Summary
我们在这里描述，现在经常使用的孤立稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNC）中的技术。这种技术发现了17个氨基酸长SECM“逮捕序列”可以停止在原核翻译延伸的优势（
Abstract
广泛的研究提供了充足的证据表明，细胞中蛋白质折叠是合作转化过程1-5。不过，确切的途径来实现其功能的形式在合作转化折叠多肽链的如下仍然是一个谜。为了了解这个过程，以确定确切的翻译合作的折叠中间体构象，它是必不可少的开发技术，允许携带预定大小的新生链的RNC，让他们进一步的结构分析的隔离。
SECM（分泌显示器）是一个170个氨基酸E.大肠杆菌蛋白，调节下游SECA（SECM SECA操纵6分泌驾驶）在ATP酶的表达。 nakatogawa和伊藤最初发现了17个氨基酸组成的长序列中的SECM蛋白的C端区域（150-FSTPVWISQA QGIRAĞ的P-166）是足够的和必要的造成拖延在Gly165 SECM伸长，从而产生肽，甘氨酰-tRNA的稳定势必核糖体P位7-9。更重要的是，它被发现，这17个氨基酸的长序列可以融合到几乎所有的全长和/或截断，从而使生产的RNC携带新生链的预定大小7蛋白C-末端。因此，当融合或插入到目标蛋白质，SECM拖延序列产生的多肽链延伸逮捕，并在体内产生稳定在大肠杆菌中的RNC 大肠杆菌细胞和无细胞系统在体外 。进一步利用蔗糖密度梯度离心法分离的RNC。
孤立的RNC可以用来分析合作翻译的折叠中间体的结构和功能特点。最近，这项技术已成功地用于获得多个核糖体结合10,11新生链的结构见解。在这里，我们描述了隔离牛γ-B晶体RNCS融合SECM和在体外翻译系统生成的。
Protocol
1。 DNA模板制备及体外转录
- 感兴趣的基因被克隆在任何T7和/或如SP6启动基于质粒。为了获得利益的RNC，C-末端的多肽的目标是扩大加入逮捕诱导序列的SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7。为了确保感兴趣的多肽片段，将挤出的核糖体隧道，目标蛋白C-末端的一部分被延长至少30个氨基酸12-14。可以推出一个灵活的富含甘氨酸，丝氨酸连接器之间的蛋白质和SECM逮捕序列，以避免任何可能的构象约束。
- 在体外转录，模板DNA应限制酶切割的ORF下游线性。一个需要验证完整的线性质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳上运行酶切产品。
- 线性血浆ID被进一步用于体外转录反应。不同浓度的DNA模板可以进行测试，以确定最佳的DNA浓度在体外转录。一般用Ambion公司的MEGAscript高产转录试剂盒（Ambion公司/生命科技，大岛，NY），1微克的线性的DNA产生40-60微克的mRNA 在体外转录完成后，制造商的指示（Ambion公司/生命科技，大岛，NY） 。
- 继在体外转录，mRNA的氯化锂沉淀纯化，根据制造商的指令（Ambion公司的MEGAscript高产转录试剂盒，Ambion公司/生命科技，大岛，NY）。
- 使用丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳进一步证实mRNA的完整性。
（2） 在体外翻译
在体外翻译使用的RTS 100大肠杆菌兴业套件（5总理，盖瑟sburg，MD）按照以下步骤：
- 准备100μL 体外翻译反应下列制造商的指示。简言之，添加核酸自由水24μL氨基酸混合物减蛋氨酸（1毫米），10个单位的核糖核酸酶抑制剂（Invitrogen公司/生命科技，大岛，NY），20微居里的放射性[35]-蛋氨酸（MP的Biomedicals梭伦，俄亥俄州），20μL反应混合物，24μL重组缓冲区和24μL 大肠杆菌大肠杆菌裂解物。
- 在30°C孵育5分钟预先的翻译反应热烈反应。新增1-2微克的mRNA的翻译反应，并在30°C孵育10-15分钟。
- 停止反应，放置在冰的翻译反应。
3。分离新生多肽在体外翻译反应
- 为了隔离的RNC，翻译反应是分层4.5毫升5-30％蔗糖梯度上，在20毫米肝素钠，氢氧化钾pH值7.5，15毫米氯化镁 ，醋酸钾100毫米，1毫米数码地面离心41,000 RPM使用Beckman Coulter公司的SW55钛转子，4℃2小时Ç。
- 蔗糖密度梯度离心后，分馏来隔离不同的核糖体的人口和相关的新生链。分离使用连续录音使用职业分类UA-6吸光度探测器在254纳米的职业分类可编程密度梯度系统监测。
- 分数（S），含70S核糖体根据实验的目的，进一步收集和分析。
4。观察蛋白质势必核糖体的Tris-甘氨酸SDS-PAGE
要进行检查，，SECM扩展蛋白是否仍然连接到70S核糖体，梯度馏分收集如下处理：
- 在每个部分的蛋白加入终浓度10％三氯乙酸（TCA）沉淀和培养在4°ÇoverniGHT。
- 过夜培养后，离心15分钟沉淀蛋白质14,000 XĞ。以下离心弃上清和沉淀两次洗涤液中含有丙酮：1毫米的Tris-HCl pH值7.6（4:1）。沉淀进一步风干，在SDS-PAGE上样缓冲液溶解。
- 处理后的样品被解决的Tris-甘氨酸SDS-PAGE电泳分析。
- 电泳后，凝胶固定，干燥，采用真空凝胶代尔受到显影。新生多肽的分布观察使用phosphoimaging。
5。代表结果
在这里，我们提出了一个实验描述全长牛- B伽玛稳定约束的70S核糖体的晶体的隔离。 图1描述了隔离牛γ-B晶体的RNC中涉及的步骤。 γ-B晶体的C-末端延长整体ţ由32个氨基酸Ø确保核糖体隧道，全长蛋白挤出出，这也包括放置在C-末端多肽的融合非常的的SECM拖延序列。继在体外翻译，70S核糖体分离蔗糖梯度离心法（图2.1）。为了确保保持稳定绑定到核糖体蛋白质，含有分数的70S汇集，交换脱盐，缓冲和受到额外蔗糖密度梯度离心轮（图2.2）。在图2的结果清楚地表明，SECM能有效地诱导转化逮捕的γ-B晶体的RNC。
图1。原理解释隔离的RNC所涉及的步骤。牛γ-B晶体的C-末端延伸，由32个氨基酸序列。这个扩展C-端区域，还包括SECM逮捕序列。 γ-B与晶状体SECM序列克隆在pIVEX 2.3（T7启动基于）质粒。 在体外转录模板DNA线性XbaI位。进一步用于体外转录线性模板。在DNA模板的T7 T7 RNA聚合酶转录的伽马 - B晶体蛋白基因的T7启动子下游，位于确认。使用氯化锂沉淀法纯化表达。然后用纯化的mRNA在体外翻译。以下孵化，翻译反应5-30％蔗糖梯度上呈层状和Beckman Coulter公司的SW55钛转子离心41000转，4℃2小时。
图2。牛γ-B晶体隔离RNCS稳定约束的70S核糖体。1微克的mRNA混合100μl反应E.在协议部分中提到的20微居里[35 S的 大肠杆菌 S30的提取物系统-蛋氨酸，并在30°C孵育15分钟。以下孵化，翻译反应5-30％蔗糖梯度上呈层状，在20毫米肝素钠，氢氧化钾pH值7.5，MgCl 2的 15毫米，100毫米醋酸钾，1毫米数码地面电视和在贝克曼SW55钛转子离心41,000转速，4℃2小时。渐变的速度沉降，卸载和核糖体亲乐获得。由PeakTrak计划（职业分类梯度密度梯度分离系统）录得的数据。馏分收集，蛋白三氯乙酸沉淀和16.5％T的解决，6％C处的Tris-T的ricine PAGE凝胶15。凝胶干燥和为显影暴露。暴露后的凝胶台风9410成像扫描仪扫描。 图2.1显示了全长伽马-B的晶体是目前在70S核糖体组分。因此，SECM拖延序列允许稳定的牛γ-B晶体的RNC的隔离。 图2.2中的数据清楚地表明，孤立的RNC确实稳定。在目前的实验蔗糖密度梯度离心后的第一轮70S组分汇集和使用Amicon超4离心过滤单元（Millipore公司），由交换缓冲区中含有肝素钠氢氧化钾pH值7.5，15毫米20毫米的解决方案，其次蔗糖被删除MgCl 2的 100毫米醋酸钾，1毫米的DTT。这个范例是进一步受到离心通过额外的5-30％蔗糖梯度和分馏一轮。像图2.1中，每个部分的处理和分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
对于重复性的结果，使用的组件， 在体外转录和翻译的质量和浓度是关键。我们已经用市售的体外转录和翻译提取的，他们给高效率和可重复性的结果，如果小心处理。质量可以影响mRNA的翻译，所以它是最重要的测试之前使用它在体外翻译的mRNA的完整性。 体外翻译的孵化时间随长度的蛋白质。此外，离心时间/速度可相应调整的情况下，70S核糖体的分数没有得到很好的解决，从50S分离。此外，核糖体结合蛋白复合物，应当谨慎处理，以避免RNase污染。此外，应仔细监测缓冲条件和螯合剂可能螯合镁+应避免。
SECM逮捕序列后，将其翻译与核糖体蛋白L4和L22的以及在核糖体23S rRNA的隧道7,8交互。一个关键的残留物，构成的SECM逮捕图案，数，F XXXX的威斯康星，XXXX GIRAGP 7（黑体字）是巨大的重要性，确保平移逮捕的效率。这些关键残基突变，或缺失可能会导致翻译延伸逮捕7,8救济。因此，保持的SECM逮捕图案的序列F XXXX的威斯康星 XXXX GIRAGP 7完好绝对是至关重要的，以确保所研究的蛋白质会保持稳定约束的核糖体。
这种技术可以用于合作翻译的中间体和合作翻译的各种蛋白质折叠的结构分析。它最近已成功地用于以确定确切的结构Øf几个核糖体结合，与帮助核磁共振10-11新生链。此外，这项技术还可以被用来生成分析高等教育辅助蛋白，辅助因子或配体相互作用的预定大小的新生肽。
一种替代的方法来产生的RNC的复合物，将涉及使用截断缺乏终止密码子的mRNA。这种方法已广泛应用于许多学者合作翻译的蛋白质折叠研究， 如12,16。但是，它有一些弊端。这种方法可以在体内不被聘用，并在体外与E.使用问题大肠杆菌提取由于在大肠杆菌中的存在大肠杆菌 SSRA系统介导的C-端肽标签（AANDENYALAA）的蛋白质翻译从没有框架的终止密码子的mRNA，导致其降解17。因此，在后一种情况下，使用完全reconstituted系统和/或系统，缺乏/抑制SSRA标记机械。 SECM的指示拖延是有效的和独特的，因为它已被证明，生产停滞的核糖体复合物在体内和体外，几乎类似的效率18。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由人类前沿科学计划授予RGP0024。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O.
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J.
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S.
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
