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Medicine

一个人的调查输卵管模型 Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,4
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

我们描述了一个

Abstract

沙眼衣原体生殖道感染（ 沙眼衣原体 ）是最常见的性传播疾病在世界各地的妇女。低效的间隙或病原体的持久性，可能会导致升上生殖道感染，应该引起1,2感染组织的慢性炎症损害。因此，像盆腔炎（PID）的，输卵管阻塞，不孕不育的临床后遗症严重，可能会出现3,4。

与 C的研究沙眼已在上皮细胞株（如HEp-2细胞和HeLa-229）或小鼠进行。然而，由于与细胞培养模型，他们既不反映本地组织的生理，也不是C 的病理生理在体内 5 衣原体生殖道感染。进一步限制的事实，中央信号级联（如干扰素γmediat的编辑JAK / STAT信号通路），控制细胞内衣原体的增长从根本上老鼠和人类6,7之间的差异。我们和其他人，因此建立一个整体的器官输卵管模型，探讨之间C.直接的相互作用衣原体和人类输卵管细胞体外 8,9。

为了这个目的，人类从接受子宫切除术的妇女输卵管收集和感染与 C 衣原体血清型D.感染后24小时之内，样品分析使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）检测沙眼衣原体介导的上皮损伤，以及C.衣原体在输卵管组织列入的形成。

Protocol

1。 沙眼衣原体血清型D投入的制备

  1. 感染合流175厘米2细胞培养瓶摄氏用4毫升含有的HeLa-229细胞衣原体 D在石药缓冲区。
  2. 在不断晃动在37°C孵育一小时。
  3. 添加10％胎牛血清和240μL，放线菌酮20毫升DMEM培养液。
  4. 在加湿孵化器的孵育48小时37°C间和5％的CO 2。
  5. 加入5毫升无菌玻璃珠，强烈的震动，分离和破坏C。沙眼窝藏的HeLa-229细胞。
  6. 收集上清，添加另一个无菌玻璃珠的5毫升。
  7. 岩3次为1分钟，以销毁所有的HeLa-229细胞，并释放C。沙眼 。
  8. 离心机在1000 RPMI 5分钟和4°C至去除细胞碎片。
  9. 收集8日至10 175厘米2细胞培养上清感染瓶合流Ğrown与HeLa细胞229细胞。
  10. 每一瓶孵育4毫升石药缓冲区和4毫升从以前的感染上清一小时在37°Ç不断晃动。
  11. 一个小时后，添加10％胎牛血清和230μL，放线菌酮在37°C和5％CO 2孵育48小时15毫升培养液。
  12. 加入5毫升无菌玻璃珠，摇来分离和破坏C。沙眼窝藏的HeLa-229细胞。
  13. 收集上清，添加另一个无菌玻璃珠的5毫升。
  14. 岩3次为1分钟，以销毁所有的HeLa-229细胞，并释放C。沙眼 。
  15. 在1000 RPMI 5分钟的离心机在4°C，以去除细胞碎片。
  16. 收集上清。
  17. 填写在50毫升的猎鹰管，离心99分钟11000 RPMI 40上清毫升。
  18. 离心后弃上清，用1毫升盛高置缓冲区洗沉淀。
  19. 均质的颗粒抢断和1毫升，分装20μL1，5毫升Eppendorf管中，储存于-70℃直至使用Ç。准备股票的生物活性被证实在一个既定的HeLa-229细胞感染模型。

2。人输卵管的制备

  1. 商店人输卵管（HFT）的，在无抗生素的RPMI含5％FCS在4°C间，直到准备手术后立即接受子宫切除术的妇女。吕贝克大学（09-153）伦理委员会批准该协议。包括在研究中（34至53岁）的妇女没有之前三历史衣原体感染。输卵管组织，剖腹产对产妇的要求，在收集期间在黄体期症状性子宫肌瘤，由于子宫切除在围产期杀菌。所有的哈沃被检测呈阴性的 C语言衣原体的PCR。
  2. 剖析在一个Petri菜含有的RPMI与哈沃5％胎牛血清无抗生素。在整个处理的组织应该被淹没在媒体，以防止干燥。
  3. 切断并丢弃在手术过程中破坏结缔组织和组织。
  4. 哈沃仔细解剖后打开一个小手术刀。
  5. 为进一步的实验准备在0.5厘米×0.5厘米至1厘米×1厘米大小的组织块。
  6. 感染商店哈沃标本1毫升不含抗生素的RPMI含有5％胎牛血清。哈沃标本5.5x10 5 IFU的形成单位）（包含C 的感染沙眼 。
  7. 哈沃标本孵育在37℃，5％CO 2和O 2的 21％以及在37℃，5％CO 2和2％的O 2 24小时。
  8. 孵化时间后收集蒙蒂的固定液的标本和存储在4°C，直到扫描电镜/ TEM准备至少3天。

3。透射电镜哈沃试样的制备

  1. 为透射电镜从蒙蒂的固定液的标本，并削减2×2毫米到4×5毫米件。其余组织可用于扫描电镜。
  2. 洗件二甲砷酸钠缓冲液，pH值7.35 1小时。
  3. 孵化在1％（W / V）旱厕目的的四氧化锇。过夜。
  4. 二甲砷酸钠缓冲液，pH值7.35洗6X5分钟，取出多余的四氧化锇。
  5. 删除在水，乙醇（V / V）浓度的增加（2小时30％，40％为2小时，2小时50％，60％为2小时，晚上超过70％，80％为2孵化水H，90％，95％为1小时1小时，1小时的100％。
  6. 洗出乙醇和环氧丙烷为2×15分钟后，转移到新鲜配制的丙烯（包括所有组件）牢50％的混合物（V / V），并孵育过夜。
  7. 转拨至新鲜制备的牢（包括所有组件），至少1小时。
  8. 转移到平坦嵌入模具，并填写与牢。
  9. 让为牢变硬至少48小时在60°C
  10. 嵌入式样本修整后切半薄超薄切片的路段上使用玻璃刀或的直方图钻石刀（700毫微米），并与理查森的污点污点。
  11. 切超薄切片（约70纳米）使用钻石刀和铜网格（如150平方米的网）转移到。
  12. 0.5％（W / V）在旱厕目的的铀醋酸染色超薄切片。其次为3％（W / V）铅柠檬酸在Aqua目的。自动节stainer。另外，部分可染色手动离开电网铀在旱厕目的醋酸离心饱和溶液15分钟。其次是0.3％柠檬酸铅在旱厕目的（W / V）。

4。哈沃试样的制备扫描电镜

  1. 扫描电镜从蒙蒂的固定液，东方标本1.5×1厘米软木与上皮面临向上，用昆虫针固定位置。
  2. 软木标本转移到合适的金属筐和洗为30分钟二甲砷酸钠缓冲液，pH值7.35。
  3. 删除由孵化试样在丙酮/水混合物的浓度（V / V）30％，为6小时，6小时40％，60％为8小时，晚上超过70％，80％为2小时，90％的水2 h和100％以上夜间极为谨慎，以保持标本不断淹没。
  4. 临界点干燥（温度40℃，压力80巴），转移到新鲜的100％丙酮和干燥标本。
  5. 删除面临的上皮向上SEM试样安装配备使用导电碳水泥标签用导电碳针，软木和胶水标本。使用液体的导电银之间的安装和导电碳标签，以提高电导率。
  6. 准备一个用溅射镀膜机试样的导电铂金，黄金或钯涂层。

5。理查森的色漆半薄切片染色

  1. 让半薄片干幻灯片的。
  2. 染色染色1-2分钟的解决方案，在60°C的部分。
  3. 洗目的旱厕。
  4. 干节和盖玻片。

6。代表结果

在人类的输卵管感染模型，我们能够想象在上皮细胞形态的差异非感染对照组（ 图1）和C。沙眼 -常氧条件下的感染管（ 图2）。形态特征差异暗示病原体引起的，不能在非感染控制检测输卵管上皮细胞肿胀和溶解。采用半薄切片和透射电子显微镜，我们能够证明细胞内三衣原体体外感染人输卵管组织中的包裹体形成（ 图3，5），但在非感染控制（ 图4）。由于氧浓度在炎症过程中，我们还调查了我们的模型，在缺氧条件下，在女性生殖道的的tions已经在生理条件下11，并进一步减少低。初步结果表明，该模型是有用的分析衣原体的生长和后代在不同氧气浓度。衣原体感染引起的上皮细胞损伤，必须通过不谨慎的准备和处理输卵管感染前（ 图6）介导的文物分离。

图1
图1。控制介质的一天后，潜伏期（绿色箭头显示纤毛细胞，蓝色箭头显示非纤毛细胞）的扫描电子显微镜的非感染人类输卵管（SEM）。

图2
图2。扫描电子显微镜副本（SEM）的体外C.衣原体感染人类输卵管天感染后（白色箭头标记破裂列入）。

图3
图3。半薄切片显示与 C人类输卵管感染后的典型内夹杂物（白色箭头）1D 衣原体体外 。

图4
图4。非感染人类输卵管天孵化后，在控制介质的透射电子显微镜（TEM）。

图5
图5。透射电子显微镜（TEM）的体外C.衣原体感染人类输卵管天感染后（白色箭头标记衣原体包裹）。

ve_content“> 图6
图6。扫描电子显微镜（SEM）输卵管上皮通过不谨慎试样的制备和处理（白色箭头标记破坏上皮组织）破坏。

Discussion

危害病原体引起的感染组织的可视化是艰巨的，往往是有限的，在小鼠实验程序。我们建立在人输卵管体外感染模型来分析C。上的女性生殖道衣原体感染。通过使用这种方法，我们能够可视化C。沙眼 -人输卵管上皮细胞损伤，感染后一天之内。细胞肿胀和溶解是典型的形态学变化， 在 C 沙眼 -输卵管感染，但在非感染控制。 TEM分析表明，衣原体在受感染的组织实施的一个典型的细胞内发育周期，显示重新分化的基本机构，而且还扩大网纹可能表明持久的机构小包裹大包裹。然而，单独的形态图片没有足以区分REPL的icating和持续感染，减少代谢特点和增加耐抗菌素10。

在受感染的输卵管上皮细胞的破坏，要么是由于C 的中断沙眼 -完成后的细胞发育周期和传染病的基本机构释放或释放促炎细胞因子8感染的上皮细胞。病原体引起的组织损伤和对C.主机诱导的免疫反应衣原体被认为是导致上皮细胞的功能，重塑成纤维细胞在体内 8,11终于输卵管不孕的损失的主要因素。

这种模式的主要限制之一是炎性细胞的情况下，这阻碍了初始C.辅助疗效分析衣原体感染输卵管上皮细胞。然而，该模型是APpropriate探讨不同环境条件（如氧含量）和最初的宿主免疫反应在急性三衣原体感染8,9。进一步的计划是建立一个测试模型对三抗菌素沙眼在整个人类的输卵管，在输卵管上皮细胞双光子激光扫描显微镜观察不同发育阶段的特征的代谢状态。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是由东风集团群集卓越“炎症接口”（RA，如果RA - D）支持。我们为克里斯汀Wischnat优秀的技术援助表示感谢。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG Buffer various see recipe below
Monti's fixative various see recipe below
sodium cacodylate buffer various see recipe below
Richardson's stain various see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer
  1. Add 75 g sucrose.
  2. Add 2.47 g disodium phosphate.
  3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
  4. Add 0.72 g glutamic acid.
  5. Fill to 1 l with aqua dest.
  6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
  1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
  2. Add 68.46 g sucrose.
  3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
  4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti's fixative
  1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
  2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest.
  4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson's stain
  1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.

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References

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Tags

医药，66期，感染，微生物学，生理学，
一个人的调查输卵管模型<em&gt; C。沙眼</em&gt;感染
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Jerchel, S., Knebel, G., König, … More

Jerchel, S., Knebel, G., König, P., Bohlmann, M. K., Rupp, J. A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections. J. Vis. Exp. (66), e4036, doi:10.3791/4036 (2012).

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