Summary
Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM "seqüência de prisão" pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica (
Abstract
A pesquisa extensiva tem forneceram evidências que sugerem que a proteína amplos dobrando na célula é um processo de co-translacional 1-5. No entanto, o caminho exato que cadeia polipeptídica segue durante a co-traducional dobrar para atingir sua forma funcional ainda é um enigma. A fim de compreender este processo e para determinar a conformação exacta dos intermediários de co-translacionais de dobragem, é essencial ao desenvolvimento de técnicas que permitem o isolamento de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados para permitir a sua posterior análise estrutural.
SECM (monitor secreção) é um aminoácido 170 E. coli proteína que regula a expressão do jusante SecA ATPase (condução secreção) no operão SECM-seca 6. Nakatogawa e Ito originalmente descobriu que uma sequência de aminoácidos 17 de comprimento (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) na região C-terminal da proteína SECM são necessários e suficientes paracausar bloqueamento dos alongamento SECM em Gly165, produzindo assim peptidil-glicil-tRNA estavelmente ligado ao ribossoma P-site 7-9. Mais importante, verificou-se que esta sequência de aminoácidos 17 de comprimento pode ser fundido com o terminal C de virtualmente qualquer proteína de comprimento completo e / ou truncado, permitindo assim a produção de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados 7. Assim, quando fundidos ou inserida na proteína alvo, SECM sequência stalling produz prisão do alongamento da cadeia polipeptídica e gera RNC estáveis tanto in vivo em E. células de Escherichia e in vitro num sistema isento de células. Centrifugação em gradiente de sacarose é ainda utilizado para isolar RNC.
Os RNC isolados podem ser utilizados para analisar as características estruturais e funcionais dos intermediários de co-translacionais dobráveis. Recentemente, esta técnica tem sido usada com sucesso para obter insights sobre a estrutura de vários ribossomas ligados a cadeias nascentes 10,11. Aqui nós descrevemos o isolamento de bovinos Gamma-B cristalina RNCS fundido a SECM e gerado em um sistema de tradução in vitro.
Protocol
1. Preparação de ADN de modelo e transcrição in vitro
- O gene de interesse é clonado em qualquer e T7 / ou, por exemplo SP6 promotor baseado plasmídeo. Para obter RNC de interesse, C-terminal do polipéptido alvo é estendido por adição de sequência de captura indutor do SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. A fim de assegurar que o fragmento de polipéptido de interesse será extrudir para fora do túnel ribossomal, a parte C-terminal da proteína alvo deve ser ampliada de pelo menos 30 aminoácidos 12-14. Um linker flexível Glicina-Serina rica pode ser introduzido entre a proteína ea sequência de captura SECM para evitar quaisquer constrangimentos conformacionais possíveis.
- Para transcrição in vitro, o DNA modelo deve ser linearizado com a enzima de restrição de corte a jusante da ORF. Uma das necessidades para verificar a linearização completa do DNA de plasmídeo, executando o produto da digestão de restrição em electroforese em gel de agarose.
- O plasma linearizadaid é ainda utilizado para reacção de transcrição in vitro. Concentração diferente de ADN molde pode ser testado para identificar a concentração de DNA óptima necessária para transcrição in vitro. Geralmente com Kit Ambion da transcrição de alto rendimento MEGAscript (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 ug de DNA linearizado produz 40-60 ug de mRNA. Transcrição in vitro é efectuado de acordo com as instruções do fabricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Após transcrição in vitro, o mRNA é purificado por precipitação com cloreto de lítio de acordo com as instruções do fabricante (Kit Ambion da transcrição MEGAscript de alto rendimento Ambion, / Life Technologies, Grand Island, NY).
- integridade do mRNA é ainda verificado por electroforese em acrilamida ou utilizando géis de agarose.
2. Tradução in vitro
Para a tradução in vitro utilizando o RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) siga os passos abaixo:
- Prepare-se 100 ul de instrução in vitro fabricante reação tradução seguinte. Resumidamente, em água livre de nuclease adicionar 24 ul mistura de ácido amino menos metionina (1 mM), 10 unidades de inibidor da ribonuclease (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi de radioactivos [35 S] Biomedicals-metionina (MP, Solon, OH), 20 ul da mistura da reacção, 24 ul de tampão Reconstituição e 24 ul de E. coli lisado.
- Incubar a reacção a 30 ° C durante 5 min de pré reacção a quente de tradução. Adicionar 1-2 ug de mRNA para a reacção de tradução e incubar a 30 ° C durante 10-15 min.
- Parar a reacção através da colocação da reacção de tradução em gelo.
3. Isolamento de polipéptido nascente in vitro a partir de reacção de tradução
- Para isolar RNC, a reacção de tradução é colocado em camadas sobre 4,5 ml de gradiente 5-30% de sacarose em 20 mM pH HEPES-KOH 70,5, 15 mM de MgCl2, 100 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT e centrifugou-se utilizando Beckman SW55 Coulter-rotor Ti a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas.
- Após a centrifugação, o gradiente de sacarose é fracionado para isolar diferentes populações ribossômico e associados cadeias nascentes. A separação é monitorizado utilizando o sistema de gradiente ISCO programável Densidade com gravação contínua a 254 nm usando um detector de ISCO UA-6 absorvância.
- A fração (s) contendo ribossomos 70S são coletadas e analisadas mais, dependendo do objetivo do experimento.
4. Observação de proteína ligada ao ribossomo com SDS-PAGE Tris-tricina
Para verificar, se a proteína SECM estendida permanece ligado aos ribossomas 70S, as fracções de gradiente foram recolhidas e tratadas como se segue:
- Proteína em cada fracção foi precipitado por adição de ácido tricloroacético (TCA) para uma concentração final de 10% e incubadas a 4 ° C overnight.
- Após incubação durante a noite, as amostras foram centrifugadas a 14.000 X g durante 15 min a pelete a proteína. Após centrifugação o sobrenadante foi removido eo sedimento lavado duas vezes com acetona solução contendo: 1 mM de Tris-HCl pH 7,6 (04:01). Sedimento foi ainda mais ar seco e dissolvido em SDS-PAGE de tampão de carregamento.
- A amostra tratada foi resolvido e analisadas por Tris-tricina SDS-PAGE.
- Após a electroforese, os géis foram fixados, secou-se utilizando vácuo gel Dyer e submetido a autorradiografia. A distribuição de polipéptidos nascentes foram observadas utilizando phosphoimaging.
5. Os resultados representativos
Apresentamos aqui uma experiência que descreve o isolamento do full-length bovina Gamma-B cristalina estavelmente ligado aos ribossomas 70S. A Figura 1 ilustra os passos envolvidos no isolamento de bovinos RNC Gamma-B cristalina. O C-terminal da crystallin Gamma-B foi estendida geral por 32 t de aminoácidosó assegurar que a extrusão de comprimento total de proteína para fora do túnel ribossomal, o que também inclui a sequência SECM stalling colocado no muito C-terminal do polipéptido de fusão. Após a tradução in vitro, os ribossomas 70S foram isolados por centrifugação de gradiente de sacarose (Figura 2.1). A fim de assegurar que a proteína permanece estavelmente ligado ao ribossoma, as fracções contendo 70S foram reunidas, tampão, dessalinizado trocados e submetido a uma rodada adicional de centrifugação em gradiente de sacarose (Figura 2.2). O resultado apresentado na Figura 2 sugere claramente que SECM pode eficientemente induzir a apreensão de translação das RNC Gamma-B cristalina.
Figura 1. Explicação esquemático dos passos envolvidos no isolamento de RNC. Terminal C de bovino Gamma-B cristalina foi prolongada por 32 sequência de aminoácidos. Este estendidaC-terminais regiões também inclui sequência de captura SECM. Gamma-B cristalina com seqüência SECM foi clonado em pIVEX 2,3 (T7 based) plasmídeo. Para transcrição in vitro do DNA molde foi linearizado por Xbal. Modelo linearizado foi ainda utilizado para transcrição in vitro. A T7 no molde de ADN é reconhecido por T7 RNA polimerase que transcreve a jusante Gamma-B do gene crystallin localizados do promotor T7. mRNA foi purificado utilizando lítio método de precipitação de cloreto. O mRNA purificado foi então usado para tradução in vitro. Após a incubação, a reacção de tradução foi derramado por cima de gradiente 5-30% de sacarose e centrifugou-se em Beckman SW55 Coulter-rotor Ti a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas.
Figura 2. Isolamento de bovinos Gamma-B cristalina RNCS estável ligado ao ribossomo 70S. MRNA mg 1 foi misturado em 100 l reação E. coli Sistema Extracto S30 como mencionado na secção protocolo com 20 uCi [35 S]-metionina e incubadas a 30 ° C durante 15 min. Após a incubação, a reacção de tradução foi derramado por cima de gradiente 5-30% de sacarose em 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM de MgCl2, 100 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT e centrifugou-se em Beckman SW55 Coulter-rotor Ti a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. Após sedimentação velocidade, o gradiente foi descarregado eo ribossoma pró le foi obtido. Os dados foram registrados pelo programa PeakTrak (gradiente de densidade ISCO sistema de fracionamento gradiente). As fracções foram recolhidas, a proteína foi precipitada TCA e resolvidos em t 16,5%, 6% C Tris-Tricine gel PAGE 15. O gel foi seco e exposto para autorradiografia. Após a exposição do gel foi digitalizado utilizando imagens do scanner Typhoon 9410. Figura 2.1 mostra que o full-length Gamma-B cristalina está presente em frações 70S dos ribossomas. Assim, SECM sequência stalling permite o isolamento dos estáveis bovina RNC Gamma-B cristalina. Os dados da Figura 2.2 indicam claramente que os isolados RNC são realmente estável. No experimento actual das fracções 70S após a primeira ronda de centrifugação em gradiente de sacarose foram reunidas e da sacarose foi removido utilizando Amicon Ultra-4 unitário centrífuga de filtro (Millipore), seguido por tampão de troca em solução contendo 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT. Esta amostra foi submetido a uma rodada adicional de centrifugação através de gradiente 5-30% de sacarose e fraccionado. Cada fracção foi tratado e analisados como na Figura 2.1.
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Discussion
Para obter resultados reprodutíveis, a qualidade ea concentração dos componentes utilizados para transcrição in vitro e tradução são críticos. Usámos comercialmente disponível in vitro transcrição e extractos de tradução e dão resultados reprodutíveis e eficientes, se manuseados com cuidado. Qualidade de ARNm pode afectar a tradução, por isso, é de extrema importância para testar a integridade do mRNA antes de o utilizar para tradução in vitro. Tempo de incubação para tradução in vitro varia com o comprimento da proteína. Além disso, o tempo / velocidade de centrifugação pode ser ajustada em conformidade, no caso, a fracção de 70S ribosomal não é bem resolvido e separados dos 50S. Além disso, ribossomo complexos de proteínas ligadas devem ser manuseadas com cuidado para evitar a contaminação RNase. Além disso, condições de tampão devem ser cuidadosamente monitorizados e agentes quelantes que podem quelato Mg 2 + deve ser evitada.
Prisão SECMsequência, após a sua tradução interage com as proteínas ribossómicas L4 e L22, bem como rRNA 23S no túnel ribossomal 7,8. Um número de resíduos críticas, constituindo o motivo prisão SECM, F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 (em negrito) são de imensa importância, assegurando a eficiência da prisão de translação. As mutações ou deleções destes resíduos críticos podem levar ao alívio do alongamento de detenção tradução 7,8. Assim, a manutenção da sequência do motivo de detenção SECM F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 intacto é absolutamente essencial para assegurar que a proteína em estudo que permanecem estavelmente ligado ao ribossoma.
Esta técnica pode ser utilizada para análise da estrutura de co-translacionais intermediários e co-translacional de dobragem de várias proteínas. Foi recentemente utilizada com sucesso para determinar a estrutura exacta of vários ribossomas ligados a cadeias nascentes com a ajuda de RMN 10-11. Além disso, esta técnica pode também ser usado para gerar péptidos nascentes de tamanhos pré-determinados para análise das suas interacções terciárias com proteínas acessórias, cofactores ou ligandos.
Uma abordagem alternativa para produzir complexos RNC iria envolver a utilização de mRNAs truncadas que faltam codão de paragem. Esta abordagem tem sido amplamente utilizado por muitos investigadores para estudar o enrolamento de proteínas co-translacional ver, por exemplo 12,16. No entanto, tem um certo número de inconvenientes. Esta abordagem não pode ser empregue in vivo e também problemático para a utilização in vitro com E. coli extrair devido à presença em E. coli do sistema SsrA que medeia de adição do péptido C-terminal tag (AANDENYALAA) às proteínas traduzidas a partir de mRNAs sem codões em grelha-stop, levando a sua degradação 17. Portanto, no caso mais tarde, um tem de usar uma reconstituição completamentetuído sistema e / ou um sistema, sem / supressora máquinas SsrA-marcação. SECM-dirigido stalling é eficiente e único, tal como foi demonstrado para produzir complexos de ribossomas paralisadas in vivo e in vitro com uma eficiência quase semelhante 18.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Programa Ciência das Fronteiras Humanas concessão RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
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