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एक मानव की जांच के लिए फैलोपियन ट्यूब के मॉडल Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,4
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

हम एक का वर्णन

Abstract

क्लैमाइडिया trachomatis के साथ जननांग पथ के संक्रमण (सी. trachomatis) सबसे अक्सर प्रेषित दुनिया भर में महिलाओं में यौन रोग हैं. अक्षम है या रोगजनकों के निकासी हठ ऊपरी जननांगी पथ के संक्रमण आरोही और पुरानी संक्रमित ऊतकों 1,2 भड़काऊ क्षति का कारण माना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. एक परिणाम के रूप में, श्रोणि सूजन बीमारी (पीआईडी), ट्यूबल रोड़ा और बांझपन की तरह गंभीर नैदानिक ​​sequelae 3,4 हो सकता है.

सी. के साथ अनुसंधान के अधिकांश trachomatis उपकला कोशिका लाइनों (जैसे Hep 2 कोशिकाओं और HeLa 229) में या चूहों में आयोजित किया गया है. हालांकि, सेल संस्कृति आधारित मॉडल के साथ के रूप में, वे न तो देशी ऊतक के शरीर क्रिया विज्ञान और न ही सी. के pathophysiology प्रतिबिंबित नहीं करते trachomatis 5 vivo में जननांग पथ के संक्रमण. इसके अलावा सीमाओं तथ्य के द्वारा दिया जाता है कि केंद्रीय संकेत cascades (जैसे IFN-γ mediatएड जे ए / स्टेट संकेतन मार्ग) कि intracellular chlamydial विकास नियंत्रण में मौलिक चूहों और मनुष्य 6,7 के बीच अलग. हम और इसलिए दूसरों को एक पूरी अंग फैलोपियन ट्यूब मॉडल स्थापित करने के लिए सी. के बीच प्रत्यक्ष बातचीत की जांच trachomatis और मानव फैलोपियन ट्यूब कोशिकाओं 8,9 पूर्व vivo में.

इस प्रयोजन के लिए, मानव फैलोपियन ट्यूब गर्भाशय के दौर से गुजर महिलाओं से एकत्र किया गया और सी के साथ संक्रमित trachomatis serovar डी. 24 घंटे के बाद संक्रमण के भीतर नमूना है, जहां विश्लेषण क्लैमाइडिया trachomatis का पता लगाने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) का उपयोग करने के लिए उपकला क्षति के रूप में अच्छी तरह के रूप में मध्यस्थता सी. trachomatis फैलोपियन ऊतक में शामिल गठन.

Protocol

1. क्लैमाइडिया trachomatis Serovar विकास स्टॉक की तैयारी

  1. संगामी 175 सेमी दो सेल संस्कृति 4 मिलीग्राम सी के साथ HeLa 229 कोशिकाओं से युक्त कुप्पी को संक्रमित बफर एसपीजी में trachomatis डी.
  2. लगातार झटकों के दौरान 37 ° C पर एक घंटे के लिए सेते हैं.
  3. जोड़ें और एफसीएस 10% और 240 μl Cycloheximide साथ 20 मिली DMEM.
  4. 48 ज के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में 37 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  5. 5 मिलीलीटर बाँझ ग्लास मनकों, मजबूत शेक जोड़ें करने के लिए अलग और सी. को नष्ट trachomatis HeLa 229 कोशिकाओं को शरण.
  6. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और बाँझ ग्लास मनकों की एक और 5 मिलीग्राम जोड़ें.
  7. रॉक 1 मिनट के लिए तीन बार के सभी HeLa 229 कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए और रिहाई सी. trachomatis.
  8. 1000 rpmi पर 5 मिनट और 4 के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सेलुलर मलबे से छुटकारा पाने के.
  9. कि लीजिए 8-10 175 cm 2 सेल संस्कृति के संक्रमण के लिए सतह पर तैरनेवाला सहधारा जी बोतलrown HeLa 229 कोशिकाओं के साथ.
  10. 4 मिलीग्राम एसपीजी बफर और एक घंटे के लिए पिछले संक्रमण से 4 मिलीग्राम सतह पर तैरनेवाला 37 ° सी लगातार झटकों के साथ साथ हर कुप्पी सेते हैं.
  11. एक घंटे के बाद 10% है FCS और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 48 घंटे ऊष्मायन के बाद 230 μl cycloheximide साथ 15 मिलीलीटर DMEM.
  12. 5 मिलीलीटर बाँझ ग्लास मनकों को जोड़ने के लिए, अलग हिला और सी. को नष्ट trachomatis HeLa 229 कोशिकाओं को शरण.
  13. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और बाँझ ग्लास मनकों की एक और 5 मिलीग्राम जोड़ें.
  14. रॉक 1 मिनट के लिए तीन बार के सभी HeLa 229 कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए और रिहाई सी. trachomatis.
  15. 1000 rpmi में 5 मिनट के लिए 4 बजे अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सेलुलर मलबे से छुटकारा पाने के.
  16. सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
  17. सतह पर तैरनेवाला के 40 मिलीलीटर में 50 मिलीग्राम फाल्कन ट्यूबों, अपकेंद्रित्र में 11,000 rpmi के साथ 99 मिनट के लिए भरें.
  18. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागने और 1 मिलीलीटर बफर एसपीजी के साथ गोली धोना.
  19. Homogenize1 मिलीग्राम और 1, 5 मिलीलीटर -70 पर Eppendorf ट्यूब दुकान, ° सी का उपयोग करें जब तक में अशेष भाजक 20 μl एसपीजी में गोली. तैयार स्टॉक के जैविक गतिविधि एक स्थापित HeLa 229 सेल संक्रमण मॉडल में पुष्टि की गई.

2. मानव फैलोपियन ट्यूब की तैयारी

  1. स्टोर RPMI 4 में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 5% एफसीएस तैयारी डिग्री सेल्सियस तक युक्त में सर्जरी के बाद तुरंत गर्भाशय के दौर से गुजर महिलाओं से मानव फैलोपियन ट्यूब (HFT). प्रोटोकॉल Lübeck के विश्वविद्यालय (09-153) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. महिलाओं के अध्ययन में शामिल (53 तक 34 साल की उम्र) पूर्व सी. का कोई इतिहास था संक्रमण trachomatis. फैलोपियन ट्यूब के ऊतक peripartum नसबंदी पर मातृ अनुरोध पर शल्यक्रिया वर्गों के दौरान या luteal चरण में रोगसूचक गर्भाशय फाइब्रॉएड के कारण hysterectomies के दौरान एकत्र की गई थी. सभी HFT सी. के लिए नकारात्मक परीक्षण किया गया पीसीआर द्वारा trachomatis.
  2. के साथ RPMI युक्त एक पेट्री डिश में HFT काटनाएंटीबायोटिक दवाओं के बिना 5% है FCS. पूरी प्रक्रिया के दौरान ऊतक सुखाने को रोकने के लिए मीडिया में डूबे हुए किया जाना चाहिए.
  3. कट और संयोजी ऊतक और ऊतकों को सर्जरी के दौरान नष्ट त्यागें.
  4. विच्छेदन के बाद एक छोटी सी स्केलपेल के साथ HFT ध्यान से खोल.
  5. आगे के लिए प्रयोग 0.5 सेमी x 0.5 सेमी 1 एक्स 1 सेमी के आकार में ऊतक के टुकड़े को तैयार करते हैं.
  6. 1 मिलीलीटर RPMI में संक्रमण दुकान HFT नमूना के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 5% एफसीएस युक्त. HFT नमूनों 5.5x10 5 सी. की IFU (शामिल किए जाने के गठन इकाइयों) से संक्रमित थे trachomatis.
  7. 37 में HFT नमूना सेते हैं डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 21% 2 हे 37 में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 24 घंटे के लिए 2% 2 हे.
  8. ऊष्मायन समय के बाद कम से कम तीन दिनों के लिए 4 नमूना और मोंटि स्थिरकारी में दुकान ° SEM / मंदिर तैयारी जब तक सी. इकट्ठा

3. HFT नमूना के मंदिर के लिए तैयार

  1. के लिएमंदिर मोंटि लगानेवाला से नमूना हटाने और 2 एक्स 2 4 एक्स 5 मिमी टुकड़े मिमी कटौती. शेष ऊतक SEM के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. 1 घंटे के लिए सोडियम cacodylate बफर, 7.35 पीएच साथ टुकड़े धो लें.
  3. 1 (w / v)% एक्वा गंतव्य में आज़मियम tetroxide में सेते हैं. रात भर.
  4. सोडियम cacodylate बफर पीएच 7.35 में 6x5 मिनट के धोने से अधिक आज़मियम tetroxide निकालें.
  5. पानी में इथेनॉल की बढ़ती सांद्रता (v / v) (2 घंटे के लिए 30%, 2 घंटे के लिए 40%, 2 घंटे के लिए 50%, 2 घंटे के लिए 60%, 70% से अधिक रात, 2 के लिए 80% में incubating पानी निकालें घंटे, 1 घंटे के लिए 90%, 1 घंटे के लिए 95%, 1 घंटे के लिए 100%.
  6. Propylene ऑक्साइड में 2 x 15 मिनट के लिए इथेनॉल धो और बाद में 50% की एक मिश्रण (v / v) propylene में हौसले से से तैयार araldite (सभी घटकों सहित) को हस्तांतरण और रातोंरात सेते हैं.
  7. हौसले से तैयार araldite (सभी घटकों सहित) के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए स्थानांतरण.
  8. फ्लैट एम्बेडिंग molds करने के लिए स्थानांतरण और araldite साथ भरें.
  9. के लिए araldite कठोर चलो60 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे कम से कम
  10. एम्बेडेड नमूना के trimming के बाद एक गिलास चाकू या एक histo हीरे की चाकू का उपयोग कर ultramicrotome पर अर्द्ध पतली वर्गों (700 एनएम) में कटौती और रिचर्डसन दाग के साथ दाग.
  11. अति पतली वर्गों (लगभग 70 एनएम) एक हीरे की चाकू और तांबा ग्रिड (150 वर्ग जाल जैसे) के हस्तांतरण का उपयोग कर कटौती.
  12. एक्वा गंतव्य में 0.5% (w / v) uranyl एसीटेट के साथ अति पतली वर्गों दाग. 3 (w / v)% एक्वा गंतव्य में नेतृत्व साइट्रेट द्वारा पीछा किया. एक स्वचालित अनुभाग बदनाम करने वाला. वैकल्पिक रूप से, वर्गों ग्रिड एक्वा गंतव्य में uranyl एसीटेट की संतृप्त में Centrifuged समाधान पर 15 मिनट छोड़ने के द्वारा मैन्युअल दाग कर सकते हैं. एक्वा गंतव्य में 0.3% नेतृत्व साइट्रेट (w / v) द्वारा पीछा किया.

4. HFT नमूना SEM के लिए तैयार

  1. SEM के उपकला एक 1.5 x 1 सेमी काग शीट पर ऊपर का सामना करना पड़ के साथ मोंटि लगानेवाला, पूरबी से नमूना और हटाने कीट सुई का उपयोग करते हुए स्थिति को ठीक.
  2. काग पर नमूना उपयुक्त धातु टोकरी और स्थानांतरणसोडियम cacodylate बफर, 7.35 पीएच में 30 मिनट के लिए धो लो.
  3. एसीटोन / पानी के मिश्रण की बढ़ती एकाग्रता (6 घंटे के लिए 30%, 6 घंटे के लिए 40%, 8 घंटे के लिए 60%, 70% से अधिक रात, 2 घंटे के लिए 80%, 90% v / v) में नमूना incubating के पानी निकालें रात से अधिक 2 घंटे और 100% (अत्यंत रखने के लिए नमूना लगातार जलमग्न सतर्क हो).
  4. महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (तापमान 40 ° सी दबाव, 80 बार) द्वारा ताजा 100% एसीटोन और शुष्क नमूना हस्तांतरण.
  5. एक प्रवाहकीय कार्बन प्रवाहकीय कार्बन सीमेंट का उपयोग टैब के साथ सुसज्जित SEM के नमूना माउंट पर ऊपर का सामना करना पड़ उपकला साथ सुई, काग और गोंद नमूना निकालें. तरल प्रवाहकीय चांदी का उपयोग करने के लिए माउंट और प्रवाहकीय कार्बन टैब के बीच में चालकता को बढ़ाने के लिए.
  6. का उपयोग कर एक coater धूम नमूना के एक प्रवाहकीय सोना, प्लेटिनम या पैलेडियम कोटिंग तैयार.

5. रिचर्डसन दाग के साथ अर्ध पतली धारा की धुंधला हो जाना

  1. अर्द्ध पतली वर्गों स्लाइड पर शुष्क करते हैं.
  2. 60 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए समाधान धुंधला के साथ वर्गों का दाग.
  3. एक्वा गंतव्य में धो लें.
  4. ड्राई वर्गों और coverslip.

6. प्रतिनिधि परिणाम

मानव फैलोपियन ट्यूब संक्रमण मॉडल के भीतर हम उपकला morphology में गैर संक्रमित (चित्रा 1) नियंत्रण और सी. के बीच मतभेद की कल्पना करने में सक्षम थे trachomatis - normoxic शर्त के तहत संक्रमित ट्यूब (चित्रा 2). विशेषता रूपात्मक मतभेद रोगज़नक़ प्रेरित और फैलोपियन ट्यूब उपकला कोशिकाओं है कि गैर संक्रमित नियंत्रण में नहीं पाया जा सकता है की सूजन सेल निहित. अर्द्ध पतली वर्गों और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग हम के intracellular सी. साबित करने में सक्षम थे trachomatis पूर्व मानव फैलोपियन ट्यूब ऊतक संक्रमित vivo में शामिल गठन (चित्रा 3, 5), लेकिन (चित्रा 4) गैर संक्रमित नियंत्रण में नहीं है. ऑक्सीजन concentra है के रूप मेंमहिला जननांग पथ में माहौल पहले से ही एक भड़काऊ प्रक्रिया हम भी hypoxic शर्तों के तहत हमारे मॉडल की जांच के दौरान कम शारीरिक 11 की स्थिति, और आगे की कमी के अंतर्गत. प्रारंभिक परिणामों से संकेत मिलता है मॉडल ऑक्सीजन अलग सांद्रता के तहत chlamydial विकास और संतान का विश्लेषण उपयोगी है. क्लैमाइडिया प्रेरित उपकला कोशिका क्षति कलाकृतियों कि असावधान और संक्रमण से पहले फैलोपियन ट्यूब (चित्रा 6) की तैयारी से निपटने के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं से अलग हो गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1 नियंत्रण मध्यम में एक दिन ऊष्मायन (हरा तीर दिखाने रोमक सेल, नीले तीर दिखाने के गैर रोमक सेल) के बाद स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक गैर संक्रमित मानव फैलोपियन.

चित्रा 2
चित्रा 2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रो एक पूर्व vivo सी. trachomatis संक्रमित मानव फैलोपियन ट्यूब एक दिन के बाद संक्रमण (सफेद तीर निशान उठी समावेश) की प्रतिलिपि (SEM).

चित्रा 3
चित्रा 3 अर्ध पतली वर्गों, सी. मानव फैलोपियन ट्यूब के साथ संक्रमण के बाद ठेठ intracellular (सफेद तीर) inclusions के 1d बताते हैं trachomatis पूर्व vivo.

चित्रा 4
चित्रा 4 नियंत्रण मध्यम में एक दिन ऊष्मायन के बाद एक गैर संक्रमित मानव फैलोपियन ट्यूब की पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर).

चित्रा 5
चित्रा 5. एक पूर्व vivo सी. की पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) trachomatis संक्रमित मानव फैलोपियन ट्यूब एक दिन के बाद संक्रमण (सफेद तीर chlamydial inclusions के निशान).

"ve_content> चित्रा 6
चित्रा 6 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) असावधान नमूना तैयार करने और हैंडलिंग (सफेद तीर चिह्न विलुप्त उपकला ऊतक) के माध्यम से क्षतिग्रस्त फैलोपियन ट्यूब उपकला के.

Discussion

रोगज़नक़ प्रेरित संक्रमित ऊतकों को नुकसान के विज़ुअलाइज़ेशन कठिन है और अक्सर चूहों में प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए सीमित है. हम मानव फैलोपियन ट्यूब में एक पूर्व vivo संक्रमण मॉडल स्थापित करने के लिए सी. विश्लेषण trachomatis ऊपरी महिला जननांग पथ के संक्रमण. इस पद्धति का उपयोग करके, हम सी कल्पना करने में सक्षम थे trachomatis - एक दिन के बाद संक्रमण के भीतर मानव फैलोपियन ट्यूब उपकला प्रेरित नुकसान. सेलुलर सूजन और lysis ठेठ morphological परिवर्तन है कि सी में मनाया गया. trachomatis संक्रमित फैलोपियन ट्यूब लेकिन गैर संक्रमित नियंत्रण में नहीं है. मंदिर विश्लेषण से पता चला कि Chlamydiae संक्रमित ऊतकों के भीतर एक विशिष्ट intracellular विकास चक्र को लागू करने के लिए, फिर से विभेदित प्राथमिक लेकिन यह भी शरीर बढ़े हुए जाल से ढँकना शरीर है कि दृढ़ता से संकेत मिलता है हो सकता है के साथ छोटे inclusions के साथ बड़े inclusions के दिखा. हालांकि, रूपात्मक अकेले तस्वीर repl के बीच भेदभाव करने के लिए पर्याप्त नहीं हैicating और लगातार संक्रमण, जो कम चयापचय की विशेषता है और 10 antimicrobials के प्रतिरोध की वृद्धि हुई.

संक्रमित फैलोपियन ट्यूब में उपकला के विनाश या तो सी. के विघटन के कारण है trachomatis - intracellular विकास चक्र और संक्रामक प्राथमिक निकायों या समर्थक भड़काऊ 8 साइटोकिन्स की रिहाई की रिहाई के पूरा होने के बाद संक्रमित उपकला कोशिकाओं. रोगज़नक़ प्रेरित ऊतकों को नुकसान और सी. के खिलाफ मेजबान प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं trachomatis उपकला कोशिका समारोह, तंतुप्रसू, remodeling और 8,11 vivo में अंततः ट्यूबल बांझपन के नुकसान के लिए अग्रणी के लिए प्रमुख कारकों को माना जाता है.

इस मॉडल के प्रमुख सीमाओं के भड़काऊ कोशिकाओं के अभाव है जो प्रारंभिक सी. करने के लिए माध्यमिक प्रभाव के विश्लेषण बाधित है फैलोपियन ट्यूब उपकला trachomatis संक्रमण. हालांकि, मॉडल एपी हैविभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों (जैसे ऑक्सीजन सामग्री) और तीव्र सी. में प्रारंभिक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच propriate trachomatis संक्रमण 8,9. आगे की योजना सी. के खिलाफ antimicrobials की परीक्षण के लिए एक मॉडल स्थापित कर रहे हैं पूरे मानव फैलोपियन ट्यूब में और विभिन्न विकासात्मक 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्यूबल उपकला में मनाया चरणों के चयापचय राज्यों विशेषताएँ trachomatis.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम "सूजन इंटरफेस पर" उत्कृष्टता के DFG-क्लस्टर (आरए यदि, आरए डी) द्वारा समर्थित किया गया. हम क्रिस्टिन Wischnat के उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG Buffer various see recipe below
Monti's fixative various see recipe below
sodium cacodylate buffer various see recipe below
Richardson's stain various see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer
  1. Add 75 g sucrose.
  2. Add 2.47 g disodium phosphate.
  3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
  4. Add 0.72 g glutamic acid.
  5. Fill to 1 l with aqua dest.
  6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
  1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
  2. Add 68.46 g sucrose.
  3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
  4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti's fixative
  1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
  2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest.
  4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson's stain
  1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.

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References

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Jerchel, S., Knebel, G., König, … More

Jerchel, S., Knebel, G., König, P., Bohlmann, M. K., Rupp, J. A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections. J. Vis. Exp. (66), e4036, doi:10.3791/4036 (2012).

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