为揭示复杂的大脑地形wholemount免疫组化

Summary

神经回路地形组织功能的车厢与特定的分子型材。在这里，我们提供一个多功能wholemount免疫组织化学染色方法为揭示全球脑地形使用的实际和技术步骤。我们证明了实用的使用方法很好理解的小脑细胞构筑和电路。

Abstract

反复和充分了解小脑的细胞结构，使其理想的模型系统，为探索脑地形。其相对统一的细胞结构的基础是一系列复杂的基因和蛋白表达的矢状域。小脑分子条块分割镜像传入纤维的解剖和功能的组织。要充分认识小脑组织的复杂性，我们以前完善了wholemount染色方法在小鼠小脑的图案缺陷的高通量分析。该协议详细描述的试剂，工具，是有用的实际步骤，成功地揭示了成年小鼠小脑使用wholemount染色蛋白表达模式。这里展示的步骤强调使用这种方法的效用作为一个例子，如何可以在其透露的大脑的精细地形表达zebrinII / aldolaseC的原生立体构象。还介绍了协议允许传入的预测和大量分子地形比较研究小脑蛋白表达的可视化的适应。为了说明这些应用程序，从大鼠小脑的传入染色的数据。

Protocol

1。动物灌注和小脑剖析

1. 根据蛋白质，灌注可能是必不可少的成功染色^1,2。 transcardiac灌注是一种侵入性，非生存的过程，需要正确使用的麻醉药。正确的培训，机构批准，并IACUC批准，都在尝试的过程之前，必要的。它始终是一个好主意，咨询机构的兽医，以确定实验的要求，并获得正确的训练中得到的帮助。手术前，动物应该是深度麻醉，没有反应，如脚或尾巴捏刺激。用剪刀在腹部的皮肤和肌肉壁的切割，然后继续打开切割毗邻每侧胸骨肋骨。此外，实验者可以创造一个更大的内部工作空间切割筋膜周围的隔膜。提起腹部和胸壁superioRLY，心将予以曝光。做一个小切口在右心房，让血液流了出来，并立即插入左心室灌注针。一个基本的水压泵优先提供灌注的解决方案（ 详见表1）。首先，冲洗0.1M磷酸盐缓冲液（PBS， 见表3），直到流体运行明确血液。然后，关闭静压泵，快速切换的解决方案交付管的4％多聚甲醛的容器（PFA， 见表3）在PBS稀释，然后打开泵提供的固定液。泵的使用是没有必要的：与实践，填补两个注射器与PBS和4％的煤灰可以用来慢慢地提供解决方案。
2. 关键是要仔细解剖的头骨，脑，而不引入任何病变组织。即使小割伤，在解剖大脑会逐渐扩大成可见的缝隙，陷阱抗体，并导致artifactual染色处理的组织（如红色星号在图2）。小脑解剖，这是典型的，以减少中间的头部皮肤，然后轻轻地挑逗皮瓣除了暴露头骨。削减头骨由前至后沿背中线，还横向沿颅骨两侧。切不要超越前囟门运行的刻痕小脑的风险。使用镊子轻轻抬离头骨前，小心不要撕破了脑组织，脑膜脑。切断大脑的腹侧方颅神经。
3. 其余的大脑小脑的分离是很重要的原因有两个。首先，它允许前小叶，这是从视图中隐藏在原位丘表达模式的探索。二是组织分离成更小的，偏远地区，允许为m矿石完全固定，可以方便一些蛋白质染色。纵观这最后的解剖步骤，应注意不要触摸钳提示小脑。插入的优势和劣势丘中间的钳子提示。与第二组的镊子慢慢逗了小脑下丘。然后，奠定了小脑，因此，其前侧朝下和脑干朝上的。插入脑干和小叶第IX /小脑的X之间的第四脑室钳。剪下的梗用钳子捏两侧，然后轻轻抬起小脑脑干。小脑是孤立的，一旦发布修复浸泡在4°C 24-48小时最低为4％煤灰。小脑可以长时间储存​​在4％的煤灰。脑膜应更好地表达模式的知名度染色前或后删除。如果实验者选择删除脑膜染色前有一个强大的可能性，在这个过程中，小脑将缺口。在染色过程结束剥去脑膜要简单得多，因为他们更容易找到后，他们获得了弱的背景染色，后处理成为体弱。

2。 Wholemount染色的组织处理

因为wholemount染色方法需要较长的时间比组织切片的免疫组织化学染色，它是帮助每个实验计划的时间表（ 见表2），例如日历显示。在开始之前，有几个关键的事情要记住。 1）含有的微管组织应该在任何时候都nutator旋转，除在冻结/解冻过程。 2）有几种解决方案必须为每个实验的新鲜（见解决方案食谱表3）。 3）整个协议的，变化的解决方案时，轻轻地倒出来，而不是用钳子取出小脑花了解决方案，以避免接触小脑。然后，在另一个容器中混合后，新的解决方案，用吸管轻轻地添加新的解决管。

2.1第1天：

1. 在室温下固定6-8小时上nutator轻轻摇摆的小脑在登特的修复^3。如果甲醇是破坏性的抗原，可以考虑更换步骤，2.1A，2.3A通过与抗原检索方法。抗原检索的热量和使用的缓冲区，将有助于该组织准备抗体渗透。
2. 漂白小脑登特的漂白剂³一夜之间在4°C。

2.2第2天：

1. 在100％甲醇在室温下两轮各30分钟，脱水小脑。
2. 然后，以加强渗透的解决方案，组织了一系列冻结/解冻周期。小心地放置在一个容器干冰和30分钟的冻结管。然后，取出试管，并留在室温15分钟替补。冻结/解冻步骤应执行了4次（至少）。
3. 组织的最后解冻后，将管到-80°C冰箱过夜。
4. 组织可以长时间储存​​在-80°C间立即冻结/解冻步骤之前或之后。否则，该协议应继续下去。

2.3第3天：

1. 水化PBS洗涤50％小脑MeOH/50％，15％MeOH/85％PBS，100％FBS为60-90分钟，在室温。
2. 接下来，成年小鼠小脑，受到2-3分钟10μg/mL组在PBS中的蛋白酶K消化酶组织。没有消化步骤是必要的年轻动物的小脑（P5或鼠标年轻）。不再digestion是提出更大的大脑。例如，可以消化5-6分钟^4个灵长类动物的大脑一样高。
3. 消化后，立即在PBS洗三次小脑在室温下，每次10分钟，以去除蛋白酶K
4. 阻止组织中的光电倍增管（ 见表3），4过夜°C。奶粉往往是选择阻断剂对蛋白质的工作时的首选，因为它价格低廉，有效降低背景染色，通常不会干扰抗原抗体结合或访问。动物血清中也可以使用，但实验者应该意识到增加的成本，必须先测试血清交叉反应的免疫球蛋白和能力，以产生最佳的信噪比质量。

2.4 4-5日：

1. 孵育的组织在光电倍增管稀释的初级抗体辅以48小时在4℃（LARG 5％DMSO呃小脑会需要增加孵育时间）。

2.5第6天：

1. 小脑洗净，在4°C 2-3次，以除去未结合的抗体，在光电倍增管每2-3个小时。
2. 然后，孵化组织在二级抗体，在含5％DMSO的光电倍增管的解决方案4°C过夜（较大的小脑可能需要增加孵育时间）。

2.6第7天：

1. 小脑洗净的2-3倍，在光电倍增管每2-3个小时，在4°C
2. 给予组织与PBT（ 见表3）为1-2小时，最后洗净。这一步去除多余的牛奶和提高染色的清晰度。
3. 最后，孵化在DAB（3,3' - 二氨基联苯胺）解决方案的组织，直到达到最佳的染色强度。棕色的反应产物，应该是〜10分钟内清晰可见。最好是民建联在黑暗中使用轻造成的发色来降水TE，它可以增加背景染色。

2.7

当达到最佳的染色强度，停止放置在PBS 0.04％叠氮化钠与小脑的反应。组织可以存储长期在此解决方案。叠氮化钠是一种细菌生长的有效抑制剂，但应避免到这一步，因为它也抑制辣根过氧化物酶。

2.8可选放大过程：

按照正常的协议，但应在地方2.5B-2.7以上的步骤执行这些步骤。

1. 孵育组织一夜之间在4°，生物素标记抗体，PBST与5％二甲基亚砜（ 见表3）
2. 冲洗组织PBST 3-4在室温每2-3小时。
3. 孵育过夜小脑4°Ç在PBST农行在复杂的解决方案。
4. 每2-3小时冲洗组织在3-4变化的PBS室温。
5. 孵育新鲜准备民建联解决方案中的组织，如上所述。
6. 当染色是最优的，停止由0.04％叠氮化钠的PBS洗涤小脑的反应。

3。成像的彩色组织

1. 可以通过使用实例，抓获wholemount图像，的徕卡DFC3000 FX相机上安装运行徕卡应用套件FX软件徕卡MZ16足总杯体视显微镜。如果需要，卷积显微镜可用于获得不同焦平面多个连续的图像，每个图像只有一个清脆的重点单小叶。然后，图像可以被压缩成一个单一的协议栈和软件渲染消除失真。最后的合成图像，说明小脑表面的表达模式，明确的重点中的所有可见的图案。
2. wholemount染色组织应成像，而沉浸在PBS（或其他媒介，将给予最佳折射率）。为了方便定位的成像wholemount，在塑料培养皿1％琼脂糖凝胶。切成凝胶的小孔。孔将允许小脑楔入到想要的方向。
3. Adobe Photoshop CS4中的原始数据导入和调整对比度和亮度水平。

动物

经核准的的IACUC动物协议下进行所有的动物实验研究，根据阿尔伯特·爱因斯坦医学院的体制指引。男性和女性的远交瑞士韦伯斯特（Taconic的，奥尔巴尼，纽约州）小鼠保持在我们的殖民地，并为所有的研究。安乐死的成年大鼠请提供由博士布赖恩约旦（阿尔伯特·爱因斯坦医学院）。所有的动物至少一个月。

4。代表结果

小脑分子表达的是条块分割，横向分为四个区域：前区（AZ：〜小叶四），中央区（锆石：小叶六，七），后区（PZ值：〜小叶第八背九）和结节区（新西兰：小叶九腹侧和X ）5。每个区域都包含的矢状条纹（ 图^1）1,2,5,6独特的阵列。 Purkinje细胞ZebrinII在表达揭示条纹AZ和PZ（ 图2），CZ和新西兰元（ 图2）统一表达。矢状窦旁组织的Purkinje细胞是反映传入纤维的终端领域地形。可卡因和安非他明调节转录肽（CART）的攀登纤维（ 图3a）的子集表示，该项目在小脑皮层^7（ 图3b）的分子层的Purkinje细胞树突的条纹。用适当的修改，如放大^{7，wholemount}协议允许可视化olivocerebellar模式没有的东东一个艰苦的，耗时的重建时间从染色组织切片（ 图3b）。

图1。的表达A. ZebrinII / aldolaseC揭示矢状乐队在小脑的横截面。比例尺= 500微米。B. ZebrinII / aldolaseC表示只在Purkinje细胞胞体和树突。比例尺=150μm的（GL =颗粒层; PCL = Purkinje细胞层;毫升=分子层）。

图2。一个wholemount的小脑沾上为ZebrinII / aldolaseC显示图像前（AZ），中央（CZ），后区（PZ值），小脑的Purkinje细胞的条纹。在这里，我们也表明例如刻痕小脑的消极后果。造成artifactual染色显示红色星号。比例尺= 1毫米（LS = lobulus单纯PML的正中小叶;缔约方会议=系词pyramidis）。

图3表示在登山分子层中的纤维终端A.车。比例尺= 100微米。（毫升=分子层; PCL = Purkinje细胞层; GL =颗粒层）B. Wholemount车在新西兰的表达免疫组化。比例尺= 2毫米（缔约方会议=系词pyramidis;维甲酸=小叶正中; PFL = paraflocculus;佛罗里达=绒球​​）。

Discussion

我们已经介绍了使用一个多功能的免疫组织化学方法，在发展中国家和成人的大脑暴露蛋白表达为成功wholemount的染色所需的技术细节。复杂的分子的表达方式，通过使用这种方法，可以分析和脑地形而不需要费时费力组织切片程序赞赏。

该协议已被用于揭示成人^1,2,8,9和产后早期小鼠小脑^10,11,12图案几个Purkinje细胞蛋白表达。我们原来的研究也表明了实用的的审查颗粒细胞抗原表达的¹和²苔藓纤维anterogradely追查，位于〜250微米以下的颗粒层中的软脑膜表面wholemount方法。此外，一些研究已经取得成功的蛋白质染色修改原协议，我列印Purkinje细胞^1,13（抗原检索）和传入纤维^7,14（信号放大; 图2）。此外，免疫组化染色wholemount也被应用到多种哺乳动物^4,15小脑和禽流^16,17种^，18,19神经退行性疾病的小鼠模型中使用地图图案Purkinje细胞损失，并修改为染色²⁰心脏，肺^22日和^21日 ，脑神经角膜神经^23。从以前的wholemount方法^1,2描述当前协议的主要出发，在这里我们提供的不仅更新细节更好的成功使用的程序时，也有固定组织的完整指南，解剖组织和该技术的深度视频插图。

有几个限制wholemount染色。首先，只有表面图案是典型美云没有进一步的解剖和染色或不增加的时间长度，该组织在培养抗体可视化。此外，染色将无法达到内皮层深处，如果它被隐藏由于叶理^1,2。染色的然而，wholemount的组织可以是切片加工后restained，具有相同的抗体或其他组织内的^1,2揭示细胞基因表达谱更深。第二，的基本wholemount染色协议是长期的。我们建议，每个实验者凭经验确定其抗体的染色效率和缩短后的固定时间，缩短清洗的数量和长度，和/或缩短长度孵化中的主要抗体。有了这些调整，该协议可能会在一个相当短的时间内完成。第三，大小脑wholemount染色协议需要大量的抗体解决方案，它可以是昂贵的和/或只适用于在有限的定量ities。然而，它有可能每次运行后保存在-20℃冻结的解决方案的主要抗体每个实验者将不得不决定是否重新使用之前，其抗体能承受冻结。我们已经成功地染色组织使用等分以前zebrinII的冻结。第四，并不是所有抗体与兼容基本wholemount方法。例如，常用来检测条纹的小热休克蛋白HSP25表达的抗体，要求该组织将首先处理的抗原检索^13。无论如何，作为组织切片染色，故障排除抗体抗原结合的传统方法也证明有助于优化wholemount染色。

目前，我们正在探索适应我们使用荧光标记的二抗wholemount协议的可能性。用适当的显微镜配备有能力的形象不同的彩色fluorophores下的低功耗，不仅能够分析多个浦肯野细胞的地图，在相同的动物的组织，而且还检查Purkinje细胞的条纹和地形的WGA网站标记的传入纤维在三维空间之间的关系^2,4.7,24。此外，最近推出了大规模的基因表达数据库（艾伦脑图谱，Genepaint，脑基因表达图谱）已打开检查整个大脑的分子地形的全基因组分析与合并的高吞吐能力wholemount方法的新途径。