冷冻干燥细菌及其影响细胞生存的配方

Summary

冷冻干燥往往是一个简单方便的方式来获得可行的细菌细胞的干制品。一个问题的过程，是细胞的存活。我们这里详细调查冷冻干燥过程中的细胞的存活的影响所用的公式的属性的一个过程。

Abstract

细胞水，可以去除可逆性灭活微生物，以方便存储。去除的一种这样的方法是冷冻干燥，这被认为是一个温和的脱水方法。在干燥过程中，以促进细胞的存活，细胞常常预先制定。的配方形成嵌有该细胞，并保护他们免受各种有害应力，在冷冻干燥过程中施加于细胞的矩阵。在这里，我们提出了一种通用的方法来评价冷冻干燥后的细胞的存活率，我们说明通过比较所得到的结果与四个不同的配方：二糖蔗糖，蔗糖衍生的聚合物聚蔗糖PM400，和各自的多糖羟乙基纤维素（HEC ）和羟丙基甲基纤维素（HPMC），两种菌株的细菌，P.恶臭 KT2440和A. A6 chlorophenolicus。在这项工作中，我们说明如何准备冷冻干燥制剂，以及如何调查mechan主义的特征的制剂，使用差示扫描量热法（DSC），表面张力测量，X-射线分析，电子显微镜和有关这些数据传送到生存率补液后的细胞的存活。对聚合物进行选择，得到各自的多糖类似蔗糖的单体结构到不同程度。使用这种方法设置，表明聚合物可以支持细胞的存活，有效二糖制剂的某些物理性质的控制^1。

Protocol

1。种植和收获的P恶臭

1. 准备起动恶臭假单胞菌文化与体育的殖民地接种100毫升的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB） 恶臭细胞在琼脂上培养，用胰蛋白酶大豆肉汤（TSA）的补充。保持在30°C的文化在摇板设置在130转。
2. 7小时后从起始培养相当于主培养的最终体积为1/10的等分试样转移到新鲜TSB培养基。在30℃下在摇板在每分钟130转的保持细胞16小时。
3. 生长16小时后收获细胞通过细胞培养物以1500×g，20分钟，在RT纺丝。倒出上清液，并洗涤细胞重新悬浮细胞沉淀中的NaCl溶液是等渗的生长介质。在这种情况下，使用150 mM氯化钠溶液。然后将细胞离心一次，并倾出上层液重悬细胞之前，在制定介质见第3.2步。

2。其他种类的培养

1. 为了适应协议其他细菌​​物种的种植和收获过程应根据该品种的要求改变。为了避免渗透休克处理细胞时，在收获和洗涤步骤（次），渗透压的解决方案需要相匹配的生长培养基中收获。

3。配方细胞

1. 准备制定解决方案权衡各自的基质成分，溶解在水中。为了达到等渗条件下，调整量的赋形剂，或者添加NaCl或其他一些细胞的相容性溶质，以达到所需的重量克分子渗透压浓度。二糖等低分子量物质收入的金额能够很容易地进行调整，以达到等渗条件。对于高分子量的聚合物的物质，如单元格兼容，因此必须进行调整，等渗琵琶， 如 NaCl或双糖。需要注意的是任何一种物质除了会影响制剂的物理性质，这反过来又可能影响冷冻干燥行为和细胞生存。
2. 倒出洗涤液（在这种情况下，氯化钠），并在各自的制剂媒体重新悬浮细胞。
3. 确保细胞均匀地分散。低粘度的制剂的涡旋，而粘度较高的制剂中添加， 例如 ，搅拌棒和摇动容器，直到达到均匀混合，混合使用。
4. 把配方转化为冻干机小瓶。小瓶应称量空的，用样品之前和之后冷冻干燥，冷冻干燥过程中除去的水的量计算。
5. 如果被密封小瓶冷冻机内添加橡胶塞的小瓶，请参见第4.3步。
6. 枚举冷冻干燥前的各配方中的单元格，请参阅步骤6。
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4。冷冻干燥

1. 的冷冻干燥条件下进行调整，以制剂的物理性质。最重要的参数是在这种情况下，玻璃化转变温度Tg，该制剂，记的Tg'为冷冻浓缩的样品表明，水是仍然存在。容易使用差示扫描量热法（DSC）测定的冻干浓缩制剂的Tg'，请参阅第7步。
2. 调整冷冻干燥过程的参数，以使样品的温度总是低于样品的Tg，腔室压力允许快速的冰升华，即初级干燥，在制剂中的残留水， 即二次干燥。如果样品温度Tg以上，在干燥过程中，有很大的样品结构崩溃的风险，这可能显着减少细胞存活。
3. F之后，保护干产品reeze干燥样品气氛已被控制。如果可能的话，密封样品在冷冻机的冷冻干燥周期结束之前，释放真空。或者可以填充小瓶，用一个优选的气氛。这是很重要的，以避免暴露的样品，因为任何湿气或存储的气氛中存在的氧的环境条件下会影响细胞的生存。
4. 称重的小瓶。

5。补液

1. 用无菌去离子水再水合样品。要添加的水的量应该是冷冻干燥过程中除去空的小瓶中，冷冻干燥之前和之后的相同的小瓶样品的重量计算出的量相同。涡样品，直到解决方案，然后再出现同质。

6。列举

1. 绘制从每个样品中加入100μl，并进行10倍系列稀释。从集成的稀释其余100微升镀在TSA板。将板温育所需的温度和时间。

7。制定冻结行为表征

1. 取少量5 - 10毫克的样品，并在DSC-铝盖锅附上。准备一个空锅作为参考。
2. 将DSC温度扫描程序。冷却的程序被设置为模仿的冷冻步骤中的冷冻干燥程序。这是通过作为冷却动力学影响的水合制剂的Tg'。加热前扫描开始打倒的温度远低于预期的Tg'被调查的配方，通常为-100°C。
3. 选择适当的加热速度，通常是升温速率为5 - 40℃/ min的使用。以瓦为单位的记录，可热流信号，并会受加热速率。较高的加热速率将给予较大的信号TG'。
4. 设定的温度范围，这样我吨涵盖TG的'的制定和熔化。

8。水合配方的表面张力测量

1. 本实验中使用的实验装置是根据杜诺氏方法测量表面。
2. 清洁铂金戒指和仔细测量容器。该船是用丙酮冲洗，擦拭无绒布组织，用无色的火焰，然后在里面燃烧。在无色火焰环呈红色。
3. 填写船只与解决方案，并让表面测量前定居。很长一段时间后，才可达到平衡状态的解决方案， 如聚合物，用在这里简单的设置将提供定性数据。
4. HEC或HPMC的配方具有高的粘度， 例如，解决方案中的2％（w / w的），表面张力，必须测量在较低的浓度的溶液，然后外推。这是可以做到的事实，通过利用的浓度低于0.5％（重量/重量）的表面张力水平的下降。

9。 X射线分析的干制剂

1. 取少量矩阵/细菌，并将其加载到样品架。
2. 安装到的X-射线衍射仪样品架。
3. 结晶相存在于样品中分析任何来自于Bruker EVA的程序包都可以使用。

10。电子显微镜

1. 取少量矩阵/细菌的小瓶，并修复它的SEM存根上。
2. 加载SEM持有人在溅射涂布机（Thermo VGScientific的极化子SC7640，在本工作中使用的）和涂布样品用几nm的Au / Pd或Pt。在这些实验中的溅射参数为：​​1,900 V，20毫安和20秒，约5 - 10 nm的金/钯涂层。涂层减少电动充电过程中的图像采集。建议开始薄的涂层，如果的充电仍然存在，并导致图像工件，样品应再次被涂覆。
3. 加载SEM持有人在SEM室。选择合适的成像参数。对于图2中所用的仪器（FEI地层DB235）中，使用5 kV的加速电压，spotsize 3，工作距离为5毫米，二次电子探测器。
4. 可选地，这是可能的，使用聚焦离子束切割嵌入聚合物中的细菌，进一步揭示了细节的横截面。

Representative Results

表1显示数据的制剂组合物，热事件记录，可通过DSC在加热过程中的冷冻制剂，干燥样品的结构和制剂溶液的表面张力。 的_Tg'的蔗糖已被确定为-40°C ^2，3，并可能难以检测蔗糖浓度低于20％w / w的。在-35°C的热事件可能与发病冰溶解^2。在HEC和HPMC的样品的晶体结构通过X射线检测，也可见于扫描电镜（ 见图2b和2c）与正常的NaCl晶体形式重叠。

图1A示出对革兰阴性P.生存数据恶臭和革兰氏阳性A. chlorophenolicus在不同的糖基配方配制。请注意，配方支持细胞生存的趋势是一样的BO个菌种。 图1B中所示的情节示出的冷冻干燥的生存和制剂的表面张力之间的相关性。

图2示出的干制剂的扫描电镜图像。此处所示的四种聚合物，形成了矩阵外观“清脆纸”：相互连接的表光滑嵌入其中的细菌，并显示为波纹。聚蔗糖和蔗糖，张约1微米厚，10 - 20μm宽，与聚蔗糖有一个平滑的表面。 HPMC和HEC形成更薄的片材，这可能是由于这样的事实，在这些纤维素为基础的配方，比其他人（ 表1）的聚合物的量是少的。此外，盐晶体HEC和HPMC的观察，后者示出了较大的析出物量的聚合物片材的表面上。细菌纤维素基配方中很容易看出，因为片材是第内。蔗糖和聚蔗糖，他们大多是观察否则光滑的表面的波纹。

配方成分	热事件检测冷冻配方	干配方结构	表面张力未干燥配方（MN米-1）
10％的蔗糖	-35°C的冰溶解，发病	非晶蔗糖	（72±0.1）
10％聚蔗糖，氯化钠150毫米	的Tg'，-22°C	无定形聚蔗糖	（68±0.3）
2％，港灯，150毫米氯化钠	共晶融化的冰和NaCl，-28°C	HEC，无定形结晶氯化钠	（64±0.6）
2％HPMC，氯化钠150毫米	共晶融化的冰和NaCl，-27°C	（52±0.8）

表1中。的组合物的水溶液或干制剂的不同配方和性能的影响。的HEC和HPMC的聚合物浓度最大化，以实现足够厚的基质覆盖物的细菌，但仍然有一个可行的方案是粘度。

图1：A）冷冻干燥存活率P.恶臭 （白色）和A. chlorophenolicus（灰色）当配制的解决方案的基础上的二糖蔗糖或聚合物可以使用Ficoll，HEC和HPMC，B）之间的相关性后，冷冻干燥和未干燥的配方中的表面张力的细胞的存活。

FIGURE 2。 P. SEM图像恶臭在四个不同的配方：1）蔗糖，B）聚蔗糖，C），D港灯）HPMC。细菌是很难看到的）和b），因为聚合物板材相当厚，可完全包围细菌， 在c）和d）的细菌显示表面上更加突出。在d）中，可以将它们区分开来的大量的盐沉淀物，因为它们的形状和对比度，因为它们显示为长椭圆形，暗小体。

Discussion

这项研究的动机是探讨一些配方的特性，可能是​​冷冻干燥过程中的细胞存活的重要性。虽然不同物种之间的内在干燥公差变化，如在图1A中所示，不同配方支持细胞的存活以及类似的趋势。它是信息开始，蔗糖和聚蔗糖的比较。据认为，制剂的关键因素，以支持细胞的存活能力的制剂成分（次）来代替水在脱水过程中，从而保持在干燥状态下的细胞的蛋白质和膜的结构。双糖（如蔗糖），但也海藻糖显示此属性，而淀粉多糖聚合物，如不^5,11。聚合物被认为是过大，与以同样的方式作为二糖的膜脂。另一个属性的重要一个成功的冻干微生物的能力，在支撑基体，玻璃化冷冻干燥过程中（ 即成为无定形固体）。无定形结构是利于屏蔽和保持细胞分离。有趣的是，双糖和聚合物都容易玻璃化，如果适当地进行冷冻干燥。我们的结果表明，无论是蔗糖和聚蔗糖为基础的配方中冷冻干燥后成为无定形的，请参阅表1中 ，支持细胞的存活同样出色。不过，也有显着差异，两者之间的糖类。相反蔗糖，聚蔗糖分子，其分子量为400 kDa，太大来代替水与脂膜的相互作用过程中冷冻干燥^4，5。此外，作为聚蔗糖分子被禁止从革兰阴性细菌的周质空间，又由于它们的大小^6，聚蔗糖的细胞摄取的可能性不大。在此基础上，我们建议条款的保护作用副执行干事蔗糖制剂主要不是由于细胞摄取的二糖，重要的细胞内结构^7，8的水置换能力。相反，聚蔗糖的能力，以支持细胞生存与聚蔗糖和蔗糖配方的共同属性， 例如无定形结构。

针对聚合物，它是从图1A中明显变化的能力的聚合物的配方，以支持细胞的存活。的X-射线分析结果表明，在冷冻干燥过程中结晶氯化钠的HEC和HPMC的配方与其它无定形结构共存。无结晶材料中检测到基于聚蔗糖的配方。氯化钠可以形成复合物与羟基部分的碳水化合物的^9，10。在聚蔗糖和基于HEC配方NaCl的羟基基团的摩尔比为1:11和1:1，分别解释为什么没有检测到结晶基于聚蔗糖配方。 NaCl和纤维素聚合物之间的相分离中也观察到的DSC-调查。共晶熔化被记录在加热过程中被冻结的HEC和HPMC配方表明相分离发生在冷冻状态。制剂的形态和微观结构揭示的SEM图像（ 图2），证实了DSC和X-射线数据。细菌细胞能够被看见从片材析出的氯化钠晶体的表面上清晰可见的HEC表突出。配制中的HEC溶液和Ficoll解决方案相比，HPMC，我们得出这样的结论：该盐的状态，无论是作为晶体分散或溶解在聚合物中，不与细胞存活相关的细菌的存活率之间的相似性的基础上。细胞的存活，而不是示出了与配方中的表面张力的关系，参见图1B。对于较低的表面张力，L奥尔生存率记录的细菌。但是请注意，所测得的表面张力显示溶质， 即蔗糖，聚合物和溶剂分子之间的相互作用。但仍然是允许的间接猜测，表面活性的聚合物可以与他们的倾向，也与细胞表面的一个不稳定的方式交互。在冷冻过程中的溶质的浓度增加时，解释为什么的表面活性的聚合物的负面影响，均未见到的负面影响可能会增强时，仅存储完全水合的配方中的细菌。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.