Summary
체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이 칭했다
Abstract
Phenotypes는 물리적 (단백질 단백질 등) 및 기능 (예 : 유전자 - 유전자 또는 유전자)의 상호 작용 (GI) 1의 복잡한 일련의에 의해 결정됩니다. 물리적 상호 작용은 세균의 단백질은 단지로 등록 된 표시 할 수 있지만, 반드시 경로 수준의 기능 relationships1를 공개하지 않습니다. 이 삭제되거나 inactivated 유전자를 베어링 더블 돌연변이의 성장을 측정하고 해당 단일 돌연변이에 비해되어있는 GI 화면, loci 사이 epistatic 종속성을 조명하고 따라서 새로운 기능의 관계 2 검색하고 발견 할 수있는 수단을 제공 할 수 있습니다. 대형 GI지도는 효모 3-7과 같은 진핵 생물에 대해보고 있지만, GI 정보는 박테리아 genomes의 기능 주석을 방해 prokaryotes 8에 대한 희박한 유지되었습니다. 이를 위해, 우리와 다른 사람들은 높은 처리량 정량 세균 GI 검사 방법 9, 10을 개발했습니다
여기, 우리는 양적 E.를 수행하는 데 필요한 주요 단계를 제시 체계적으로 생성하고 식민지 배열 형식의 이중 돌연변이 다수의 피트니스을 측정하기 위해 자연 박테리아 활용과 상동 재조합을 사용하여 대장균 게놈 규모의 9 합성 유전자 배열 (eSGA) 심사 절차. 간단히, 로봇이 전송하는 데 사용됩니다 , 활용을 통해 chloramphenicol (CM)는 - 마크 F-받는 종자 - 엔지니어링 Hfr에서 돌연변이 대립 유전자 (재조합 높은 주파수) kanamycin의 정렬 배열 (관)에 '기증자 변종'을 표시했습니다. 일반적으로, 우리는에 손실 기능을 중요하지 않은 유전자 삭제를 베어링 단일 돌연변이 ( '케이'컬렉션 11 예)와 필수 유전자 hypomorphic 변이를 (감소 단백질 표현, 안정성, 또는 활동 9, 12, 13를 부여 즉 대립 유전자)를 사용 중요하지 않은, 필수 유전자, 고해상도의 기능 연관을 쿼리pectively. 상동 재조합에 의해 활용하고 다음의 유전자 교환 인한 후, 결과를 두 번 돌연변이는 모두 항생제를 포함하는 고체 매체에 선택됩니다. 가지 후, 플레이트는 디지털 이미징하고 식민지 크기는 양적 내부 자동 이미지 처리 시스템 14를 사용하여 채점하고 있습니다. GIS는 이중 돌연변이의 성장 속도가 예상보다 9 중 훨씬 더 나은 또는 더 나쁜 경우 공개됩니다. 악화 (또는 부정적) GIS는 종종 같은 필수 과정 2 가해진 보상 경로에서 유전자 쌍의 손실 기능 돌연변이 사이에 발생. 여기 하나의 유전자의 손실은 단일 돌연변이가 가능한이 같은 것을 버퍼입니다. 그러나 두 경로의 손실이 해로운이며, 합성 lethality 또는 질병 (즉, 느린 성장)에 발생합니다. 반대로, 경감 (또는 긍정적) 상호 작용과 같은 경로 나 복잡한 단백질 2 유전자 사이에 발생할 수 있습니다혼자 두 유전자의 삭제는 종종 경로 또는 추가 섭동 더, 따라서 성장을 활동을 줄이고하지 않는 등 단지의 정상적인 기능을 교란하기에 충분합니다. 전반적으로, 체계적으로 파악하고 GI 네트워크를 분석하는 것은 다른 방법으로 놓친 경로 수준의 정보가 9 유추 할 수있는 유전자, 많은 수의 사이의 기능적 관계의 편견, 글로벌지도를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
1. Recombineering 15, 16 Hfr 카발리 기증 돌연변이 변종을 구축
eSGA 기증자의 얼룩를 만들기위한 단계는 아래에 설명되어 있습니다. 간단히, 우리는 대상 λ를 사용하여 - 빨간색은 중요하지 않은 유전자 삭제 뮤턴트 (섹션 1.1) 또는 다음으로 사용됩니다 필수적인 유전자 hypomorphic 돌연변이 기증 변종 (1.2 항)을 만들 PCR에 의해 생성 된 증폭 선택 DNA 마커 카세트의 상동 재조합 16 조각을 중재 GI 네트워크를 정의하는 '쿼리'.
참고 : 기술 개발 과정에서, 우리는 잘 정의 된 Hfr 기증자 스트레인 (Hfr 카발리, Hfr 헤이즈, 그리고 Hfr 3000)를 사용하여 변이를 조합에 Hfr로 인한 conjugative 전송을 사용의 효과를 평가합니다. 우리는 (i) 효율적으로 유 외에 의해 개척 recombineering 방법을 사용하여 기증자 돌연변이를 만들 수있는 능력을 조사했다. (2000) 16, (ii)의 상대적 효율성conjugative DNA의 서로 다른 염색체 마커 전송, 그리고 (iii) 쿼리 유전자 위치와 Hfr 전송 궤적, oriT에 비해 염색체 방향의 효과.의 우리는 λ를 발견 - 레드로 인한 상동 재조합 효율은 Hfr 헤이즈 나 Hfr3000에 비해 Hfr 카발리에 훨씬 더했습니다. 필요한 경우, P1의 도입 또는 Psuedo Hfr 스트레인 17, 돌연변이 기증자를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 기증자 많은 수의을하고 검사를위한 모든 방법을 적응하고 있습니다. 우리의 시험 활용 실험에 전송 및 전 conjugants의 수의 전반적인 효율성이 Hfr 카발리와 상당히 크지 관찰하기 때문에,이 특정 스트레인 배경은 기증자 건설 및 대규모 eSGA에 선정되었습니다. Hfr 카발리에 기증자를 사용하여 eSGA 화면에 대한 모든 절차가 설명되어 있습니다.
- 중요하지 않은 유전자를 삭제하려면 다음 recombineering의 DNA 조각을 증폭
두 단계로 중첩 된 PCR ampli을 채용15 :; fication은 (그림 1) pKD3 플라스미드에서 CM 저항 마커와 대상 열려있는 독서 프레임을 교체하기위한 유전자 삭제 카세트 (AAL02033.1 단백질 이드 15,554,330 GI)를 만들 수 있습니다. 마커는 실험을 후속의 저항 유전자의 제거를, 필요한 경우 수 FRT-사이트 11으로 둘러싸인됩니다.
참고 : 우리는 박테리아 세포를 변환하는 이후 사용되는 증폭 제품의 플라스미드를 제거하는 두 단계 PCR을 중첩 않습니다. 플라스미드 제거 (첫 번째 PCR)를 한 후 두 번째 PCR의 유전자 녹아웃 카세트를 작성하는 것은 플라스미드와 변화가 훨씬 더 효율적으로 recombineering 이상이기 때문에 필요하며, 목표는 획득하는 것입니다 - 가능한 -이 유일한 변종 성공적으로 선택 표시와 함께 대상 게놈의 DNA를 바꿀 수 있습니다. 중첩 된 PCR에 대한 대안은 두 번째 PCR에서 증폭이 지역의 플라스미드 외부의 제한 다이제스트를 수행하는 것입니다단계. 그런 다음 제한 다이제스트의 제품은 정화되고 중첩 된 PCR 단계 (1.1.2)에서 템플릿으로 사용됩니다. 이 옵션은 간단하지만, 시간까지 더 많은 작업이 필요합니다.- 1070 BP 제품을 생산하기 위해 최선을 F1 및 역방향 R1 프리 머와 PCR의 템플릿으로 pKD3의 약 45 NG를 사용합니다. Qiagen PCR 정화 프로토콜을 사용하여 PCR 조각을 정화, 5 NG / μl 농도로 멸균 증류수에서 제품을 희석.
- 수 있도록 5'-끝에서 유전자 특정 호몰 로지 지역 (I) 45 NT가 유전자 별 (예 : 녹아웃) 중첩 된 프리 머, F2와 R2와 두 번째 PCR을 설정, 템플릿으로 정화 PCR 제품을 사용 상동 재조합에 대한 즉시 업스트림 및 다운 스트림 CM 마커의 합성을 수상 할 수있는 3' 엔드의 CM 저항 마커 및 (ii) 20 NT로 교체 할 수있는 대상 유전자의. 생산 조각의 크기는 1,123 BP 있습니다. 유전자 특정 호몰 로지 영역은 대상 작전을 제거하도록 설계되어 있습니다모든 인접 또는 부분적으로 중복되는 코드 세그먼트가 그대로 나오면서 프레임을 읽기 전용. 이 증폭 한 후, 1.3 단계로 진행합니다.
- 필수 유전자 hypomorphic 돌연변이를 만드는 태그 카세트를 증폭
- hypomorphic 기증자 돌연변이 변종을 만드는 데, 종종 약간 불안정 스크립트 풍부한 (즉, 단백질 사본 번호) 또는 단백질 접힘 / 활동에 의해 필수적인 단백질 기능에 미치는 영향 C-터미널 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) 퓨전 태그를 추가 할 수 있습니다. 이를 위해 pJL148에 관 마커 측면을 노릴 동일한 염기 순서와 pKD3 15 CM 마커 사이에 recombineering를 사용하여 CM에 pJL148 18 칸 저항 마커를 변환하여 선택 SPA 태그 (SPA-CM) DNA 템플릿을 만들 수 있습니다. 그 결과 템플릿 CM 저항 마커 다음에 프레임 SPA 태그로 구성되어 있으며, PCR 증폭, recombineering 및 그 이후의 eSGA 12 적합합니다.
참고 : </ strong>을 필수 유전자 잠재적으로 유전자 기능 연구에 대한 가장 흥미로운입니다. 이 유전자는 삭제할 수 없습니다 때문에, 혁신적인 방법은 필수 유전자의 기능 관계를 조사하기 위해 개발해야했습니다. 여러 적합한 성공적인 접근 방법은 효모에서 처음 개발되었습니다. 예를 들어, Davierwala 외. (2005) 19 수행 GI 화면 575 온도에 민감한 필수적인 유전자 돌연변이의 패널을 사용하고 필수 유전자 불필요한 유전자와 같은 GIS 다섯 배 번호에 대해 전시 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, Breslow 외. (2008) 20 (습기) 경로와 단지를 공부하는 것이 중요 효모 유전자의 ~ 82%을 포함 hypomorphic 대립 유전자의 라이브러리를 생성하는 방법 'mRNA의 섭동에 의해 감소 풍부한'를 개발했다. 젖은 접근 가능성으로 인해 불안정을 mRNA로 대상 유전자 6 수준을 감소 표현 mRNA의 3'end을 수정합니다. 습기 접근 6, 우리 strateg과 유사y는 필수 단백질의 표현 mRNA의 3 '끝을 perturbing의 미묘한 효과를 이용하는 것이 었습니다.
우리가 아래에 설명으로 자체 태그 가능성이 단백질 접힘 또는 기능에 영향을 미치지 않지만, 환경 스트레스 나 다른 변이와 결합 할 때 태그에 의한 mRNA의 미묘한 섭동은 충분하다, 기능적 정보를 유전자 - 환경 13 유전자를 나타 내기 위해 - 유전자 9, 12 상호 작용을 확인할 수 있습니다.
첫째, 지금까지, 우리는 중요한 단백질은 우리 SPA 태그 변종 8 중 대표되는 307 대장균의 80 % 이상과 함께 ~ 3,000 필수 및 비 필수 대장균 단백질 21-23를 정화 SPA-태그를 사용했습니다. 태그가 서로 확인 된 알려진 단백질 복합체를, (같은 시설이 태그에 의해 분리 될 수 즉 같은 복잡한 내에서 서로 다른 단백질을 정화) 분리하는 데 사용 되었기 때문에, 그리고 우리가 이유 고립 된 단지는 생물학적 관련성이 그 태그 할일반적으로 단백질 접힘 또는 기능 12 영향을 미치지 않습니다. 마찬가지로, 우리되지 않은 관찰은 자체적으로 태그는 일반적으로 스트레인 성장에 영향을주지 않습니다 밝혔다. 그러나, 우리는 축축한 변종 6보고있다가, 태그와 아이콘 카세트를 통합하여 3'-UTR을 변경하면 RNA 수준에서 특정 스크립트를 불안정하게하거나, 드문 경우에의 적절한 접는 또는 기능을 방해 수 있다는 판단 퓨전 단백질. 따라서, 우리는 이러한 결합하는 것은 실제로 9, 12, 관찰 된 정보를 GIS에 초래 다른 게놈의 다른 기능적으로 관련 변이와 필수 유전자의 대립 유전자를 어리둥절 것으로 예상했다. 필수 유전자뿐만 아니라, SPA 태그 대립 유전자는 니콜 외하여 phenotypic 프로파일 작업에 따라 유전자 - 환경 상호 작용 (예를 들면 약물 과민성) 전시. 성장 조건 다양한 SPA 태그 필수 변종의 일부를 받게 (2011) 13. 동일한 연구 confirmeD 그 SPA 태그 (58 테스트 54 개) 가장 중요한 변종은 SPA 태그는 게놈 전체에 대한 유용한 필수 유전자의 가벼운 hypomorphic 대립 유전자를 자주 만들어 개념을 지원하는 하나 이상의 문화 조건 13에 장애인 피트니스을 보여 주었다 eSGA 포함 GI 화면 응용 프로그램입니다. - 동종 (II) 다음의 5 '끝 부분에 recombineering에 S1과 S2 유전자 특정 프리 머, 각 포함은 (i) 45 NT 유전자 특정 지역을 사용하여 SPA-CM 템플릿에서 태그 카세트를 증폭 27 BP SPA- 3 '마지막에 CM 특정 순서.
- hypomorphic 기증자 돌연변이 변종을 만드는 데, 종종 약간 불안정 스크립트 풍부한 (즉, 단백질 사본 번호) 또는 단백질 접힘 / 활동에 의해 필수적인 단백질 기능에 미치는 영향 C-터미널 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) 퓨전 태그를 추가 할 수 있습니다. 이를 위해 pJL148에 관 마커 측면을 노릴 동일한 염기 순서와 pKD3 15 CM 마커 사이에 recombineering를 사용하여 CM에 pJL148 18 칸 저항 마커를 변환하여 선택 SPA 태그 (SPA-CM) DNA 템플릿을 만들 수 있습니다. 그 결과 템플릿 CM 저항 마커 다음에 프레임 SPA 태그로 구성되어 있으며, PCR 증폭, recombineering 및 그 이후의 eSGA 12 적합합니다.
- 확인 및 PCR 제품을 정화
- 태그 카세트가 올바르게 아가로 오스 겔 전기 영동에 PCR 제품 2-5 μl를 subjecting하고 제조업체의 표준 PCR 정화 프로토콜 (Qiagen)에 따라 나머지 DNA를 정화에 의해 증폭 된 것을 확인합니다. 멸균 증류수 30 μl의 PCR 제품을 Elute과 ~ 50 NG / μl 농도로 희석. purifi에드 제품은 최대 사용까지 6 개월에 대한 변화에 즉시 사용 (단계 1.5) 또는 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 기증 건설 Hfr 카발리 관할 세포를 준비
- 250 ML 플라스크에서 50 μg / ML 암피실린의 35 μl와 신선한 Luria-Bertani (LB) 배지의 70 ML에 Hfr 카발리 변형의 포화 밤 문화의 하나 ML의 예방. (~ 2 시간) 얻을 수 있습니다 광학 밀도 (OD)까지 220 rpm으로 ~ 0.5-0.6 600 나노 미터를 흔들며와 32 ° C에서 문화를 품다.
- 42에서 λ 붉은 재조합 시스템 (16)의 열 유도를위한 물 목욕 ° 160 rpm으로 흔들어있는 15 분을위한 C에 문화를 전송합니다. 160 rpm으로 10-20 분을위한 차가운 얼음 슬러리 물 목욕 문화를 전달하여 유도를 중지합니다. 사용하기 전에 사용 튜브와 적어도 15 분 동안 얼음에 냉각 된 큐벳을, 변환이 끝날 때까지이 시점에서 세포가 감기에 보관하시기 바랍니다.
- C를 나눈다동일이 사전에 차가운 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브 (튜브 당 ~ 35 ML 문화)과 4에서 6 분에 4,400 XG에서 원심 분리기 ° C.에 ulture
- 표면에 뜨는을 취소하고의 부드러운 반전으로 다시 중단 세포 펠렛 ~ 얼음처럼 차가운 멸균 증류수 50 ML. 4 ° C.에서 6 분에 4,400 XG에서 다시 세포를 원심 분리기 표면에 뜨는을 취소하고 다시 일시 중지 된 각 셀 펠렛 얼음처럼 차가운 무균의 10 % 글리세롤의 20 ML에하고 위에 설명 된대로 다시 원심 분리기.
- 표면에 뜨는을 가만히 따르다과 얼음처럼 차가운 10 % 글리세롤 500 μl의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 즉시 변형에 대한 개별, 사전 차가운 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브에 50 μl 권 나누어지는 준비된 유능한 셀을. 최대 3 개월까지에 세포는 드라이 아이스 나 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그러나, 변환 효율은 신선하게 조리 된 유능한 세포로 최고입니다.
- 변환
- 정화 PCR 제품의 100 NG를에서 추가관할 셀에 1.3.1 단계. 관을 영화 5 분 동안 얼음에 앉아 정지 할 수 있습니다.
- 미리 차가운 electroporation 큐벳에 얼음처럼 차가운 유능한 세포와 DNA의 일시 중지를 전송합니다. 2mm 간격 큐벳에 설정 2.5 KV, 25 μF, 200 옴과 세포 혼합물을 Electroporate (예 : 다른 큐벳을 사용하는 경우, electroporation 설정에 대한 제조업체의 지침을 참조하시기 바랍니다), 그리고 즉시 상온 SOC 매체 1 ML를 추가합니다. 궤도 220 rpm으로 흔들어 1 시간에 32 ° C에서 15 ML 문화 튜브 및 배양에 SOC 매체에 electroporated 세포를 전송합니다.
- 부화 후, 실온에서 5 분에 4,400 XG에서 세포를 원심 분리기. 표면에 뜨는 약 850 μl를 제거하고, 나머지 액체에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 32 ° C 하룻밤에 17 μg / ML CM 및 배양을 포함하는 사전 예열 LB 플레이트에 세포를 확산. LB에 두개 나 개인 transformant의 식민지와 승리를 선택-CM 돌연변이 확인을 접시. 우리는 희귀 억제 변이와 변종을 선택할 수있는 가능성을 줄이기 위해 가장 큰 transformant 식민지을 피하시기 바랍니다. 또한 연속은 LB-칸에 동일한 transformants는 긴장이 칸 방지 아니라는 것을 확인합니다.
참고 : CM 저항 마커가 기증자의 변종을 만들기 위해 사용되기 때문에, 우리는 기증자 뮤턴트 칸 방지있을 거라고 기대하지 않습니다. LB-칸과 LB-CM 플레이트 모두에 transformants을 좋겠어함으로써, 우리는 기증 돌연변이 자체는 어떻게 든 칸 저항을 발생하지 않은 있는지 확인하십시오. 이 단계를 수행하고 대상 변이가 관에 생존 할 수있는 변형의 능력에 영향을 미치는 있었다되지 않은 경우, 두 번 돌연변이가 기증 변종이 모든 선택 단계를 생존 있기 때문에 효율적으로 eSGA를 사용하여 만든되지 않습니다. 이 단지 예상치 못한 phenotypes 또는 eSGA 화면의 완성에 영향을 줄 수있는 다른 문제를 잡을 수있는 예방 논리적 단계입니다. 이 단계는 생략 된 경우 다른 컨트롤 woul여전히 실패 화면을 확인 싶네요. 그러나 칸에 강하고 기증자의 이전 감지 비생산적인하고 불필요한 일련의 단계를 제거합니다. 칸에서 성장하는 부담 예를 들어 포함될 수에 대한 다른 가능한 원인은 잘못된 PCR 제품 또는 변형의 변형의 사용으로 항생제뿐만 아니라 만료되었습니다. 이러한 모든 문제는 식별하고 필요하지 않습니다이 컨트롤의 도움을 프로 시저에서 조기에 처리하지만, eSGA 추천 할 수 있습니다.
- 중요하지 않은 유전자 삭제 (단계 1.6.1) 또는 필수 유전자 hypomorphic 돌연변이 (섹션 1.6.2)를 확인
참고 : PCR로 유전자 삭제를 확인하면, 야생 형 변형의 게놈 DNA가 컨트롤로 사용되어야합니다.- 중요하지 않은 유전자 삭제를 확인
- PCR에 의해 유전자 삭제를 확인하려면 manufact에 따라, 액체 LB-CM 매체에서 재배 변형, putative 한방의 변종에서 게놈 DNA를 분리urer의 지시 (Promega).
- 성공적인 recombineering을 확인하려면 녹아웃 확인 프리 머의 세 가지 다른 세트와 함께 각 transformant에서 DNA를 증폭. 게놈 DNA 템플릿의 150 NG으로 반응을 수행하고, 아가로 오스 젤에 PCR-합성 제품을 실행하여 올바른 조각 크기를 확인합니다.
- 첫 번째 프라이머 세트는 CM 카세트 순서를 보완합니다 20-NT 측면을 노릴 대상 지역 (KOCO-F)의 200 BP 상류에 위치한 프라이머, 그리고 CM-R 뇌관으로 구성되어 있습니다. 이 증폭는 돌연변이에 445 NT의 amplicon을 생산하지만, 야생 형 변형 (그림 1)에 예상된다.
- 두 번째 세트는의 3 '끝 200 BP 하류를 단련하기 위해 설계되었습니다 CM 카세트 시퀀스로 어닐링 기대 입문서 (CM-F), 그리고 확인 프라이머 측면을 노릴 20-NT의 역 (KOCO-R)을 포함 유전자를 삭제했습니다. 이 증폭 반응은 돌연변이에 309 NT의 amplicon을 생산 할 것으로 예상,하지만 더 있습니다야생 형 변형의 t (그림 1).
- 세 번째 PCR은 KOCO-F와 KOCO-R 프리 머 포함되어 있습니다. 이 반응 한 유전자 궤적이 카세트에 의해 대체, 다른 하나는 중복되지만 다른 야생 형 유전자 사본 여전히 존재당한를 선택한 변형이 merodiploid 아니라는 것을 확인하기 위해 필요합니다. 올바른 삭제 돌연변이에서 증폭은 1.4 이하 제품 (그림 1)을 생산 할 예정이다.
참고 : 대상 유전자가 유전자 삭제 카세트 등의 기본 쌍의 동일한 길이에 대해이 경우, 하나의 카세트로 대체되었습니다 궤적, 그리고하지 않은 궤적의 차이를 발견하지 않습니다. 이러한 경우에 최종 확인을 위해, 우리는 특별히 삭제 된 유전자 내에 DNA 세그먼트를 증폭하기 위해 추가 프리 머를 사용하는 것이 좋습니다. 유전자가 삭제 된 경우이 경우에는, 증폭 제품은 야생 유형 컨트롤 변형과가 아닌 돌연변이의 관찰됩니다. 이러한 프리 머수동이거나 계산 특별히 삭제 된 영역 내에 DNA의 세그먼트를 증폭하도록 설계 할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 140 BP 영역을 증폭.
- 필수 유전자 hypomorphic 변이를 확인
- PCR에 의한 hypomorphic 변이를 확인하려면 유전자 별 20 NT 앞으로 (KOCO-F)와 SPA 태그 삽입 사이트의 각각, 200 BP 업스트림 및 다운 스트림에 위치한 역 프리 머 (KOCO-R), (그림 2)을 사용합니다.
참고 :이 증폭 단계가 대상 필수적인 유전자의 태그가 지정되지 않은 사본의 부재를 보장하기 위해 컨트롤로 사용됩니다. 만 태그 버전이 존재하는 경우, SPA-CM의 amplicon보다 큰 단일 밴드 310 BP가 관찰된다. 400 BP 제품은 유전자의 태그가 지정되지 않은 버전의 존재를 신호합니다. - PCR 확인에 평행에서 SP의 깃발 epitopes에 맞는 안티 - 플래그 M2 항체를 사용하여 Western은 SPA-태그의에 프레임 삽입을 확인 blotting 사용A-태그 21.
- PCR에 의한 hypomorphic 변이를 확인하려면 유전자 별 20 NT 앞으로 (KOCO-F)와 SPA 태그 삽입 사이트의 각각, 200 BP 업스트림 및 다운 스트림에 위치한 역 프리 머 (KOCO-R), (그림 2)을 사용합니다.
- 중요하지 않은 유전자 삭제를 확인
- 확인 기증자 부담을 저장
- , 라벨 cryovials에 확인 재조합 기증자 돌연변이 스트레인의 밤 문화를 전송 15% 최종 농도에 글리세롤과 보완, 그리고 잘 섞는다. 장기 저장을 위해, -80에서 cryovials을 유지 ° C.
2. E.를 Arraying eSGA 스크린에 대한 대장균 F-받는 돌연변이
- 복제 핀 E. 모리 외에 의해 생성 된 대장균 게이오 하나 중요하지 않은 유전자 삭제 돌연변이 모음입니다. 잘 당 액체 LB 미디어의 80 μl를 포함하는 이십사 384도 microplates에 robotically (3,968 변종 11; F-BW25113는 오픈 Biosystems에서 구할 수 있습니다) , 50 μg / ML 칸과 보충
참고 : 체계적으로 중요한 유전자와 GIS를 평가를 들어,받는 사람 게이오 컬렉션 11 F-칸 표시 필수적인 유전자 hypomorph을 보충 할 수 있습니다C-터미널 SPA-태그 22 IC 돌연변이 변종, 23. - 긍정적 인 제어 역할을 국경 제어 변형에 대한 공간을 확보하기 위해,뿐만 아니라 자동화 된 식민지의 quantizations에서와 같이 내부와 판 normalizations 사이에 원조는 위 단계와에 전송에서 각 판의 바깥 쪽 우물에서 주사 미디어를 제거 새로운 접시는 다시 바깥 우물이 비어 둡니다.
참고 : 게이오 수집 11 일부터 국경 관리 부담 JW5028는, 우리의 전체 - 게놈 화면에서 모든 기증자와 GIS를 전시하지 않은해서는 안 작은 의사 유전자에 대해 삭제됩니다. 따라서이 활용, 달아, 또는 선택에 실패했을 때 없거나 산발적 국경 변형 성장의 결과로, 희귀 한 인스턴스를 식별 할 수있는 좋은 긍정적 인 제어 변형입니다. 국경 제어 식민지 이중 돌연변이 선택 후 성장하지 않는 경우 예를 들어, 쿼리 스트레인 활용을 할 수 없으며, 활용은 내가하려고 시도했을 수 있습니다장소 (항생제 함유 접시에 예를 들어) 또는 잘못된 항생제를 복용에서 방해 없음 상태는 선택 판에 추가되었을 수 있습니다. 거의, 산발적 식민지가 국경을 포함하여 전체 판에 관찰하는 경우 마찬가지로, 활용 또는 자동 지정이 실패했을 수 있으며 화면 반복해야합니다. 이 산발적 국경 성장이 재현 인 경우에는 지속적으로 가난한 기증 활용을 나타내는 수 있으며, 따라서 이중 돌연변이가 관찰되지 않는 경우는 가능한 활용 실패, 사실이 아니 GIS로 인해 수 있습니다. 이러한 화면은 추가 분석에서 폐기해야합니다. 또한, 모든 접시에있는 존재하여 국경 관리 부담은 식민지 양자화 소프트웨어가 자동으로 두 돌연변이 접시 따라서 식민지 위치를 수동으로 demarcated 할 필요가 없습니다에 대한 식민지의 위치를 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 국경 제어 변형에서 식민지 크기의 정상화에 보조 (접시 내에서 예를 들어 서로 다른 행)와 betw단다 (예 : 다른 수신자 플레이트가 서로 다른 시간에 동일한 기증자로 고정) 접시. - 마찬가지로, 각 플레이트 내의 다른 위치 (안 국경)에서 두 개의 변종을 제거하여 대조군 명소를 생성하고 새 접시에 긴장을 전송하기 만하면됩니다. 17 μg / CM의 ML을 포함하는 LB 미디어와 함께이 빈 우물을 입력합니다. 이러한 부정적인 제어 장소는받는 사람, 따라서 이중 돌연변이 접시에 비어 및 이미징, 번호, 또는 번호판을 달아 때 더 처리 또는 플레이트 처리 오류가 없었습니다 수 있도록 할 것으로 예상됩니다.
참고 :이 빈 곳이 부정적인 컨트롤을해야합니다. 부정적인 제어 변종은 선택 기간 동안 성장하면 - 제외 컨트롤은 선택이 실패하면 인스턴스를 식별하는 데 도움이됩니다. 우리는받는 판 각각에 대해 고유 한 대조군 장소를 선택뿐만 아니라뿐만 아니라 접시 같은 사분면에서 대조군 명소 (오른쪽 아래를 예를 들어)을 선택하는 것이 좋습니다. 이 방법 패턴대조군 명소의 가능한 플레이트 mishandling 오류 (예 : 접시는 라벨이 잘못 지정된되는 또는 왼쪽 상단 식민지는 오른쪽 아래 위치에 고정되어있는 위치를 거꾸로 고정되는)을 식별합니다. - 50 μg / 우리 전체 - 게놈 eSGA 화면에 따라 칸의 ML을 포함, 200 ML의 LB와 500 ML 플라스크에, pseudogene 삭제와 함께, 게이오 변형 할 JW5028 11 예방이 특정 돌연변이의 성장은 야생에 가까운 것입니다 유형 BW25113하고 따라서 국경 통제로 사용됩니다.
- 600 nm의에서 0.6-32에서 잠을 자면 배열 변종뿐만 아니라 JW5028 문화 ° C 190 rpm에서 궤도와 ~ 0.4의 OD에 떨고 성장. 박 성장 후, JW5028 밤 문화의 약 80 μl와 국경 우물 입력하십시오.
- 조립 플레이트는 단계 3.2 사용할 수 있습니다. 또한 장기 저장을 위해, 15 % 글리세롤로받는 판에 각 우물을 보완 미디어 및 글리세롤을 혼합하고, 접시를 유지-80에서 ° C.
3. E. 생성을위한 고밀도 스트레인 번식 절차 대장균 더블 돌연변이
- 32에서 잠을 자면 CM, ° C 풍부한 LB-CM 액체 매체에서 (17 μg / CM의 ML) 220 rpm으로 흔들어로 표시된 쿼리 돌연변이 베어링 Hfr 기증자의 부담을, 성장.
- 병렬 50 μg / 칸의 ML을 보충 고체 LB 플레이트에 384 식민지 밀도에 명령을받는 돌연변이 컬렉션을 핀, 17 μg과 보충, LB 플레이트의 동일한 번호에 384 식민지 밀도의 기증자 쿼리 돌연변이 부담을 핀 CM의 / ML. 32 ° C.에서 하루 아침에 접시를 품다
참고 : 자동 지정에 사용되는받는 사람 번호판 이후 단계 충분히 큰 식민지를위한 36 시간까지 요구할 수 있습니다. 평균 국경 식민지의 크기는 직경 2mm (또는 이상)에 대해되면, 번호판 고정 할 준비가 된 것입니다. - 긴장을 결합한하기에 384 식민지 박 기증자 판에서 기증자를 핀고체 LB 플레이트합니다. 이후에 활용 판에 갓 고정 기증을 통해 하나의 384 식민지받는 판을 핀. 모든 기증자 -받는 접시는 고체 LB의 활용 플레이트에 달아 의한 복합 될 때까지 걸어주는 계속합니다. 16-24 시간에 32 ° C에서 고정 된 결합 판을 품다.
참고 : 개별 단일 돌연변이 기증 긴장 때문에 활용에 변이, DNA 전송 효율, 또는 피트니스의 잠재적 인 효과를 결합 효율의 유전자 - 투 - 유전자 변화를 표시 할 수 있습니다. 성장은 16 충분히 큰 식민지가 후속 달아 단계에 획득 한 24 시간 사이 언제든지 중지 할 수 있습니다. 24 시간에 16 지속 Conjugations는 약간 낮은 피트니스를 늦게 전송 유전자 또는 돌연변이의 돌연변이에 대한 재현 eSGA 결과 전 conjugants의 충분한 숫자를 생산하고 있습니다. - 하나의 고체 LB 플레이트가 포함 CM (17 μg / ML)과 관 (50에 각 384 밀도 활용 판을 고정모든 활용 플레이트까지 μg / ML)가 고정되었습니다. 32 ° C.에 16-36 시간에 대한 신선하게 고정 첫 번째 선택 판을 품다
참고 : 선택 단계에 관해서, 시간의 다른 금액이 다른 기증자 화면에 필요할 수 있습니다. 해당 화면에서 모든 두 돌연변이가 동일한 기증자 돌연변이가 있기 때문에 평균적으로 느린 성장 기증 돌연변이가 느린 성장을 더블 돌연변이에 상승을 제공합니다. 따라서, 기증자 피트니스에 따라, 선택 단계는 16과 36 시간 사이에 요구할 수 있습니다. 이중 돌연변이 두 번째 이후 첫 번째 선택 또는 이미징 후 달아도 다음 단계 충분히 큰 경우 이중 돌연변이 성장이 중단 될 수 있습니다. 이 사이트는 보통 최소 2mm 직경과 평균 제어 식민지 국경으로 변환합니다. - 1536 - 식민지 형식으로 두 번째, 두 약물 (CM 및 관), 선택 판에 각 첫 번째 선택 판 다시 핀 각 첫번째 선택 식민지가에 네 개의 식민지로 표시되는 등두 번째 선택 플레이트. 32 ° C.에 16-36 시간에 대한 번호판을 품다 양적 돌연변이의 성장 피트니스를 측정하고 유전자 쌍 사이의 상호 작용 (그림 3) 분석의 마지막 두 돌연변이 선택 번호판을 사진에 담아보세요.
참고 : merodiploidy (일부 염색체 중복)의 주파수가 약 1 / 1, 000 셀 24에 낮은이지만, merodiploidy은 GI를 숨길 수 있습니다. 따라서, 우리는 생물학적 모든 eSGA 화면에서 복제를 포함하는 것이 좋습니다. 다행히, 상업 일회용 접시 및 플라스틱 달아 패드는 다음과 같은 자료를 살균하여 세 번까지 재사용 될 수있다 :이 플레이트에서 한천은 무시되고 접시뿐만 아니라 패드 이어, 야간 10 %의 표백제에서 그들을 몸을 담글 수의 소독 아르 70 % 에탄올에 세척하고, 자외선 아래의 흐름 후드에 plasticware에 공기 건조, 증류수로 씻어. 살균 패드와 접시는 사용 전까지 밀봉 멸균 비닐 봉지에 저장됩니다.
4. 데이터를 처리하고 GI 점수를 파생
- 배치 모드에서 각 판에 식민지를 측정하거나 개별적으로 전문 식민지 이미징 소프트웨어 3, 9를 사용.
참고 : 적절한 Java 기반 높은 처리량 식민지 이미징 및 점수 응용 프로그램이 지금 공개 액세스 (에 자유롭게 사용할 수 있습니다 http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). 이 소프트웨어는 다른 플랫폼 (예 : Mac 또는 PC)에서 작동하고 실행 또는 터미널 창에서 하나 시작 할 수 있습니다. - 이러한 판 가장자리 효과, 간 판 변형 효과, 불규칙한 이미지 조명, 한천 표면의 물리적 곡률로 인해 유물, 이웃 식민지에 대한 경쟁 효과와 가능한 달아 결함으로 판 내에 사이의 체계적인 편견에 대한 수정하여 원시 식민지 크기 측정을 정상화 , 성장 시간뿐만 아니라 차이점
- 에지 행과 열을의 식민지는 접시의 중앙에 발견보다 영양소에 대한 낮은 경쟁으로 인해 더 큰 경향이 있습니다. 따라서,이 효과 해결하기 위해, 에지 식민지의 크기가 해당 행 또는 열에서 중간 크기가 접시의 중앙에 콜로니의 평균 크기 같은 것을 같은 것으로 확장.
- 계정으로 복제 식민지 측정의 평균 크기의 재현성과 표준 편차를 취할 통계적 결과를 분석합니다. 적어도 셋이 독립적 인 생물 복제 실험은 실험 재현성을 평가하는 데 필요한 수 있습니다.
- 마지막으로, 다음과 같은 수식을 사용하여 각 유전자 쌍에 대한 GI 점수 (S)를 생성하기 위해 정규화 된 중간 식민지 성장 피트니스 크기를 사용합니다 :
N 1 "SRC ="/ files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
어디, S VAR = (VAR 특급 X (N 개의 특급 -1) + VAR Cont X (N Cont -1)) / (N 개의 특급 + N Cont -2), VAR 특급 = 정규화 된 식민지 크기의 최대 변화에 대한 두 돌연변이, 참조 집합의 정규화 된 이중 돌연변이 식민지 크기에 변동의 VAR Cont = 중간, N의 특급 더블 돌연변이 식민지 크기 측정 = 수, N Cont = 실험의 중간 숫자가 모든 실험을 통해 복제, μ의 특급 = 평균 정규화 된 이중 돌연변이의 식민지 크기 및 μ의 Cont = 단일 기증자 돌연변이 변종으로 인해 발생하는 모든 두 번 뮤턴트 정규화 된 식민지 크기의 중간. S-점수는 putative digenic 상호 작용의 통계적 신뢰도뿐만 아니라 상호 작용의 생물학적 힘을 모두 반영합니다. 강한 긍정적 인 S-점수는 경감 효과, S를 표시S-점수 부정적인 의미가 합성 질병이나 종종 병렬 이중화 경로 9 회원의 암시입니다 lethality을 반영하면서 상호 작용하는 유전자가 같은 경로 9 참여하는 uggesting. 경로 수준의 기능의 관계를 결정하는 경우, 테스트 유전자의 각 쌍에 대한 하나의 S-점수는 최종 데이터 세트에서 생산된다.
참고 : 이전 연구 9, 우리는 재조합가 서로 30 kbp 내에서 유전자 사이에 더 자주 발생하는 경향이있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 하류 분석을 위해, 정상화 및 점수 세대에 따라, 우리는 서로의 30 kbp 내에서 유전자 사이의 상호 작용을 제거합니다. GIS 자체뿐만 아니라, 유전자 쌍 사이의 기능적 관계는 두 유전자의 GI 프로파일이 얼마나 유사한보고 조사 할 수 있습니다. 유전자의 GI 프로파일 이외의 게놈에있는 다른 모든 유전자와 그 유전자의 상호 작용의 집합입니다유전자의 결합 공간이 마련되어 있습니다. 기능적으로 유사한 유전자는 유전자 상호 작용 프로파일 12, 25 높은 상관 관계를 가지고하는 경향이 있습니다. 따라서, 실험 데이터 세트에있는 모든 유전자에 대한 상관 계수를 계산하여 하나는 염색체에 가까이 서로 거짓말 유전자 사이의 기능적 관계를 조사에 eSGA을 사용할 수 있습니다.
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Discussion
우리는 GI을 조사하여 경로 수준에서 박테리아 유전자 기능을 조사하기 위해 로봇 eSGA 검사를 사용하기위한 단계 - 현명한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 이 접근 방식은 E.에서 개별 유전자뿐만 아니라 전체 생물 시스템을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 대장균. 조심스럽게 모든 적절한 컨트롤을 포함 위에서 설명한 실험 단계를 실행하고, 엄격하게 분석하고 독립적으로 GI 데이터가 새로운 기능 발견을 만드는 eSGA의 성공을 위해 중요한 요소 아르 확인. eSGA, E.에 GI를 연구를위한 개념적으로 유사한 방법 외에 대장균은 거대한 - 대장균 17 칭했다, 종종 proteomic 23 나 혼자 phenotypic 13 화면과 같은 다른 방법에 의해 놓친 아르 소설 기능의 관계를 조명하는 데 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 게놈 차원의 접근 방식과 마찬가지로 제한이 예를 들어 다른 세균 종까지 eSGA 또는 대형 - 대장균의 적용에 존재 않습니다. 이 부분적으로 할 수 있습니다특히 대상 mutagenesis는 상동 재조합의 낮은 고유 진동수에 의해 방해되어 종에 대해, 대부분의 세균 종에 대한 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 삭제 스트레인 모음 수 없다 때문에. 이러한 경우, 이러한 TnSeq 31과 같은 임의의 추적이 가능한 mutagenesis 기반 assays과 같은 방법을 사용하여 유전자 중단은 잠재적으로 세균 유전자의 기능을 조사 사용할 수 있습니다. 신흥 다른 세균 유전자 검사 절차에 대한 개요를 보려면 Gagarinova와 Emili (2012) 32의 검토 용지를 참조하십시오.
GI 방법은 종종 많은 흥미로운 연결을 표시하지만 소설 기계론의 링크 등 phenotypic 프로파일 13, 물리적 상호 작용 네트워크 22, 23, 및 GC-유추 협회와 같은 다른 정보와 이러한 데이터의 통합을 암시 특히 정보가 될 수 있습니다. 예를 들어, 보존을 기반으로하는 GI 네트워크, GC 협회와 같은유전자 명령 (operons)으로, 세균 유전자 fusions, genomes에 걸쳐 예측 operons의 intergenic 거리에서 파생 오페론 재조합 주파수뿐만 아니라 phylogenetic 프로파일 33과 같은 세균 세포가 중재 및 주요 조정 기능 경로로 단백질 복합체를 구성하는 방법에 추가 통찰력을 제공 할 수 있습니다 셀룰러 프로세스 12, 23.
대장균은 다른 그람 음성 박테리아의 분자 생물학을 이해하는 데 주력 모델입니다. 이를 위해 eSGA GI 데이터는 다른 proteobacterial 종에 걸쳐 eSGA에 의해 발견 기능 관계 및 Prokaryotic taxa의 진화 절약을 조사 비교 게놈 정보 (예 : phylogenetic 프로파일, 유전자 발현 프로파일)와 함께 사용할 수 있습니다. 또한, 상호 작용 데이터는 E.에 대해 생성 대장균은 metageno에 의해 발견 미생물의 경로 아키텍처에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다마이크가있는 기능 특수 효과는 부족합니다. 많은 유전자가 널리 모든 미생물 23에서 보존되기 때문에, 그리고 항생제 감도는 특정 유전자 섭동 (34)에 의해 향상 될 수 있기 때문에, eSGA에 의해 조명 기능 관계도 잠재적으로 혁신적인 조합 약물 요법을 디자인에 이용 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 게놈 캐나다, 온타리오 유전체학 연구소, 그리고 JG 및 AE AG에 대한 건강 연구 보조금의 캐나다 연구소의 자금에 의해 지원되었다 Vanier 캐나다 대학원 장학금의 수상자이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
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