דגם האדם החצוצרה לחקירות Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefan Jerchel¹, Gudrun Knebel², Peter König², Michael K. Bohlmann³, Jan Rupp^1,4

¹Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, ²Institute of Anatomie, University of Lübeck, ³Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, ⁴Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

אנו מתארים

Abstract

זיהומים בדרכי המין עם trachomatis כלמידיה (trachomatis ג) הם השכיח ביותר למחלות המועברות במגע מיני בקרב נשים ברחבי העולם. אישור התמדה בלתי יעיל או של פתוגנים עלולים להוביל עולה דלקות בדרכי המין העליון אמורים לגרום לנזק דלקתית כרונית ^1,2 רקמות נגועים. כתוצאה מכך, sequelae קליני קשה כמו מחלה דלקתית של אגן הירכיים (PID), חסימת חצוצרות ו פוריות עלולה להתרחש ^3,4.

רוב המחקר עם ג trachomatis נערך על שורות תאים אפיתל (למשל הממולחים, 2 תאים והלה-229) או בעכברים. עם זאת, כמו התרבות תאים מבוססי מודלים, הם עושים לא משקפים את הפיזיולוגיה של רקמת יליד ולא פתופיזיולוגיה של C. המין trachomatis זיהומים בדרכי in vivo ^5. מגבלות נוספות ניתנות על ידי העובדה כי איתות מפלי מרכזיים (למשל IFN-γ mediatאד Jak / מסלול איתות STAT) כי הצמיחה לשלוט כלמידיה תאיים שונים באופן בסיסי בין עכברים ובני אדם ^6,7. אנחנו ואחרים הקימו ולכן האיבר כולו השחלה מודל צינור לחקור אינטראקציות ישירות בין ג trachomatis האדם תאים צינור השחלה לשעבר vivo ^8,9.

לשם כך, החצוצרות אדם מן הנשים שעברו כריתת רחם נאספו נגוע ג trachomatis serovar ד זיהום בתוך 24 שעות הודעה, הדגימה שבו ניתח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי לזהות trachomatis כלמידיה בתיווך נזק אפיתל, כמו גם ג הכללת trachomatis היווצרות של רקמת השחלה.

Protocol

1. הכנת מאגר כלמידיה Serovar trachomatis D

1. להדביק confluent 175 ס"מ ² תאים התרבות בקבוק המכיל הלה-229 תאים עם 4 מ"ל ג trachomatis פ SPG המאגר.
2. דגירה למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הרעידות קבוע.
3. הוסף 20 מ"ל DMEM עם FCS 10% ו 240 Cycloheximide μl.
4. דגירה של חממה humidified עבור H 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
5. הוסף 5 מ"ל חרוזי זכוכית סטריליות, לוחצים חזק לנתק ולהרוס ג trachomatis מחסה הלה-229 תאים.
6. איסוף supernatant ולהוסיף עוד 5 מ"ל של חרוזי זכוכית סטריליים.
7. רוק שלוש פעמים דקות 1 להשמיד את כל-229 הלה תאים ושחרור ג trachomatis.
8. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 rpmi ו 4 ° C כדי לסלק פסולת תאית.
9. איסוף supernatant לזיהום של 8 עד 10 175 התרבות ² ס"מ תא צלוחיות גרם confluentrown עם הלה 229 תאים.
10. דגירה כל בקבוק עם חיץ 4 מ"ל SPG ו 4 supernatant מ"ל מזיהום הקודם למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם הרעידות קבוע.
11. אחרי שעה מוסיפים 15 מ"ל DMEM עם FCS 10% ו 230 cycloheximide μl ואחריו הדגירה 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
12. הוסף 5 מ"ל חרוזי זכוכית מעוקרים, ללחוץ לנתק ולהרוס ג trachomatis מחסה הלה-229 תאים.
13. איסוף supernatant ולהוסיף עוד 5 מ"ל של חרוזי זכוכית סטריליים.
14. רוק שלוש פעמים דקות 1 להשמיד את כל-229 הלה תאים ושחרור ג trachomatis.
15. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 rpmi ב 4 ° C כדי לסלק פסולת תאית.
16. איסוף supernatant.
17. מילוי 40 מ"ל של supernatant ב -50 צינורות מ"ל פלקון, צנטריפוגות דקות 99 עם 11000 rpmi.
18. לאחר צנטריפוגה לבטל supernatant ולשטוף גלולה עם 1 מ"ל SPG המאגר.
19. Homogenizeגלולה ב SPG 1 מ"ל ו - 20 μl aliquot ב 1, 5 מ"ל חנות Eppendorf צינור, ב -70 ° C עד השימוש. הפעילות הביולוגית של מלאי מוכן אושר מודל הוקמה הלה-229 זיהום התא.

2. הכנת החצוצרות האדם

1. החנות אדם צינורות השחלה (HFT) של נשים שעברו כריתת רחם מיד לאחר הניתוח RPMI FCS המכיל 5% ללא אנטיביוטיקה ב 4 ° C עד הכנה. פרוטוקול שאושר על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת ליבק (09-153). הנשים שנכללו במחקר (גיל 34 עד 53) ללא היסטוריה של ג לפני trachomatis זיהום. רקמות של החצוצרות נאסף על עיקור peripartum על פי בקשה של האם במהלך חלקים קיסרי או במהלך כריתת רחם עקב שרירנים ברחם סימפטומטיים בשלב הלוטאלי. HFT הכל נבדקו שלילי ג trachomatis ידי PCR.
2. לנתח HFT בצלחת פטרי שמכילה RPMI עם5% FCS ללא אנטיביוטיקה. במהלך עיבוד כל רקמה יש שקוע התקשורת כדי למנוע התייבשות.
3. מנותקים וזורקים רקמות רקמת חיבור והרסו במהלך הניתוח.
4. לאחר דיסקציה לפתוח את HFT בזהירות עם אזמל קטן.
5. להמשך הניסויים להכין חתיכות של רקמות בגודל של 0.5 ס"מ X 0.5 ס"מ עד 1 ס"מ x 1 ס"מ.
6. עבור הדגימה חנות זיהום HFT ב 1 מ"ל RPMI המכיל FCS 5% ללא אנטיביוטיקה. דגימות HFT נדבקו 5.5x10 ⁵ IFU (הכללה יוצרי יחידות) של C. trachomatis.
7. דגירה הדגימה HFT ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו - 21% מ _2, כמו גם 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו - 2% O ₂ במשך 24 שעות.
8. לאחר זמן דגירה לאסוף הדגימה חנות מקבע של מונטי לפחות שלושה ימים ב 4 ° C עד הכנה SEM / TEM.

3. אופן ההכנה של הדגימה HFT עבור TEM

1. עבורTEM להסיר דגימה מן מקבע של מונטי וחותכים 2 X 2 מ"מ עד 4 x 5 מ"מ חתיכות. רקמת הנותרים יכולים לשמש עבור SEM.
2. לשטוף את חתיכות עם חיץ נתרן cacodylate, pH 7.35 עבור H 1.
3. דגירה של% 1 (W / V) tetroxide אוסמיום ב אקווה dest. בן לילה.
4. הסר tetroxide אוסמיום עודף ידי שטיפה דקות 6x5 במאגר נתרן cacodylate, pH 7.35.
5. הסרה של מים על ידי דוגרים בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול במים (V / V) (30% עבור 2 שעות, 40% עבור 2 שעות, 50% עבור 2 שעות, 60% עבור 2 שעות, 70% בין לילה, 80% עבור 2 ח, 90% עבור H 1, 95% עבור H 1, 100% עבור H 1.
6. לשטוף את אתנול דקות 2 15 x ב פרופילן אוקסיד ולאחר מכן להעביר תערובת של 50% (V / V) araldite מוכן טרי (כולל כל הרכיבים) על פרופילן דגירה בן לילה.
7. העברה araldite מוכן טרי (כולל כל הרכיבים) עבור שעות לפחות 1.
8. להעביר תבניות הטבעת שטוחים וממלאים araldite.
9. בואו araldite להקשות עללפחות 48 שעות ב 60 ° C
10. לאחר חיתוך של מדגם מוטבע לחתוך חלקים דקים חצי (700 ננומטר) על ultramicrotome באמצעות סכינים זכוכית או סכין יהלום histo ואת כתם עם כתם של ריצ'רדסון.
11. גזור דקים חלקים (כ -70 ננומטר) באמצעות סכין יהלום והעברה רשתות נחושת (למשל 150 רשת הריבוע).
12. כתם דקים חלקים עם אצטט uranyl 0.5% (W / V) של אקווה dest. עקבו ב -3% (w / v) ציטראט להוביל אקווה dest. ב שטיינר בסעיף אוטומטי. לחלופין, ניתן לזהות קטעים מוכתמת באופן ידני על ידי השארת רשתות 15 דק 'על פתרון centrifuged רווי של אצטט uranyl ב אקווה dest. ואחריו ציטראט עופרת 0.3% (W / V) של אקווה dest.

4. הכנת הדגימה HFT עבור SEM

1. עבור SEM להסיר דגימה מן מקבע של מונטי, המזרח עם אפיתל כלפי מעלה על 1.5 x גיליון 1 הפקק ס"מ ולתקן המיקום באמצעות מחטים חרקים.
2. להעביר את הדגימה על הפקק כדי סלי מתכת מתאימיםלשטוף למשך 30 דקות במאגר נתרן cacodylate, pH 7.35.
3. הסרה של מים על ידי דוגרים הדגימה ריכוז גדל והולך של אצטון / מים תערובות (V / V) 30% עבור 6 שעות, 40% עבור 6 שעות, 60% עבור 8 שעות, 70% בין לילה, 80% עבור 2 שעות, 90% עבור 2 שעות ו - 100% על הלילה (להיות זהירים מאוד כדי לשמור על הדגימה שקוע ברציפות).
4. העברה אצטון 100% טרי הדגימה יבש על ידי ייבוש נקודה קריטית (טמפרטורה 40 ° C, לחץ 80 בר).
5. הסר מחטים, הפקק הדגימה דבק עם האפיתל כלפי מעלה בהר הדגימה SEM מצוידים הכרטיסייה פחמן מוליך באמצעות מלט פחמן מוליך. השתמש כסף מוליך נוזלי כדי לשפר את המוליכות בין הר ואת הכרטיסייה פחמן מוליך.
6. להכין ציפוי מוליך, זהב או פלטינה ופלדיום של הדגימה באמצעות גמגום coater.

5. מכתים סעיפים דקים דו עם הכתם של ריצ'רדסון

1. בואו חלקים דקים חצי יבש בשקופית.
2. כתם חלקים עם מכתים פתרון על 60 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות.
3. להתרחץ אקווה dest.
4. קטעים יבשים coverslip.

6. נציג תוצאות

בתוך המודל הדבקת בני אדם השחלה צינור הצלחנו לדמיין הבדלים מורפולוגיה אפיתל בין שאינם נגועים שולטת (איור 1) ו ג trachomatis - שפופרות נגועות (איור 2) בתנאי normoxic. ההבדלים המורפולוגיים האופייניים משתמעת הפתוגן הנגרמת הנפיחות תמוגה של תאים החצוצרה אפיתל כי לא ניתן היה לזהות שאינם נגועים שולטת. באמצעות סעיפים דקים חצי אלקטרונים מיקרוסקופית הילוכים הצלחנו להוכיח ג תאיים הכללת trachomatis היווצרות in vivo לשעבר נגוע צינור האדם רקמות השחלה (איור 3, 5), אך לא בלתי נגועים שולטת (איור 4). כמו ריכוז החמצןtions בדרכי המין הנשי כבר נמוכה בתנאים פיסיולוגיים ^11, ולהפחית עוד יותר בתהליך דלקתי כמו כן, אנו לחקור המודל שלנו בתנאי חוסר חמצן. תוצאות ראשוניות מצביעות מודל שימושי לנתח גידול הצאצאים כלמידיה ותחת חמצן בריכוזים שונים. כלמידיה הנגרמת נזק לתאים אפיתל יש להיפרד חפצים מתווכים דרך הכנת טיפול זהיר של החצוצרות לפני הזיהום (איור 6).

באיור 1. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של השחלה הלא נגוע האדם לאחר הדגירה יום אחד בינוני הביקורת (החץ הירוק מראה תא ריסי, החץ הכחול מראה שאינו ריסי התא).

איור 2. סריקת אלקטרונים MICROS עותק (SEM) של trachomatis vivo ג לשעבר נגוע החצוצרה האדם 1 הודעה ביום זיהום (הכללה לבן החץ סימן מקרע).

באיור 3. סעיפים דקים דו להראות תכלילים תאיים אופיינית (חיצים לבנים) 1D לאחר ההדבקה של חצוצרת הרחם האנושי עם ג לשעבר trachomatis vivo.

איור 4. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של צינור שאינו נגוע השחלה אדם לאחר הדגירה יום אחד במדיום שליטה.

איור 5. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של vivo לשעבר ג trachomatis נגוע החצוצרה האדם 1 הודעה ביום זיהום (חיצים לבנים מסמנים תכלילים כלמידיה).

ve_content ">
איור 6. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של האפיתל החצוצרה נזק תוך הכנת טיפול זהיר של הדגימה (לבן חיצים סימן יחסל את רקמת אפיתל).

Discussion

ויזואליזציה של פגיעה הפתוגן הנגרמת לרקמה הנגועה הוא קשה ומוגבל קרובות להליכים ניסויים בעכברים. הקמנו מודל לשעבר זיהום vivo של החצוצרות האדם לנתח ג trachomatis זיהומים של דרכי המין הנשי העליון. על ידי שימוש בשיטה זו, הצלחנו לדמיין ג trachomatis - הנזק הנגרם על אפיתל האדם החצוצרה תוך זיהום פוסט אחד ביום. נפיחות תמוגה הסלולר היו שינויים מורפולוגיים אופייניים שנצפו ב C. trachomatis - החצוצרות נגועים אך לא בלתי נגועים שולטת. ניתוחים TEM גילה כי chlamydiae ליישם מחזור טיפוסי התפתחותי תאיים בתוך רקמות נגועות, מראה גדולה עם תכלילים מחדש הבדיל הגופים היסודיים, אלא גם תכלילים קטנים עם גופים reticulate מוגדלים שעשוי להצביע על ההתמדה. עם זאת, את התמונה המורפולוגית לבדו אינו מספיק כדי להבחין בין replזיהומים icating ומתמשך, המאופיינים חילוף החומרים מופחת גדל התנגדות antimicrobials ^10.

הרס של רקמת האפיתל של החצוצרות הוא נגוע או בשל שיבוש ג trachomatis - לתאי האפיתל נגוע לאחר השלמת מחזור ההתפתחות תאיים ושחרור של הגוף יסודיים זיהומיות או שחרור של ציטוקינים דלקתיים ^Pro-8. מחולל המחלה הנגרמת לרקמה נזק המארח המושרה תגובות חיסוניות נגד ג trachomatis אמורים להיות הגורמים העיקריים שהובילו אובדן תפקוד תא אפיתל, שיפוץ פיברובלסטים ועקרות תובל בסופו של דבר in vivo ^8,11.

אחת המגבלות העיקריות של מודל זה הוא העדר תאים דלקתיים אשר מעכבת את ניתוח של השפעות משניות על ג הראשונית trachomatis זיהום של האפיתל החצוצרה. עם זאת, המודל הוא APpropriate לחקור תנאים סביבתיים שונים (לדוגמא: תכולת החמצן) ואת התגובה הראשונית מארח חיסונית חריפה ג trachomatis זיהומים ^8,9. תוכניות נוספות הן לבסס מודל לבדיקה של antimicrobials נגד ג trachomatis על שלמות החצוצרות אדם לאפיין את חילוף החומרים של מדינות בשלבי התפתחות שונים שנצפו האפיתל תובל על ידי מיקרוסקופ 2-פוטון סריקת לייזר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	PAA	E15-843
RPMI	PAA	R15-802
FCS	PAA	A15-101
Cycloheximide	Sigma - Aldrich
SPG Buffer	various		see recipe below
Monti's fixative	various		see recipe below
sodium cacodylate buffer	various		see recipe below
Richardson's stain	various		see recipe below
Recipes:
1. SPG Buffer
Add 75 g sucrose. Add 2.47 g disodium phosphate. Add 0.36 g monosodium phosphate. Add 0.72 g glutamic acid. Fill to 1 l with aqua dest. Adjust pH to 7.3.
2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt. Add 68.46 g sucrose. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.
3. Monti's fixative
Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.
4. Richardson's stain
Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.