La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain

Summary

Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

Abstract

La arquitectura repetida y bien entendido-celular del cerebelo lo convierten en un sistema modelo ideal para explorar la topografía cerebral. Detrás de su citoarquitectura relativamente uniforme es un complejo conjunto de dominios parasagitales de expresión génica y proteica. La compartimentación molecular del cerebelo se refleja en la organización anatómica y funcional de las fibras aferentes. Para apreciar plenamente la complejidad de la organización del cerebelo que previamente refinado un enfoque tinción wholemount de análisis de alto rendimiento de los defectos de modelado en el cerebelo de ratón. Este protocolo se describe en detalle los reactivos, instrumentos y medidas prácticas que son útiles para revelar los patrones de éxito de expresión de proteínas en el cerebelo de ratones adultos mediante el uso de inmunotinción wholemount. Los pasos resaltada aquí demuestran la utilidad de este método que utiliza la expresión de zebrinII / aldolaseC como un ejemplo de cómo la topografía fino del cerebro puede ser revelada en sunativo conformación tridimensional. También se describen las adaptaciones del protocolo que permite la visualización de expresión de la proteína en las proyecciones aferentes y cerebelo, sin limitación para los estudios comparativos de la topografía molecular. Para ilustrar estas aplicaciones, los datos de tinción aferente del cerebelo de rata están incluidos.

Protocol

1. Los animales fueron perfundidos y disección Cerebelo

1. Dependiendo de la proteína, la perfusión puede ser esencial para el ^1,2 tinción con éxito. La perfusión transcardiaca es una técnica invasiva, no la supervivencia de procedimiento que requiere el uso apropiado de anestésicos. Formación adecuada, la aprobación institucional, y la aprobación del IACUC son necesarios antes de intentar el procedimiento. Siempre es una buena idea consultar a los veterinarios de la institución para obtener ayuda en la identificación de las necesidades experimentales y la adquisición de la formación correcta. Antes del procedimiento, el animal debe ser profundamente anestesiados y no responde a los estímulos, como la fiebre o la pizca de cola. Utilizando unas tijeras hacer un corte en la piel del abdomen y la pared muscular y luego continuar para abrir la caja torácica cortando justo al lado del esternón, a cada lado. Además, el experimentador puede crear un mayor espacio de trabajo interno por el corte de la fascia que rodea el diafragma. Al levantar la pared abdominal y torácica superioRLY, el corazón ahora serán expuestos. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para que la sangre fluya hacia el exterior e inmediatamente inserte la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo. Una bomba hidrostática de base es preferible ofrecer las soluciones de perfusión (ver Tabla 1 para más detalles). En primer lugar, limpiar la sangre con fosfato 0,1 M (PBS, ver Tabla 3) hasta que el líquido salga transparente. A continuación, apague la bomba hidrostática, cambiar rápidamente el tubo de entrega de la solución a un recipiente de 4% de paraformaldehído (PFA, ver Tabla 3) diluido en PBS y luego girar a la bomba de nuevo para ofrecer el fijador. El uso de una bomba no es necesario: con la práctica, dos jeringas llenas de PBS y 4% PFA se puede utilizar para entregar lentamente las soluciones.
2. Es crítico para disecar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo sin introducir ninguna lesión al tejido. Aun pequeñas laceraciones en el cerebro durante la disección se ampliará gradualmente en las grietas visibles queanticuerpos de captura y causar manchas artefactual durante el procesamiento de los tejidos (por ejemplo, asteriscos rojos en la figura 2). Para las disecciones del cerebelo, que es típico para cortar la piel por la mitad de la cabeza y luego suavemente se burlan de las aletas, aparte de exponer el cráneo. Cortar la cabeza de adelante hacia atrás a lo largo de la línea media dorsal, y también lateralmente a ambos lados del cráneo. No corte más allá de la bregma, ya que corre el riesgo de mellar el cerebelo. El uso de pinzas levante suavemente la parte frontal del cráneo fuera del cerebro con cuidado de no rasgar el tejido cerebral que se adjunta a las meninges. Sever los nervios craneales en el lado ventral del cerebro.
3. La separación del cerebelo del resto del cerebro es importante por dos razones. En primer lugar, permite la exploración de los patrones de expresión en los lóbulos anteriores, que están ocultos a la vista por el colículo in situ. La segunda es que la separación del tejido en pequeñas, las regiones aisladas permite mmineral completa fijación, que puede facilitar la tinción de algunas proteínas. A lo largo de esta etapa final de la disección, se debe tener cuidado de no tocar el cerebelo con las puntas de la pinza. Inserte las puntas de un par de pinzas en el medio de los tubérculos cuadrigéminos superiores e inferiores. Con un segundo juego de pinzas poco a poco se burlan de distancia del colículo inferior del cerebelo. Luego, coloque el cerebelo de modo que su cara anterior está orientada hacia abajo y el tronco cerebral está apuntando hacia arriba. Inserte las pinzas en el cuarto ventrículo entre el tronco cerebral y lóbulos IX / X del cerebelo. Cortar los pedúnculos pellizcando con las pinzas a ambos lados y luego levante suavemente el cerebelo lejos del tronco cerebral. Una vez que el cerebelo se aísla, se post-fijar por inmersión en 4% PFA a 4 ° C durante un mínimo de 24-48 horas. El cerebelo se puede almacenar en un 4% PFA durante un período prolongado de tiempo. Las meninges debe ser eliminado, ya sea antes o después de la tinción para una mejor visibilidad de los patrones de expresión.Si el experimentador elige para eliminar las meninges antes de la tinción existe una gran posibilidad de que el cerebelo se mellado durante el proceso. Pelar las meninges al final del procedimiento de tinción es mucho más sencillo porque se vuelven más fácil de localizar después de que adquieren tinción de fondo débil y convertirse en frágil post-procesamiento.

2. El procesamiento del tejido para la tinción wholemount

Debido a que el enfoque de tinción wholemount lleva más tiempo que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido, es muy útil para planificar la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, como se muestra en el calendario ejemplo proporcionado (Tabla 2). Antes de comenzar, hay varias cosas importantes a tener en cuenta. 1) Los microtubos que contienen el tejido debe girar sobre un nutator en todo momento, excepto durante el proceso de congelación / descongelación. 2) Varias soluciones se debe hacer de nuevo para cada experimento (Ver Tabla 3 para las recetas de solución). 3)A lo largo del protocolo, al cambiar las soluciones, con cuidado vierta la solución pasaba en lugar de eliminar el cerebelo con una pinza, para evitar tocar el cerebelo. Luego, después de mezclar la nueva solución en otro recipiente, utilizar una pipeta para añadir suavemente la solución fresca al tubo.

2,1 Día 1:

1. Fijar el cerebelo en ^tres corrección de Dent a temperatura ambiente durante 6-8 horas meciéndose suavemente en el nutator. Si el metanol es destructivo para el antígeno, considerar la sustitución de los pasos a través 2.1ay 2.3a con un método de recuperación de antígenos. El calor y los buffers usados ​​para la recuperación de antígenos ayudará a preparar el tejido para la penetración de anticuerpos.
2. Bleach del cerebelo en Bleach Dent ³ la noche a 4 ° C.

2,2 Día 2:

1. Deshidratar el cerebelo en dos rondas de 100% MeOH a temperatura ambiente durante 30 minutos cada una.
2. A continuación, para mejorar la penetración de las soluciones, sujetoel tejido a una serie de ciclos de congelación / descongelación. Coloque cuidadosamente el tubo en un recipiente con hielo seco y congelación durante 30 min. A continuación, retire el tubo y dejarlo a temperatura ambiente en el banco durante 15 minutos. El paso de congelación / descongelación debe llevarse a cabo cuatro veces (al menos).
3. Después de la última descongelación del tejido, coloque el tubo en un congelador -80 ° C durante la noche.
4. El tejido se puede almacenar durante períodos prolongados de tiempo a -80 ° C inmediatamente antes o después de las etapas de congelación / descongelación. De lo contrario, el protocolo debe continuar.

2.3 Día 3:

1. Rehidratar el cerebelo por lavado en 50% MeOH/50% de PBS, el 15% MeOH/85% PBS, y 100% de PBS durante 60-90 minutos cada una a temperatura ambiente.
2. A continuación, para adulto cerebelo del ratón, el tejido sujeto a la digestión enzimática con 10μg/ml de proteinasa K en PBS durante 2-3 minutos. Ningún paso es necesario para la digestión cerebelo de animales jóvenes (P5 o menos en el ratón). Ya digestion se sugiere para los cerebros más grandes. Por ejemplo, la digestión podría ser tan alta como 5-6 minutos para cerebros de primates ^4.
3. Después de la digestión, lávese el cerebelo en PBS tres veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente para eliminar la Proteinasa K.
4. Bloquee el tejido en el PMT (ver Tabla 3) la noche a 4 ° C. La leche en polvo es a menudo la primera elección cuando se selecciona un agente de bloqueo para el trabajo proteína porque es barato, reduce eficazmente la tinción de fondo, y típicamente no interfiere con la unión de los anticuerpos o el acceso al antígeno. Sueros animales también se puede utilizar, aunque el experimentador debe ser consciente del coste añadido y primero debe comprobar la calidad del suero para reacción cruzada inmunoglobulinas y la capacidad para producir una señal a ruido óptima.

2.4 Día 4-5:

1. Incubar el tejido en anticuerpos primarios diluidos en PMT suplementado con 5% de DMSO durante 48 horas a 4 ° C (Larger cerebelo se requieren mayores tiempos de incubación).

2.5 Día 6:

1. Lavar el cerebelo 2-3 veces durante 2-3 horas cada una en la PMT a 4 ° C para eliminar los anticuerpos no unidos primarios.
2. A continuación, se incuba el tejido en secundaria de anticuerpos en una solución que contiene PMT con 5% de DMSO a 4 ° C durante la noche (más grande cerebelo pueden requerir mayores tiempos de incubación).

2.6 Día 7:

1. Lave el cerebelo 2-3 veces durante 2-3 horas cada una en el PMT a 4 ° C.
2. Dar el tejido de un lavado final con PBT (ver Tabla 3) durante 1-2 horas. Este paso elimina el exceso de leche y aumenta la claridad de la tinción.
3. Finalmente, se incuba el tejido en DAB (3,3 '-diaminobencidina) solución hasta que la intensidad de la tinción óptima se alcanza. El producto de reacción marrón debe ser claramente visible dentro de ~ 10 minutos. Lo mejor es utilizar el DAB en la oscuridad como la luz hace que el cromógeno de precipitaciónte, que puede aumentar la tinción de fondo.

2.7

Cuando la intensidad de la tinción óptima se alcanza, detener la reacción mediante la colocación del cerebelo en PBS con azida de sodio 0,04%. El tejido puede ser almacenado a largo plazo en esta solución. Azida de sodio es un potente inhibidor del crecimiento bacteriano, pero debe evitarse hasta este paso, ya que también inhibe la peroxidasa de rábano picante.

2.8 procedimiento de amplificación Opcional:

seguir el protocolo normal, pero estos pasos deben realizarse en el lugar de los pasos 2.5b-2.7.

1. Incubar el tejido durante la noche a 4 ° C en biotina-conjugado con anticuerpos secundarios en PBST (ver Tabla 3) con 5% de DMSO.
2. Lavar el tejido durante 2-3 horas cada una en los cambios de PBST 3-4 a temperatura ambiente.
3. Incubar el cerebelo durante la noche a 4 ° C en la solución del complejo ABC en PBST.
4. Enjuague el tejido durante 2-3 horas cada uno ena temperatura ambiente en los cambios de PBS 3-4.
5. Incubar el tejido en solución DAB recién preparado, como se describió anteriormente.
6. Cuando la tinción es óptimo, detener la reacción por lavado el cerebelo en PBS con azida de sodio 0,04%.

3. Imagen del tejido teñido

1. Wholemount imágenes se pueden capturar mediante el uso de, por ejemplo, una cámara de Leica DFC3000 FX montada en un microscopio estereoscópico Leica MZ16 FA corriendo Leica Application Suite de software de FX. Si se desea, la microscopía deconvolución se puede utilizar para adquirir múltiples imágenes consecutivas en diferentes planos focales, con cada imagen que tiene sólo un único lóbulo de enfoque nítido. Entonces, las imágenes se puede comprimir en una sola pila y software prestado para eliminar la distorsión. La imagen compuesta final se ilustran los patrones de expresión de la superficie del cerebelo, con todos los patrones visibles en un enfoque claro.
2. Tejido teñido wholemount debe ser reflejada mientras se está inmerso en PBS (u otro medio que dé unaíndice de refracción óptimo). Con el fin de posicionar fácilmente la wholemount para formación de imágenes, hacer un gel de agar al 1% en una placa Petri de plástico. Cortar pequeños agujeros en el gel. Los agujeros permitirá que el cerebelo para ser encajada en la orientación deseada.
3. Los datos brutos se importan a Adobe Photoshop CS4 y ajustado por los niveles de contraste y brillo.

Animales

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en virtud de un protocolo de animales aprobado IACUC de acuerdo con las directrices institucionales en el Albert Einstein College of Medicine. Macho y hembra outbred Swiss Webster (Taconic, Albany, NY) ratones se mantuvieron en nuestra colonia y se utiliza para todos los estudios. Ratas adultas sacrificados fueron amablemente proporcionados por el doctor Bryen Jordania (Albert Einstein College of Medicine). Todos los animales fueron al menos un mes.

4. Los resultados representativos

El cerebelo está compartimentado por la expresión molecular en cuatro zonas transversales:la zona anterior (AZ: ~ lóbulos IV), la zona central (CZ: ~ lóbulos VI-VII), la zona posterior (PZ: ~ lóbulos VIII-IX dorsal) y la zona nodular (NZ: ~ lóbulos ventral y IX X ) 5. Cada zona contiene una gama única de parasagital rayas ^1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII expresión en células de Purkinje revela rayas en la AZ y PZ (Fig. 2) y expresión uniforme en la CZ y NZ (fig. 2). La organización parasagital de células de Purkinje se refleja en el campo de la topografía de terminales de las fibras aferentes. La cocaína y la anfetamina regulado transcripción (CART) péptido se expresa en los subgrupos de fibras trepadoras (Fig. 3) que el proyecto a las rayas de las dendritas de células de Purkinje en la capa molecular del cerebelo de la corteza cerebral ⁷ (Figura 3b). Con las modificaciones apropiadas, tales como la amplificación del ^7, el protocolo wholemount permite la visualización de patrones olivocerebellar sin need para una reconstrucción de laboriosos, de teñir secciones de tejido (Figura 3b).

Figura 1. A. ZebrinII / aldolaseC expresión revela bandas sagitales en las secciones transversales del cerebelo. Barra de escala = 500 m. B. ZebrinII / aldolaseC se expresa exclusivamente en somata de células de Purkinje y las dendritas. Barra de escala = 150μm (gl = capa granular; pcl = capa de células de Purkinje; ml = capa molecular).

Figura 2. Un cerebelo wholemount teñidos para ZebrinII / aldolaseC mostrando rayas células de Purkinje en las imágenes de la parte anterior (AZ), central (República Checa), y posterior (PZ) Zonas del cerebelo. Este trabajo también muestra un ejemplo de la consecuencia negativa de mellar el cerebelo. La tinción resultante artefactual se indicacon un asterisco rojo. Barra de escala = 1 mm (LS = simple lobulus; PML = paramediana lóbulo; CP = cópula pyramidis).

Figura 3. Carro A. se expresa en la escalada terminales de fibra en la capa molecular. Barra de escala = 100 m. (Ml = capa molecular; pcl = capa de células de Purkinje; gl = capa granular) B. wholemount inmunohistoquímica de la expresión de CART en la NZ. Barra de escala = 2 mm (COP = cópula pyramidis; PML = paramediana lóbulo; PFL = paraflocculus, FL = flóculo).

Discussion

Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para la tinción wholemount éxito utilizando un enfoque de inmunohistoquímica versátil para la expresión de la proteína revelador en el desarrollo del cerebro y de adultos. Mediante el uso de este enfoque, los patrones de expresión complejos moleculares pueden ser analizados y la topografía del cerebro apreciado sin la necesidad de laborioso y procedimientos que consumen tejidos de seccionamiento.

Este protocolo se ha utilizado para revelar la expresión patrón de varias proteínas de las células de Purkinje tanto en el adulto ^1,2,8,9 y cerebelo temprano ratón postnatal ^10,11,12. Nuestros estudios originales también ha demostrado la utilidad del enfoque wholemount para el examen de células granulares la expresión del antígeno ¹ y anterógradamente trazados fibras musgosas ^2, que residen ~ 250 m por debajo de la superficie pial de la capa granular. Además, varios estudios han realizado modificaciones en el protocolo original para la tinción de éxito de las proteínas quen de Purkinje células ^1,13 (antígeno de recuperación) y las fibras aferentes ^7,14 (amplificación de la señal, Fig. 2.). Además, la tinción inmunohistoquímica wholemount se ha aplicado también al cerebelo de múltiples mamíferos y aves ^{4,15 16,17} especies, utilizados para mapa pérdida de células de Purkinje estampado en modelos de ratón de las enfermedades neurodegenerativas ^18,19, y modificado para teñir corazón ^20, pulmón nervios craneales nervios ^{21, 22} y ²³ de córnea. La salida principal del protocolo actual de las descripciones anteriores del ^1,2 wholemount método es que aquí ofrecemos no sólo de datos actualizados de más éxito cuando se utiliza el procedimiento, sino también una guía completa para la fijación del tejido, la disección de los tejidos y una en ilustración vídeo profundidad de la técnica.

Existen varias limitaciones de la tinción wholemount. En primer lugar, sólo patrones superficiales son típicamentecamente visualizado sin disección y la tinción o sin aumentar la longitud de tiempo que el tejido se incuba en anticuerpos. Además, la tinción de no llegar a las profundidades de la corteza, si se oculta por ^1,2 foliación. Sin embargo, el tejido teñido wholemount pueden ser seccionados después de la elaboración y restained, con el mismo anticuerpo u otra, para revelar los perfiles de expresión celular más profundo dentro del tejido ^1,2. En segundo lugar, el protocolo wholemount tinción básica es larga. Sugerimos que cada experimentador determinar empíricamente la eficacia de tinción de los anticuerpos y acortar el tiempo posterior a la fijación, acortar el número y la duración de los lavados, y / o acortar la duración de la incubación de los anticuerpos primarios. Con estos ajustes el protocolo puede ser completado en un tiempo considerablemente más corto. En tercer lugar, para cerebelo grande el protocolo de tinción wholemount requiere grandes volúmenes de las soluciones de anticuerpos, que pueden ser costosos y / o disponibles sólo en Quant limitadadades. Sin embargo, es posible salvar los anticuerpos primarios después de cada carrera mediante la congelación de la solución a -20 ° C. Cada investigador tendrá que determinar si su anticuerpo puede soportar la congelación antes de que se vuelve a utilizar. Hemos realizado con éxito tejido teñido con alícuotas previamente congelados de zebrinII. En cuarto lugar, no todos los anticuerpos son compatibles con el enfoque básico wholemount. Por ejemplo, el anticuerpo comúnmente usado para detectar la expresión de rayas de la proteína de choque térmico pequeño, Hsp25, requiere que el tejido se transforma primero para la recuperación de antígeno ^13. De todos modos, como para teñir secciones de tejido, los métodos tradicionales de solución de problemas de unión antígeno-anticuerpo también han demostrado su utilidad para la optimización de tinción wholemount.

Actualmente estamos explorando la posibilidad de adaptar nuestro protocolo wholemount para su uso con fluorescente etiquetados secundaria de anticuerpos. Con el microscopio adecuado equipado con la capacidad de imagen de color diferente fluorophores en baja potencia, uno sería capaz de no sólo analizar la organización de múltiples mapas de células de Purkinje en el mismo animal, sino también examinar la relación entre los patrones de bandas de Purkinje y las células de la topografía de Ventajas de Windows Original-Alexa etiquetados fibras aferentes en tres dimensiones ^2,4.7,24. Por otra parte, la reciente disponibilidad de bases de datos a gran escala de la expresión génica (Allen Brain Atlas, Genepaint, Gene Expresión Mapa del cerebro) han abierto nuevas vías para la fusión de nuestro enfoque de alto rendimiento con wholemount análisis del genoma completo para el examen de la topografía molecular de todo el cerebro.