ml sterilem Kulturbrühe in einem Flakon Rohr.
2. Verwenden Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht, β-Fructofuranosidase Aktivität und mikroskopische Analyse.

3. Bestimmung des Biomasse-Trockengewicht nach 24, 48 und 72 h Kultivierung

1. Biomasse Proben zu mindestens doppelt gemacht werden.
2. Gewicht ein Cellulose-Filter mit einem Mikro-Skalen nach dem Trocknen im Exsikkator und platzieren Sie den Filter in einem Büchner-Trichter mit angeschlossenem Wasserstrahl-Vakuumpumpe.
3. Filtern sie ein definiertes Probenvolumen (zB 10 ml) einenND spülen Sie den Filter mit 10 ml destilliertem Wasser auf Medium Verbindungen aus der Biomasse zu entfernen.
4. Falten der Filter einmal in der Mitte, legen Sie sie in einem Glas-Petrischale und steckte es in ein Fach Trockner bis zur Gewichtskonstanz (mindestens 24 h).
5. Kühlen Sie den Filter in einem Exsikkator und Bestimmung des Gewichts.
6. Berechnen Sie die Biomasse Trockengewicht als die Differenz zwischen dem Gewicht des Filters mit und ohne getrocknete Biomasse von der verwendeten Probe dividiert.

4. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der extrazellulären β-Fructofuranosidase von GOD / POD-Essay nach 24, 48 und 72 h Kultivierung

Lagern Sie die Proben auf Eis ständig während der Arbeit mit ihnen.

1. Filter 1,5 ml Kultur Suspensionstrog ein Celluloseacetat-Filter durch Drücken der Kultursuspension mit einer Spritze durch den Filter in ein Reaktionsrohr. Bewahren Sie das Reaktionsrohr bei -20 ° C bis zur Verwendung.
2. Für die Reaktionsmischung verwenden 20ul-Probe und mit 200 ul von 1,65 M Saccharose in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5,4) aufgelöst, um die Reaktion von Saccharose zu Glucose zu initiieren. Cary aus der Reaktion mindestens in zweifacher Ausführung.
3. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 40 ° C für 20 min in einem Heizblock. Stoppen der Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min in einem Heizblock. Das Reaktionsgemisch wird durch Lagerung auf Eis und Spin-down das kondensierte Wasser durch Zentrifugieren bei 13.000 g für 10 min bei 4 ° C
4. Um den pH-Wert und Temperatur abhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose ausmachen, führen Sie eine leere Wert mit 20 ul entionisiertem Wasser anstelle von 20 ul Probe.
5. Um restliche Glucose in der Kulturbrühe zu berücksichtigen, Durchführung einer negativen Kontrolle für jede Probe. Zu diesem Zweck Verwendung von 20 ul der Probe zu inaktivieren und β-Fructofuranosidase durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 min vor der Saccharose hinzugefügt und die Platte wie in Schritt 4.3 beschrieben.
6. Verdünnen der Proben, so dass die folgenden Maßnahmenured Adsorption ist in der kalibrierten Wertebereich.
7. Führen Sie alle enzymatischen Assays in dreifacher Ausfertigung. Bewerben 2 ul verdünnte Probe in eine Mikrotiterplatte gut. Tragen Sie einen Standard für die Kalibrierung auf der Mikrotiterplatte durch jede Verwendung von 2 ul von zehn Glukose-Lösungen mit zehn unterschiedlichen Know-Konzentrationen (ab 1 mm bis 15 mm) anstelle von 2 ul Probe. Für Null-Punkt-Kalibrierung verwenden 2 ul entionisiertem Wasser anstelle von 2 ul Probe.
8. Fügen Sie 200 ul der Reagenzlösung in jede Vertiefung mit Hilfe einer Multi-Pipette.
9. Inkubieren des Gemisches für 10 min bei Raumtemperatur.
10. Bewahren Sie die Mikrotiterplatte bei 6 ° C bis zur Messung (ein paar Stunden bei den meisten).
11. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einer 96-well Mikrotiterplatten-Photometer Sonnenaufgang und die Magellan Datenwiederherstellung Software. Stellen Sie die Mischzeit bis zu 5 sek. und der Ruhezeit bis zu 1 sek.
12. Öffnen Sie das Ergebnis Tabelle mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und erstellen Sie eine Eichgerade mit dem Standard-Sortiment:
    glucose Konzentration X = a + b-Absorption
    
13. Berechnen Sie die Aktivität:
    Aktivität = (Absorption x Verdünnungsfaktor-Blindwert) X a + b
    
14. Finde heraus, die β-Fructofuranosidase Aktivität durch Berechnung der Differenz zwischen den Aktivitäten der Probe und der entsprechenden negativen Kontrolle.
15. Berechnen Sie die spezifische Produktivität für folgende Verwendung unter Berücksichtigung Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Tätigkeit ^11.

5. Mikroskopie und automatisierte Bildanalyse nach 72 h Kultivierung

1. Platz in 3 ml-Suspension in einer Kunststoff-Petrischale undverdünnen mit physiologischer Kochsalzlösung, bis die morphologischen Strukturen getrennt sind.
2. Situieren die Petrischale unter dem Mikroskop, das eine integrierte oder angeschlossene Kamera verfügt. Erfassen und Speichern des etwa 100 Bilder (Abbildung 2) von morphologischen Strukturen pro Probe. Beachten Sie, dass für jedes Bild wenigstens ein Objekt vollständig abgebildet.
3. Öffnen Sie alle Bilder von der gleichen Probe mit dem Bildverarbeitungsprogramm ImageJ ^12. Konvertieren Sie die Bilder auf schwarz und weiß mit der Prozess-Tool "Make Binary" (Abbildung 2). Für die Anwendung des Befehls an die ganze Reihe von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt.
   laufen (,, Machen Sie Binary ")
   
4. Öffnen Sie die bearbeiteten Bilder mit binären ImageJ wieder. Berechnen Sie die Formfaktoren Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität für jedes Bild mit dem Analysetool "Set Measurement". Zum Aufbringen der Befehl zu einer ernstES von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt.
   laufen ("8-Bit");
   ausgeführt werden ("Make Binary");
   laufen ("Set Scale ...", "Abstand = X bekannt = 1000 Pixel = 1 VE = um globale");
   laufen ("Set Maße ...", "Bereich Umfangsform Feret-Limit-Anzeige redirect = None dezimal = 3");
   laufen ("Analyze Particles ...", "size = 10000-Infinity Zirkularität = 0,00-1,00 show = Outlines Display");
   Bestimmen X die Anzahl der Pixel, die 1000 um korreliert, indem er eine gerade Linie in einem Maßstab. Korrelieren der Anzahl von Pixeln aus der geraden Linie mit der Länge der Balken in um.
5. Öffnen Sie das Ergebnis Diagramm mit Formfaktor Werte für jedes Bild mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie eine Morphologie-Nummer wie folgt für jedes Bild.
   
6. Berechnen Sie Mittelwert und Standardabweichung für die Morphologie Zahl unter Berücksichtigung aller Bilder einer Probe. Verwenden Sie eine Graphik-und Datenanalyse-Programm für graphische Korrelation der Morphologie, die dem spezifischen Produktivität und bestimmen Sie die mathematische Beziehung durch mathematische Regression.

6. Repräsentative Ergebnisse

Durch Zugabe von Talkum Mikropartikel A. niger SKAN 1015 Morphologie wird von einem echten Pelletmorphologie zu einem verteilten oder sogar Myzel Morphologie verändert. Während Pelletmorphologie unter Standardbedingungen zeigte ein Myzel Morphologie durch Ergänzung Medium mit 10 g / l Talkum Mikropartikel (4.) Erstellt. Gleichzeitig die Aktivität von β-Fructofuranosidase erhöht um 3-fach ^3-5. Eine Ergänzung von 1 oder 3 g / l Talkpulver führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer doppelten Fructofuranosidase Aktivität (4.).

Die Mikro-Partikel abhängig Morphologie in umfassender Weise durch die Mor beschrieben werdenMorphologie Zahl, die anhand von Parametern automatische Bildanalyse bestimmt werden kann. Perfekt abgerundete und glatte Pellets werden in mikroskopischen Bildern erscheinen als perfekte Kreise. Für solche Teilchen die Morphologie hat einen Wert von 1. Die kleinste Fragment von Mycel Morphologie als eindimensionale Linie was eine Morphologie Zahl von 0 vereinfacht werden. Alle Zwischen-morphologische Formen wie längliche unregelmäßige Pellets oder Klumpen müssen daher Werte zwischen 0 und 1. Ziemlich große Partikel werden in einem hohen, Pilz-Partikel mit einer großen Oberfläche oder längliche Partikel, in einem eher niedrigen Morphologie der Nummer ¹¹ zur Folge haben.

Unter Standardbedingungen die Morphologie in Reaktor 1 weist eine Morphologie Zahl rund 0,8. Die Morphologie im Reaktor 4 mit 10 g / L Talkpulver ist mit einem Mn etwa 0,1. Die Morphologie Anzahl von Reaktoren 2 und 3, mit Talkum Puder Konzentrationen von 1 und 3 g / l, zwischen diesen Extremen liegt, zeigt eine dispergierte morphologie. Da Mikro-Partikel-Morphologie abhängig ist eng mit dem β-Fructofuranosidase Produktivität bezogen, wird eine mathematische Korrelation von Morphologie und Produktivität Zahl ähnlich wie Abbildung 5 erhalten.

Abbildung 1. Allgemeine Systematik des experimentellen Designs und des analytischen Verfahrens. A. niger kultiviert wird (mit oder ohne Mikro-Teilchen) in einem 3 L Rührkessel-Bioreaktor für 72 h. Nach 24, 48 und 72 ha Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Aktivität, was wiederum zur Berechnung der spezifischen Produktivität verwendet getroffen werden. Nach 48 h wird die Pilz-Morphologie wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Relevante Parameter der Bildanalyse auf eine Morphologie-Nummer, die mathematische Beziehung mit der spezifischen Produktivität kombiniert.

Abbildung 2. Schritte der Bildverarbeitung für die mikroskopische-generierte Bilder von morphologischen Strukturen von A. Niger. Schritt 1: Bildaufnahme mit dem Mikroskop. Schritt 2: Imageverbesserung, wenn nötig. Schritt 3: Bild Binarisierung, schwarz-weiß (binär) Bild in ImageJ erzeugt. Schritt 4: das binäre Bild wird durch verarbeitet und unerwünschte Objekt gelöscht werden. Schritt 5: morphologische Analyse wird mit der "Analyze Partikel"-Funktion der Open-Source-Programm ImageJ durchgeführt.

Abbildung 3. Verschiedene morphologische Formen von A. niger abhängig von der Konzentration des zugesetzten Mikropartikel. Mit zunehmender Konzentration von Mikro-Partikeln gegeben das Pellet Größe exakt verringert werden kann bis hin zu kleinen Kern-Schale-Pellets, kleine Herden und sogar frei verteilt Myzel. Morphologie Engineering Alspergillus niger SKAn1015 durch Mikro-Partikel-Supplementation in Submerskultur. Ohne Mikropartikel (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / l (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / l (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / l (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (A), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) und 40-50 g / L (T). Die Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie nach 72 h der Landwirtschaft entzogen.

4. Fructofuranosidase Aktivität in Abhängigkeit von Talk Mikropartikel Konzentration von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Reaktor 1 ist nicht mit Mikro-Partikel ergänzt, hier der Anbau wird unter Standard-Bedingungen durchgeführt.

Abbildung 5. Vertreter gute Korrelation (R ² = 0,91) der MorphologieAnzahl und die spezifische Produktivität. Die Morphologie Zahl aufgetragen (Abszisse) gegen die spezifische Produktivität (Ordinate). Nichtlineare Regression ergibt den exponentiellen Korrelation.

Discussion

Die Modifizierung von Pilz-Morphologie hat Interesse an der Biotechnologie seit vielen Jahrzehnten. Verschiedene Studien haben versucht, ausgewählte Prozessparameter wie pH-Wert, Leistungsaufnahme, Temperatur, Medium Nährstoffe oder Inokulumkonzentration ¹ variieren, leiden aber unter eher ungenau, unvollständig und Kontrolle der Morphologie, hohe Energiekosten, Hemmeffekte Produkt oder Instabilität, Im Gegensatz dazu Die Ergänzung von Mikropartikeln erlaubt eine präzise Konstruktion von Pilz Morphologie durch Feinabstimmung Variation der Teilchengröße und Konzentration. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, um Mikro-Partikel zur Optimierung und zur maßgeschneiderten Entwicklung von Hochgeschwindigkeits produzierenden Morphologie verwenden in der biotechnologischen Produktion mit A. niger und andere filamentöse Mikroorganismen.

Die digitale Bildanalyse ist ein leicht reproduzierbares Verfahren zur Pilz-Makro-Morphologie zu charakterisieren. Allerdings ist die Vielzahl von Parametern für die Größe, Form und Oberflächeneigenschaftenter von morphologischen Strukturen in der Literatur beschrieben ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Pilz-Morphologie kompliziert. Das vorgestellte Morphologie Zahl als eine Kombination von relevanten Parametern, vermeidet diesen Nachteil und kann nicht nur für die umfassende Charakterisierung von morphologischen Strukturen, sondern auch für die direkte mathematische Korrelation mit der Produktivität genutzt werden. Dies wiederum macht eine Schätzung der Produktivität durch die Morphologie gegeben und damit eine Anpassung der Morphologie für Prozess muss möglich.

Mit der Morphologie Zahl, ist es möglich, zwischen verschiedenen Pellets und verklumpen Morphologien ^4,5 unterscheiden. Für die weitere Entwicklung der Morphologie Zahl der Betrachtung der fraktalen Dimension scheint vielversprechend zu sein. Eine fraktale Dimension ergibt eine Messung der Komplexität und der Masse füllen Eigenschaften eines Objekts ¹³ und ist daher für eine ganzheitliche Charakterisierung von Mycel-Morphologie prädestiniert.

Die creation eines hohen produzierenden Mycel-Morphologie, könnte jedoch zu Problemen mit Prozess-Performance vor allem in großflächigen Anbau führen, weil das Myzelwachstum Formular wurde zuvor gezeigt wurde, weisen viel größere Kulturbrühe Viskositäten ^2. Dies führt zu Problemen mit Wärme-und Stofftransport und die Bildung von gemischten Zonen nicht stagniert, die eine höhere Leistungsaufnahme und machen den Anbau teurer zu ¹ voraussetzen. Deshalb Beziehung zwischen Pilz Morphologie und Kulturbrühe Viskosität sollte berücksichtigt werden, wenn die Änderung der Morphologie und in weiteren Modellen eingebaut werden können.