Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer Morfolojisi

Summary

Tam olarak oluşturmak ve kapsamlı ipliksi mantar morfolojisi karakterize bir yöntem

Abstract

Ipliksi mantar A. Nijer gıda ilaç endüstrisi için endüstriyel süreçleri geniş bir yelpazede yaygın olarak kullanılan bir türdür. Bu ipliksi organizmanın en ilgi çekici ve çoğu zaman kontrol edilemeyen özelliklerinden biri karmaşık morfolojisini. Bu yoğun küresel pelet viskoz miselyumla (Şekil 1) arasında değişmektedir. Çeşitli proses parametreleri ve malzemeyi fungal morfolojisi ¹ etkilemekte olarak da bilinirler. Optimum verimlilik, belirli bir morfolojik yapısı ile güçlü bir korelasyon bu yana, mantar morfolojisi genellikle, sanayi üretiminde verimlilik darboğaz temsil eder.

Kesin morfolojik şeklini kontrol A yalındır ve zarif yaklaşımı artan enzim üretimi ^2-6 katkıda kültür ortamına inorganik çözünmeyen mikro partiküller (sulu magnezyum silikat, alüminyum oksit veya titanyum oksit, silikat gibi) eklenmesidir. Bir obv olmadığındanmikro partikül bağımlı morfolojisi ve enzim üretimi arasındaki ious ilişki matematiksel olarak verimlilik ve morfolojik görünüm bağlamak için arzu edilir. Bu nedenle kantitatif bir kesin ve bütünsel morfolojik tanımlama hedeflenmektedir.

Böylece, biz üretmek ve karakterize mikro partikül bağımlı morfolojik yapıları ve muhtemelen ipliksi mikroorganizmaların morfonogenezi daha iyi anlaşılmasına katkıda verimlilik (Şekil 1) mantar morfoloji ilişkilendirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Rekombinant suşu A. Nijer SKAn1015 tankı biyoreaktör karıştırılmış bir 3 L 72 saat için yetiştirilmektedir. G / L önceden aşılama için 1 g / L, 3 g / L ve 10 konsantrasyonda talk mikro partiküllerinin eklenmesi ile morfolojik özellikleri çeşitli çoğaltılabilir şekilde oluşturulur. Steril örnekleri üretilen enzim büyüme ve gelişme aktivitesinin belirlenmesi için 24, 48 ve 72 saat sonra alınmıştır.oluşan ürün değeri yüksek enzim β-fructofuranosidase, gıda ya da diğerleri arasında glukoz ^7-9 için sukroz reaksiyonu katalize ilaç sanayi, neo-şeker oluşumu için önemli bir biocatalyst olduğunu. Bu nedenle, sukroz eklendikten sonra glikoz miktarının üretilen β-fructofuranosidase miktarı anlamına gelmektedir. Glikoz miktar 96-kuyucuklu plaklar içinde mikro titre yüksek verim analizi için değiştirilmiş bir GOD / POD-Assay ¹⁰ tarafından yapılmaktadır.

72 saat sonra Mantarların morfolojisi mikroskopta incelenir ve dijital görüntü analizi ile karakterizedir. Bunu yaparken, Feret çapı gibi mantar makro morfolojisi, projeksiyon alanı, çevre, dairesellik, boy oranı, yuvarlaklık und sağlamlık için parçacık şekli faktörleri açık kaynak görüntü işleme programı ImageJ ile hesaplanır. İlgili parametreleri kapsamlı bir karakterizasyonu sağlayan bir boyutsuz Morfoloji numarası (Mn) ^11, birleştirilerekmantar morfolojisi. Morfoloji sayısı ve verimlilik yakın bir ilişki matematiksel regresyon ile vurgulanır.

Protocol

1. Yetiştiği Reaktör Kurulum ve Başlangıç

Toplam 4 biyoreaktör kültivasyonları gerçekleştirilmektedir.

1. A. ekimi için 2.2 L bir çalışma hacmi ile 3 L karıştırılan tank biyoreaktör kullanın Nijer SKAn1015.
2. Reaktöre 72,6 g glukoz monohidrat dökün ve 1,9 L deiyonize su ile doldurunuz.
3. 3 gibi tamponlar olarak reaktör ekipmanları, iki altı kanatlı diski türbin çarkı, pH elektrodu, hava filtresi ile bir gaz girişi, bir soğutma parmak, hava filtresi ile bir egzoz hava soğutucu, hava filtresi ile steril örnekleme için daldırma tüp yükleyin orta, inokulum, asit ve baz ve giriş hortumlarının.
4. 20 dakika boyunca 121 ° C'de reaktör otoklava.
5. Asit-baz rezervuar (2 M HCl, 2 M NaOH) ve ilgili pompaları ile reaktör bağlayın ve pH kontrol ünitesi ile 5.0 bir pH değeri ± 0.05 kurmak.
6. Soğutma suyu sistemi ile birlikte reaktöre bağlamak ve ısıtma ceketi koymakreaktör damar etrafında.
7. İlgili kontrol ünitesi ile sıcaklık sensörü takın ve 37 lik bir sıcaklık kurmak ± 0.1 ° C sıcaklık kontrol ünitesinde.
8. Reaktörün tepesine ajitasyon motoru Fit ve 200 dk ^-1 bir ajitasyon hızı ile hizmet getirmek.
9. Steril minimal büyüme ortamında ¹¹ oluk steril bir giriş hortumlarının (250 mL) içinde bir ekleme. Orta hazırlanması için, tüm bileşenler 20 dakika süreyle 121 ° C'de otoklavda ve karıştırılmıştır. Üç kültivasyonları için bileşenleri talk 1 g / L arasında konsantrasyonlarda tozu (3MgO • • 4SiO ₂ H ₂ O) (reaktör 2), 3 g / L (reaktöre 3) ve 10 g / L (reaktör 4) içerir. Kullanmadan önce, 50 mM sodyum asetat tampon (pH 6.5) içinde mikro parçacıklar yeniden askıya ve steril besiyeri ekleyin. Kontrol kültürlerinde (parçacıklar olmadan) 50 mM sodyum asetat tampon (pH 6.5) ile mikro partikül süspansiyon yerini alır.
10. Spor süspansiyon (inokulum) bir ekles Wucherpfennig et hazırlanmıştır. diğerleri (2011) ¹¹ bu nedenle çukur steril bir giriş hortumlarının (50 mL) içinde bir ⁶ olduğu 1x10 mL ^-1 sporların miktarda konsantrasyonu. Inokülasyon ekiminin başlangıcı (h = 0 h) işaretler.
11. 1.0 L dk ^-1 oranı ile havalandırma başlayın.

2. Steril 24 sonra Örnekleme, 48 ve Yetiştirme 72 saat

1. Bir flacon tüp içine steril kültür bulyonu 50 mL al.
2. Biyokütle kuru ağırlık, β-fructofuranosidase aktivite ve mikroskopik analiz belirlenmesi için numune kullanın.

3. 24 sonrası Biyokütle Kuru Ağırlık Tayini, 48 ve Yetiştirme 72 saat

1. Biyokütle numuneleri en az iki kez alınmalıdır.
2. Ağırlık desikatörde kuruma ve bağlı su jeti vakum pompası ile Büchner huni filtre yerleştirdikten sonra bir mikro ölçeklerde bir selüloz filtre.
3. Tanımlanmış bir numune hacmi (örneğin 10 mL) bir filtrend biyokütleden orta bileşikler kaldırmak için 10 ml deiyonize su ile filtre durulayın.
4. Kırışıklık filtresi kez ortasında, bir cam petri koyun ve ağırlık sabitliği (en az 24 saat) kadar kurutma bölmesine koydu.
5. Bir desikatörde filtre soğutulur ve ağırlık ölçer.
6. Ve kullanılan örnek hacmi bölünmesiyle kurutulmuş biyokütle olmadan filtre ağırlığı arasındaki fark olarak biyokütle kuru ağırlık hesaplayabilir.

4. 24 sonrası TANRI / POD-kompozisyon ile β-fructofuranosidase ve Ekstrasellüler Enzimatik aktivitenin belirlenmesi, 48 ve Yetiştirme 72 saat

Onlarla çalışırken sürekli buz örnekleri saklayın.

1. Filtre 1.5 mL kültür süspansiyonu bir reaksiyon teknesi tüp içine filtre aracılığıyla bir şırınga ile kültür süspansiyon basarak bir selüloz asetat filtre. Kullanıma kadar -20 ° C'de reaksiyon tüpü saklayın.
2. Reaksiyon karışımı 20 kullanmak içinuL numune ve glikoz sukroz gelen tepkimesini başlatabildiği için 0.05 M fosfat tampon maddesi (pH 5.4) içinde çözülmüş, 1,65 M sakaroz ve 200 uL ekleyebilir. En azından reaksiyonunu Cary çoğaltın.
3. Bir ısıtma blok içinde 20 dakika süreyle 40 ° C'de inkübe Reaksiyon karışımı. Bir ısıtma blok içinde 10 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya reaksiyonu durdurmak. Buz üzerinde saklayarak Reaksiyon karışımı soğutulur ve 10 dakika 4 ° C'de 13,000 g'de için santrifüj ile kondanse su aşağı doğru dönmeye
4. PH ve glikoz sakkaroz sıcaklığa bağlı bölünme dikkate almak için, 20 uL deiyonize su yerine 20 uL örnek kullanarak boş bir değer yürütmek.
5. Kültür suyu kalıntı glukoz dikkate almak için, her bir örnek için negatif bir kontrol yürütmek. Bu amaçla kullanılması 20 numune uL ve sukroz ve ilave olarak adım 4,3 tarif inkübe önce 10 dakika süreyle 95 ° C'de ısıtılarak β-fructofuranosidase inaktive etmek için.
6. Öyle ki örnekleri aşağıdaki ölçüm seyreltilirçıkılması önlenmektedir adsorpsiyon kalibre edilmiş bir değer aralığı içindedir.
7. Üç kopya olarak tüm enzimatik testler yapın. Iyi bir mikro titrede plaka 2 uL seyreltilmiş numune uygulayın. Yerine 2 uL örnek on farklı Know konsantrasyonlarda (1 mM ile 15 mM) ile on glukoz çözümleri 2 uL kullanarak her tarafından mikro titre plaka üzerinde kalibrasyon için bir standart uygular. Sıfır noktası kalibrasyon 2 uL deiyonize su yerine 2 uL örnek kullanmak için.
8. Bir çok pipet kullanılarak her oyuğa reaktifi çözeltinin 200 uL ekleyin.
9. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe karışımı.
10. 6 mikro titre plakası Mağaza ° ölçümü (en az birkaç saat) kadar C.
11. Bir 96-Gün Doğumu mikro plaka okuyucu ve Magellan veri alma yazılımı kullanılarak 450 nm dalga boyunda absorpsiyon ölçün. 5 sn karıştırma zamanı ayarlayın. ve en fazla 1 sn dinlenme süresi.
12. Elektronik tablo ile sonuç grafiği açın ve standart aralığı kullanarak bir kalibrasyon hat inşa:
    glucose konsantrasyonu = Bir X emme + b
    
13. Aktivite hesaplayın:
    aktivite = (soğurma X sulandırma faktörü-boş değer) X a + b
    
14. Örnek etkinlikleri ve uygun negatif kontrol arasındaki fark hesaplanarak β-fructofuranosidase aktivite bulmaya çalışın.
15. Hesap biyokütle kuru ağırlığı ve β-fructofuranosidase aktivite ¹¹ dikkate alarak aşağıdaki kullanım için özel verimlilik hesaplayın.

5.. Yetiştiği 72 saat sonra Mikroskopi ve Otomatik Görüntü Analizi

1. Yer yaklaşık 3 ml kültürü bir plastik Petri kabındaki süspansiyon vemorfolojik özellikleri ayrılır kadar fizyolojik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiş.
2. Entegre veya bağlı kamera, mikroskop altında Petri, kalorifer. Örnek başına morfolojik yapıları yaklaşık 100 görüntü (Şekil 2) edinin ve kaydedin. Her bir fotoğraf, en az bir nesne tamamen resmedilmiştir dikkat ediniz.
3. Görüntü işleme programı ImageJ ¹² ile aynı örnek tüm görüntüleri açın. Süreci aracını kullanarak siyah ve beyaz (Şekil 2) "İkili olun" görüntüleri dönüştürün. Görüntülerin dizi için komut uygulamak için aşağıdaki gibi bir makro kodunu kullanabilirsiniz.
   çalıştırın (, İkili Yap ")
   
4. Tekrar ImageJ ile işlenmiş ikili görüntüleri açın. Şekil faktörleri Feret çapı, projeksiyon alanı, çevre, dairesellik, boy oranı, analiz aracı "Ölçüm" ile her görüntü için yuvarlaklık und sağlamlığına hesaplayın. Bir seri için komutu uygulamak içinGörüntülerin es aşağıdaki gibi bir makro kodunu kullanabilirsiniz.
   ("8 bit") çalıştırın;
   ("İkili Yap") çalıştırabilirsiniz;
   ("Set Ölçeği ...", "mesafe = X bilinen = 1000 piksel = 1 birim = mikron küresel") çalıştırabilirsiniz;
   ("Set Ölçümleri ...", "alan çevre şekli Feret sınırlarını ekran = Yok ondalık = 3 yönlendirme") çalıştırın;
   ("Parçacıklar Analiz ...", "size = 10000-Infinity dairesellik = 0,00-1,00 gösterisi = ekran Outlines") çalıştırın;
   Bir ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi oluşturarak 1000 mikron ilişkilendirir piksel sayısını X olarak belirleyin. Mikron ölçeğinde in çubuk uzunluğu ile düz çizgi arasında piksel sayısını ilişkilidir.
5. Elektronik tablo ile her resim için şekil faktörü değerleri içeren sonuç grafiği açın. Her bir görüntü için aşağıdaki bir Morfoloji sayısını hesaplayın.
   
6. Değer ve dikkate bir örnek tüm fotoğraf çekmek Morfoloji numarası için standart sapma hesaplanır. Özel verimlilik ile Morfoloji sayıda grafik korelasyon için bir grafik ve veri analizi programı kullanın ve matematiksel regresyon ile matematiksel ilişkiyi belirler.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Talk mikro parçacıklar A. eklenmesiyle Nijer Skan 1015 morfoloji gerçek bir pelet morfolojiden dağınık bir hatta misel morfolojisi değişti. Pelet morfolojisi standart koşullar sergilenmektedir Oysa bir misel morfolojisi talk mikro parçacıklar 10 g / L (Şekil 4). Orta takviyesi tarafından oluşturulur. Aynı zamanda β-fructofuranosidase aktivitesini 3 kat ^3-5 etrafında arttırır. 1 ya da 3 g / L talk pudra bir takviye bir katına fructofuranosidase aktivitesi (Şekil 4). Ile, bir dağılmış morfolojisi yol açar.

Mikro partikül bağımlı morfolojisi kapsamlı Mor tarafından tarif edilebilirOtomatik görüntü analizi ile belirlendi parametreleri kullanılarak hesaplanabilir yapıdaki sayısı. Mükemmel yuvarlak ve yumuşak granül mikroskobik görüntüleri mükemmel daireler olarak görünür. Bu tür partiküller için morfoloji numarası 1 bir değere sahiptir. Misel morfoloji en küçük parçası 0 bir Morfoloji numarası veren tek boyutlu bir hat olarak basitleştirilmiş olabilir. Uzamış düzensiz pelet veya öbekler gibi tüm ara morfolojik formları nedenle 0 ve 1 arasında değerler olacaktır. Oldukça büyük partiküller oldukça düşük sayıda morfoloji ¹¹ geniş bir yüzey veya ince uzun parçacıklar yüksek bir mantar partikülleri, sonuçlanacaktır.

Standart şartlarda reaktör 1 morfolojisi sergileyen 0,8 etrafında bir Morfoloji numarası. 10 g / L talk pudra ile birlikte reaktöre 4 morfolojisi 0,1 etrafında bir Mn sahiptir. 1 ve 3 g / L, talk pudra konsantrasyonları ile reaktörler 2 ve 3 için Morfoloji sayısı dağınık bir biçim gösteren, bu iki uç arasında yer almaktadırlogy. Mikro partikül bağımlı morfolojisi yakından β-fructofuranosidase verimliliği ile ilgili olduğundan, Şekil 5'e benzer Morfoloji sayısı ve verimlilik matematiksel bir korelasyon elde edilir.

Şekil 1. Deneysel tasarım ve analitik prosedür genel şeması. A. Nijer 72 saat boyunca tankı biyoreaktör karıştırılmış bir 3 L (mikro parçacıklar olan veya olmayan) yetiştirilmektedir. 24 saat sonra, 48 ve 72 ha Örnek tekrar özel verimlilik hesaplanması için kullanılmaktadır biyokütle kuru ağırlık ve β-fructofuranosidase aktivitesi, belirlenmesi için alınır. 48 saat sonra mantar morfolojisi mikroskopta incelenir ve dijital görüntü analizi ile karakterizedir. Görüntü analizi ve ilgili parametrelerin matematiksel özel verimlilik ile korele bir Morfoloji numarası için birleştirilmiştir.

Şekil 2. A. morfolojik yapılarının mikroskobik oluşturulan görüntüler için görüntü işleme Aşamaları Nijer. Adım 1: mikroskopta görüntü elde etme. Adım 2: görüntü iyileştirme gerekirse. Adım 3: Görüntü İkiye Ayırma, ImageJ üretilen siyah-beyaz (ikili) görüntü. Adım 4: ikili görüntü ile işlenir ve istenmeyen bir nesne temizlenir. Adım 5: morfolojik analiz açık kaynak program İmageJ olan "parçacıklar Analiz" fonksiyonu ile yapılır.

Şekil 3. A. Farklı morfolojik katma mikro parçacıklar konsantrasyonuna bağlı Nijer. Mikro parçacıklar sayesinde artan konsantrasyonu pelet boyutu tam olarak küçük bir çekirdek kabuğu topakları, küçük sürüler ve hatta serbestçe dağılmış misel kadar azaltılabilir ekledi. As Morfoloji mühendisliğibatık kültüründe mikro partikül takviyesiyle pergillus Nijer SKAn1015. Olmadan mikro (A), 10 mg / L (B), 0.1 g / L (C), 0.2 g / L (D), 0.3 g / L (E), 0.6 g / L (F), 1.0 g / L (G), 1.5 g / L (H), 2.0 g / L (I), 2.5 g / L (J), 3.0 g / L (K), 3.5 g / L (L), 4.0 g / L (M g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) ve), 4.5 g / L (N), 5.0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 40-50 g / L (T). Görüntüler ekiminin 72 saat sonra ışık mikroskobu alınmıştır.

Şekil 4. Bağımlılığı in Fructofuranosidase aktivitesi talk mikro partikül konsantrasyonu 1 g / L (reaktör 2), 3 g / L (reaktöre 3) ve 10 g / L (reaktör 4). Reaktör 1 mikro partikülleri ilave edilmez; burada kültivasyonu standart koşullar altında yapılır.

Şekil 5. Morfoloji Temsilcisi iyi bir korelasyon (R ² = 0.91)numarası ve spesifik üretkenliği. Morfoloji numarası özel verimlilik (ordinat) karşı (apsis) çizilir. Doğrusal olmayan regresyon üstel korelasyon verir.

Discussion

Mantar morfolojik değişiklikler, uzun yıllar beri biyoteknoloji ilgi olmuştur. Farklı çalışmalarda, pH değeri, güç girişi, sıcaklık, orta besinlerin veya inokulum konsantrasyonu ¹ olarak seçilen proses parametreleri değiştirmek için çalıştı, ama aksine morfolojisi oldukça özensiz ve eksik kontrolü, yüksek enerji maliyetleri, önleme etkisi veya ürün istikrarsızlık, acı var parçacıklarının mikro takviyesi parçacık boyutu ve konsantrasyon ince ayarlanmış değişimi yoluyla fungal morfolojisi kesin bir mühendislik sağlar. Bu yeni olanaklar A. ile biyoteknolojik üretim optimizasyonu ve yüksek üreten morfoloji ısmarlama tasarım için mikro parçacıklar kullanmak açar Nijer ve diğer ipliksi mikroorganizma.

Dijital görüntü analizi fungal makro morfolojisi karakterize etmek için kolay bir tekrarlanabilir bir yöntemdir. Ancak, boyut, şekil ve yüzey karakteristik için parametrelerin çeşitliLiteratürde tanımlanan morfolojik yapıları ter karmaşık mantar morfoloji hızlı değerlendirme yapar. Ilgili parametrelerin bir birleşimi olarak sunulan Morfoloji sayısı, bu eksikliği ortadan kaldırır ve morfolojik yapılarının kapsamlı karakterizasyonu için değil, aynı zamanda verimliliği ile doğrudan matematiksel bir korelasyon için sadece kullanılabilir. Bu da mümkün ihtiyacı süreci için verilen morfolojisi ve bu nedenle morfolojisi bir özelleştirme ile verimlilik tahmini vermektedir.

Morfoloji numarasını kullanarak, çeşitli pelet ve ağır adımlarla yürümek morfolojileri ^4,5 ayırt etmek mümkündür. Morfoloji sayısının daha da geliştirilmesi için fraktal boyutunun dikkate umut vermektedir. A fraktal boyut bir nesne ¹³ özellikleri dolum karmaşıklığı ve kütlesinin bir ölçüm vermekte ve bu nedenle misel morfolojisinin bütünsel karakterizasyonu için predestinated edilir.

Crmisel büyüme formu daha önce çok daha büyük bir kültür suyu viskoziteleri ² sergiledikleri gösterilmiştir çünkü yüksek üreten misel morfolojisi eation Ancak, özellikle büyük ölçekli ekimi işlemi performans sorunlarına yol açabilir. Bu ısı ve kütle transferi ve daha yüksek bir güç girişi ve ¹ işletmek ekimi daha pahalı hale gerektiren durgun olmayan karışık bölgeleri, oluşumu ile ilgili sorunlara yol açabilir. Morfolojisi değişen ve daha modellerinde dahil edilebilir, bu nedenle fungal morfoloji ve kültür bulyonu viskozite arasındaki ilişkiyi göz önüne alınmalıdır.