Summary
نحن هنا وصف الاسلوب الذي يستخدم الآن بشكل روتيني لعزل متجهة ستابلي الريبوسوم المجمعات سلسلة الوليدة (RNCs). هذه التقنية يستفيد من اكتشاف ان 17 حمض أميني طويل "تسلسل اعتقال" SecM يمكن وقف استطالة ترجمة في بروكاريوتيك (
Abstract
وقد وفرت بحوث مستفيضة أدلة وافرة تشير إلى أن بروتين قابلة للطي في الخلية هو عملية مشتركة متعدية 1-5. ومع ذلك، فإن المسار الدقيق الذي يلي سلسلة ببتيد خلال التعاون متعدية للطي لتحقيق شكلها وظيفي لا يزال لغزا. من أجل فهم هذه العملية وتحديد التشكل الدقيق للوسيطة مشتركة متعدية للطي، وأنه من الضروري لتطوير التقنيات التي تسمح للعزلة RNCs تحمل السلاسل الوليدة من أحجام محددة سلفا للسماح للمزيد من تحليل الهيكلية.
SecM (راصد إفراز) هو 170 E. حامض اميني بروتين كولاي التي تنظم التعبير عن أتباز المصب (القيادة إفراز) سيكا في الاوبرون secM سيكا-6. Nakatogawa وايتو وجدت في الأصل أن 17 تسلسل الأحماض الأمينية طويلة (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) في منطقة C-محطة من البروتين SecM غير كاف وضروري لتسبب توقف استطالة SecM في Gly165، وبذلك تنتج ببتيديل-غليسيل-الحمض الريبي النووي النقال ملزمة ثابت إلى الريباسي ف موقع 7-9. الأهم من ذلك، فقد وجد أن هذا يمكن أن تنصهر فيها 17 تسلسل الأحماض الأمينية طويلة للوصول إلى محطة-C من بروتين أي تقريبا كامل طول و / أو مبتورة وبالتالي السماح لإنتاج RNCs تحمل السلاسل الوليدة من أحجام محددة سلفا 7. وبالتالي، عندما تنصهر أو إدراجها في بروتين الهدف، SecM تسلسل مماطلة تنتج القبض على استطالة سلسلة ببتيد ويولد RNCs مستقرة على حد سواء في الجسم الحي في E. خلايا القولونية و. في المختبر في نظام خالية من الخلايا ويستخدم مزيد من السكروز الطرد المركزي المتدرج لعزل RNCs.
يمكن استخدام RNCs معزولة لتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية في وسيطة مشتركة متعدية للطي. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بنجاح هذه التقنية للحصول على نظرة ثاقبة لبناء سلاسل عدة متجهة الريبوسوم الوليدة 10،11. نحن هنا وصف عزلة غلوبولين العدسة غاما-B البقري RNCs تنصهر إلى SecM ولدت في الترجمة في نظام المختبر.
Protocol
1. الحمض النووي تحضير قالب والنسخ في المختبر
- يتم استنساخ الجينات ذات الأهمية في أي و / أو على سبيل المثال T7 SP6 المروج استنادا البلازميد. للحصول على RNCs من الفائدة، يتم توسيع محطة C-هدف ببتيد بإضافة اعتقال تسلسل حمل من FXXXXWIXXXXGIRAGP SecM 7. من أجل ضمان أن يكون جزء من ببتيد الفائدة سوف بثق للخروج من النفق الريباسي، الجزء C-محطة للبروتين الهدف لا بد من توسيع نطاق لا يقل عن 30 من الأحماض الأمينية 12-14. ويمكن إدخال وجليكاين، سيرين مرنة رابط بين غني للبروتين وتسلسل اعتقال SecM لتجنب أي قيود ممكن متعلق بتكوين جزئي.
- لنسخ في المختبر، ينبغي الخطي قالب الحمض النووي مع الانزيم تقييد قطع المصب من ORF. يحتاج المرء للتحقق من الخطية كاملة من الحمض النووي البلازميد عن طريق تشغيل المنتج الهضم قيود على الكهربائي للهلام الاغاروز.
- وبلازما خطيويستخدم أيضا في رد فعل لمعرف النسخ المختبر. ويمكن اختبار تركيز مختلفة من الحمض النووي لتحديد قالب الأمثل تركيز الحمض النووي المطلوب لنسخ في المختبر. عموما مع Ambion في MEGAscript عالية الغلة كيت النسخ (Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، 1 ميكروغرام الحمض النووي الخطي ينتج 40-60 مرنا ميكروغرام. في النسخ المختبر ويتم ذلك بعد تعليمات الشركة الصانعة (Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك) .
- بعد النسخ في المختبر، يتم تنقيته بواسطة مرنا ترسيب كلوريد الليثيوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Ambion في MEGAscript النسخ عالية الغلة كيت، Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك).
- يتم التحقق من سلامة مزيد مرنا بواسطة الكهربائي باستخدام مادة الأكريلاميد أو المواد الهلامية الاغاروز.
2. الترجمة في المختبر
للترجمة في المختبر باستخدام كولاي E. RTS 100 HY كيت (5 رئيس الوزراء، Gaithersburg، MD) اتبع الخطوات التالية:
- إعداد 100 ميكروليتر من التعليم في رد فعل الترجمة المختبر مصنع التالي. لفترة وجيزة، في المياه nuclease مجانا إضافة 24 ميكرولتر خليط من الأحماض الأمينية الميثيونين ناقص (1 ملم)، 10 وحدات من المانع ريبونوكلياز (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، و 20 μCi المشعة [35 S]، الميثيونين (Biomedicals النائب، سولون، أوهايو)، 20 مزيج رد الفعل ميكرولتر، 24 العازلة إعادة إعماره ميكرولتر و 24 ميكرولتر من E. كولاي المحللة.
- احتضان رد الفعل في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق إلى ما قبل دافئة رد فعل الترجمة. إضافة 1-2 ميكروغرام من مرنا إلى رد فعل الترجمة واحتضان في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- وقف رد فعل عن طريق وضع رد فعل الترجمة على الجليد.
3. عزل ببتيد الوليدة من رد الفعل في ترجمة المختبر
- لعزل RNCs، والطبقات رد فعل الترجمة على أعلى من 4.5 مل من 5-30٪ سكروز التدرج في 20 درجة الحموضة HEPES KOH-7 ملم0.5، 15 مم MgCl 2، 100 ملي خلات البوتاسيوم، 1 ملم وDTT بالطرد المركزي باستخدام بيكمان كولتر-SW55 تي الدوار في 41000 دورة في الدقيقة، 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
- بعد الطرد المركزي، والتدرج السكروز هو مجزأ إلى عزل السكان الريباسي مختلفة وسلاسل الناشئة المرتبطة بها. ويتم رصد الفصل باستخدام التدرج ISCO الكثافة برمجة النظام مع تسجيل مستمر في 254 نانومتر باستخدام كاشف ISCO UA-6 الامتصاصية.
- يتم تجميع جزء (ق) التي تحتوي على 70S ريبوسوم وتحليلها اعتمادا أخرى عن الهدف من هذه التجربة.
4. ملاحظة من البروتين منضم إلى الريبوسوم مع SDS PAGE تريس-tricine
للتحقق ما إذا كان البروتين SecM موسعة لا تزال تعلق على 70S الريبوسوم، تم جمع الكسور التدرج وعلاجها على النحو التالي:
- وقد عجلت من البروتين في كل جزء عن طريق إضافة حمض حمض التريكلوروسيتيك (TCA) إلى تركيز النهائي من 10٪ وحضنت في 4 overni درجة مئويةGHT.
- بعد حضانة بين عشية وضحاها، وكانت العينات طرد في ز X 14000 لمدة 15 دقيقة لتكوير البروتين. تمت إزالة التالية طاف الطرد المركزي وبيليه غسلها مرتين مع الأسيتون محلول يحتوي على: 1 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6 (4:1). وكان بيليه الهواء مزيد من جفت وحلت في المخزن التحميل SDS-PAGE.
- كان قد تم حل نموذج المعالجة وتحليلها من قبل تريس، tricine SDS-PAGE.
- بعد الكهربائي، والمجففة وثبتت المواد الهلامية، وذلك باستخدام فراغ جل صباغ ويتعرضون للتصوير الإشعاع الذاتي. وقد لوحظت توزيع البروتينية الوليدة باستخدام phosphoimaging.
5. ممثل النتائج
هنا نقدم تجربة تصف عزلة غلوبولين العدسة كامل طول غاما-B البقري ملزمة ثابت إلى 70S الريبوسوم. الشكل 1 يصور الخطوات المتبعة في عزلة البقري RNCs غلوبولين العدسة غاما-B. تم تمديد C-محطة للغلوبولين العدسة غاما-B عموما بنسبة 32 ر الأحماض الأمينية* تأكد من أن يقذف بروتين كامل طول للخروج من النفق الريباسي، وهذا يشمل أيضا تسلسل SecM المماطلة وضعت في محطة C-جدا من الانصهار ببتيد. في المختبر بعد الترجمة، وكانت معزولة في ريبوسوم 70S بواسطة الطرد المركزي المتدرج السكروز (الشكل 2.1). وبغية ضمان أن البروتين لا تزال ملتزمة بثبات إلى الريبوسوم، مجمعة على 70S التي تحتوي على كسور، المحلاة، عازلة تبادل وتعرض لجولة إضافية من الطرد المركزي المتدرج السكروز (الشكل 2.2). النتيجة المعروضة في الشكل 2 يشير بوضوح إلى أن SecM يمكن أن تحدث بكفاءة اعتقال متعدية للRNCs غلوبولين العدسة غاما-B.
الشكل 1. وجرى تمديد تفسير التخطيطي من الخطوات المتبعة في عزل RNCs. C-محطة من غلوبولين العدسة غاما-B البقري بنسبة 32 في تسلسل الأحماض الأمينية. هذا الموسعةC-محطة مناطق تشمل أيضا SecM تسلسل الاعتقال. تم استنساخ غاما-B غلوبولين العدسة مع تسلسل SecM في pIVEX 2.3 (T7 القائم) بلازميد. لنسخ في المختبر والخطي الحمض النووي القالب XbaI. واستخدمت كذلك قالب خطي لفي النسخ المختبر. يتم التعرف على T7 في قالب الحمض النووي بواسطة بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 أن المحاضر المصب غاما-B الجينات غلوبولين العدسة يقع من المروج T7. تمت تنقية مرنا باستخدام طريقة ترسيب كلوريد الليثيوم. واستخدمت بعد ذلك لتنقية مرنا في ترجمة المختبر. حضانة التالية، وكان رد فعل الطبقات ترجمة على أعلى من 5-30٪ التدرج السكروز وبالطرد المركزي في دوار بيكمان كولتر SW55-تي في 41000 دورة في الدقيقة، 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
الشكل 2. كانت مختلطة من العزلة غلوبولين العدسة غاما-B البقري RNCs ملزمة ثابت إلى الريبوسوم 70S. مرنا ميكروغرام 1 في 100 E. رد فعل ميكرولتر كولاي نظام استخراج S30 على النحو المذكور في المقطع بروتوكول مع 20 μCi [S 35]، الميثيونين وحضنت في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 15 دقيقة. حضانة التالية، وكان رد فعل الطبقات ترجمة على أعلى من 5-30٪ سكروز التدرج في 20 درجة الحموضة HEPES-KOH ملي 7.5، 15 مم MgCl 2، خلات البوتاسيوم 100 ملم، 1 ملم وDTT بالطرد المركزي في بيكمان كولتر-SW55 تي الدوار في 41000 دورة في الدقيقة، 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة. بعد الترسيب السرعة، وجرى تفريغ التدرج وتم الحصول على الريبوسوم الموالية جنيه. وسجلت البيانات بواسطة برنامج PeakTrak (ISCO التدرج كثافة التدرج نظام التجزئة). وكان هذا البروتين تم جمع الكسور، TCA عجل وحلها في تي 16.5٪، 6٪ C-T تريسricine PAGE جل 15. تم تجفيفها الجل ومعرضة للتصوير الإشعاع الذاتي. التعرض التالي تم مسحها الجل باستخدام الماسح الضوئي والتصوير إعصار 9410. الشكل 2.1 يبين أن كامل طول غاما-B غلوبولين العدسة موجودة في الكسور 70S الريبوسوم. وبالتالي، SecM تسلسل مماطلة يسمح للعزلة مستقرة البقري RNCs غلوبولين العدسة غاما-B. البيانات في الشكل 2.2 تشير بوضوح إلى أن RNCs المعزولة في حالة مستقرة في الواقع. في التجربة الحالية وكان يتم تجميع الكسور 70S بعد الجولة الأولى من الطرد المركزي المتدرج السكروز وتمت إزالة السكروز باستخدام Amicon الترا-4 وحدة تصفية الطرد المركزي (ميليبور)، يليه تبادل عازلة في محلول يحتوي على 20 ملي HEPES KOH-7.5 درجة الحموضة، 15 مم MgCl 2، 100 خلات البوتاسيوم مم، 1 DTT ملي. تعرض مزيد من هذه العينة إلى جولة إضافية من الطرد المركزي من خلال 5-30٪ التدرج السكروز ومجزأة. كان يعامل كل جزء وتحليلها كما هو الحال في الشكل 2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ والترجمة المختبر حاسمة. وقد استخدمنا المتاحة تجاريا في المختبر، ونسخ مقتطفات الترجمة وأنها تعطي نتائج فعالة وقابلة للتكرار، إذا ما تم تناوله بعناية. نوعية مرنا يمكن أن تؤثر على الترجمة، لذلك فإن من الأهمية القصوى لاختبار سلامة مرنا قبل استخدامه للترجمة في المختبر. فترة حضانة للترجمة في المختبر يختلف مع طول من البروتين. أيضا، ويمكن تعديل الوقت / سرعة الطرد المركزي وفقا لذلك، في حال، لم يتم حل جزء 70S الريباسي جيدا، وفصلها عن 50S. كذلك، ينبغي التعامل مع الريبوسوم المجمعات بروتين محدد بعناية لتجنب ريبونوكلياز تلوث. وعلاوة على ذلك، يجب مراقبة ظروف العازلة بعناية وكلاء شيلاتينغ التي قد خلابة 2 ملغ + يجب تجنبها.
SecM الاعتقالتسلسل، عند ترجمته يتفاعل مع البروتينات الريباسي L4 و L22 وكذلك الريباسي 23S في النفق الريباسي 7،8. وهناك عدد من مخلفات الحرجة، التي تشكل موضوع اعتقال SecM، F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 (بالخط العريض) على أهمية كبرى، وضمان كفاءة اعتقال متعدية. قد الطفرات، أو الحذف من هذه المخلفات حاسم يؤدي إلى تخفيف عبء الترجمة اعتقال استطالة 7،8. وهكذا، والحفاظ على تسلسل عزر اعتقال SecM F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 سليمة هو في غاية الأهمية لضمان أن تكون بروتين قيد الدراسة ستبقى ملتزمة بثبات إلى الريبوسوم.
ويمكن استخدام هذه التقنية لتحليل بنية مشتركة متعدية وسيطة، وشارك في متعدية للطي من البروتينات المختلفة. فقد تم مؤخرا استخدمت بنجاح لتحديد بالضبط يا بنيةو الريبوسوم متجهة عدة سلاسل الوليدة بمساعدة الرنين المغناطيسي النووي 10-11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا هذه التقنية يمكن استخدامها لتوليد الببتيدات الوليدة من أحجام محددة سلفا لتحليل تفاعلاتها التعليم العالي مع البروتينات الإكسسوارات، والعوامل المساعدة أو يغاندس.
وثمة نهج بديل لإنتاج مجمعات RNCs تنطوي على استخدام mRNAs اقتطاع تفتقر كودون التوقف. وقد تم هذا النهج المستخدمة على نطاق واسع من قبل العديد من الباحثين لدراسة طي البروتين المشترك متعدية انظر على سبيل المثال 12،16. ومع ذلك، فإنه لديها عدد من العيوب. لا يمكن هذا النهج أن تستخدم في الجسم الحي، وإشكالية أيضا للاستخدام في المختبر مع إ. كولاي استخراج بسبب وجود في E. كولاي من نظام SsrA أن يتوسط إضافة العلامة الببتيد C-محطة (AANDENYALAA) للبروتينات ترجمة mRNAs من دون توقف كودونات في الإطار، مما أدى إلى تدهورها 17. لذا، في حالة في وقت لاحق، على المرء أن استخدام reconsti تماماtuted النظام و / أو نظام، وتفتقر / قمع SsrA العنونة الآلات. SecM الموجهة المماطلة غير فعالة وفريدة من نوعها كما ثبت لانتاج المجمعات الريبوسوم المتوقفة في والمجراة في المختبر مع كفاءة مماثلة تقريبا 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O.
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J.
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S.
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
