Препараты для Лиофилизацию бактерий и их влияние на выживаемость клеток

Summary

Лиофилизацию часто простой и удобный способ получения сухих продуктов жизнеспособных бактериальных клеток. Вопрос о процессе выживания клеток. Мы подробно процедуру исследовать, как выживаемость клеток в процессе лиофилизации зависит от свойств композиции использованы.

Abstract

Сотовая вода может быть удалена обратимо инактивации микроорганизмов для облегчения хранения. Один такой метод удаления сублимационной сушки, которая считается щадящий метод обезвоживания. Чтобы способствовать выживанию клеток в процессе сушки, клетки часто изготавливают заранее. Композиция образует матрицу, которая внедряется в клетки и защищает их от различных вредных напряжений, введенных в клетки при замораживании и сушку. Здесь приводится общий метод для оценки выживаемости клеток после сублимационной сушки, и мы проиллюстрировать путем сравнения результатов, полученных с четырех различных составов: дисахарид сахароза, сахароза полученный полимер Ficoll PM400, а соответствующие полисахариды гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ ) и гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), на двух штаммов бактерий, П. putida KT2440 и А. chlorophenolicus A6. В данной работе показано, как подготовить составы для сублимационной сушки и как исследовать механикемов выживаемости клеток после регидратации путем характеризации препаративной формы с применением дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), измерение поверхностного натяжения, рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии и относительно этих данных в выживаемости. Полимеры были выбраны, чтобы получить мономерный состав соответствующего полисахарида напоминающие сахарозы в различной степени. С помощью этого метода установки мы показали, что полимеры могут поддерживать выживание клеток так же эффективно, как дисахариды, если определенные физические свойства композиции находятся под контролем ^1.

Protocol

1. Выращивание и сбор П. putida

1. Подготовить стартер культуры Pseudomonas putida путем инокуляции 100 мл триптическому соевого бульона (БСЭ) с колонией P. putida клетки культивировали на агаре с триптического соевого бульона (TSA). Сохранить свою культуру при 30 ° C на дрожащую платы установлен на уровне 130 оборотов в минуту.
2. После 7 ч передавать аликвоты от стартера эквивалент культуры до 1/10 от конечного объема основной культуры в свежую TSB-среды. Сохранить клетки при 30 ° C на дрожащую совета на 130 оборотов в минуту в течение 16 часов.
3. После 16 часов роста клетки собирают посредством вращения культуры клеток при 1500 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. Декантируют супернатант и промыть клетки путем повторного суспендирования осадка клеток в растворе NaCl, что является изотоническим с ростовой среды. В этом случае 150 мМ NaCl раствор. Затем клетки центрифугируют еще раз и супернатант декантируют до ресуспендирования клеток в составе средысм. шаг 3.2.

2. Разведение других видов

1. Для адаптации протокола с другими видами бактерий выращивания и сбора урожая процедуры должны быть изменены в соответствии с требованиями данного вида. Чтобы избежать осмотического шока при работе с клетками во время сбора урожая и стадии промывки (ы), осмотическое давление решений должно совпадать с ростовой среде в период сбора урожая.

3. Формулировка клетки

1. Подготовьте формулировку решения путем взвешивания соответствующих компонентов матрицы и растворить их в воде. Для достижения изотонических условий, либо регулировать количество наполнителя или добавление NaCl или некоторый другой элемент совместимые растворимые для достижения желаемой осмолярности. Для веществ с низким молекулярным весом, таких как дисахариды суммы можно легко отрегулировать для достижения изотонический условиях. Для веществ, таких как полимеры, которые с высокой молекулярной массой, тонус должен быть отрегулирован совместимы с сотовыми таклютни, например, NaCl или дисахариды. Следует отметить, что любое добавление вещества будут влиять на физические свойства композиции, что в свою очередь может влиять сублимационной сушке поведение и выживание клеток.
2. Декантировать моющего раствора (в данном случае NaCl) и повторно приостанавливать клетки в соответствующих сред препарата.
3. Убедитесь в том, что клетки равномерно диспергированные. Композиции низкой вязкостью встряхивали в то время как формулировки более высокие вязкости смешиваются использованием путем добавления, например., Мешалкой и встряхивания контейнера до гомогенного смешивания не будет достигнута.
4. Разделите составов в сублимационной сушилки флаконов. Флаконы должны быть взвешены пустым, с образца до и после лиофилизации, чтобы вычислить количество воды, удаленной в процессе лиофилизации.
5. Добавить резиновые пробки для флаконов, если флаконы должны быть запечатан внутри сублимационной сушилки, см. шаг 4.3.
6. Перечисление клеток в каждой композиции до лиофилизации см. шаг 6.
</ OL>

4. Сушка вымораживанием

1. Сублимационной сушки условия должны быть приспособлены к физическим свойствам композиции. Наиболее важным параметром в данном случае температура стеклования, Tg, композиции, обозначенный Tg »для замораживания концентрированный образец, чтобы указать, что вода все еще присутствует. Tg 'процесса лиофильной концентрированного препарата легко измерить с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), см. шаг 7.
2. Настройка параметров процесса сушки вымораживанием так, чтобы температура образца всегда ниже Tg образца, и что давление в камере позволяет быстро сублимации льда, т.е. первичной сушки, и остаточной воды в композиции, т.е. вторичный сушку. Если образец температура выше TG », в процессе сушки существует большой риск обрушения конструкций образца, который может значительно уменьшить выживания клеток.
3. Для защиты сухих продуктов после Freeze сушки образца атмосферу должен контролироваться. Если это возможно, уплотнение образцов в сублимационной сушилки до вакуум снимают в конце сушки вымораживанием цикла. Альтернативно флаконы могут быть заполнены с предпочтительным атмосферу. Важно, чтобы не подвергать образцы в условиях окружающей среды и влаги или кислорода, присутствующего в атмосфере хранение будет влиять на выживание клеток.
4. Взвесьте флаконов.

5. Регидратации

1. Увлажняет образцов с деионизированной и очищенной стерильной воды. Количество добавляемой воды должно быть таким же, как количество удалены в процессе лиофилизации и рассчитывают из вес пустого флакона, тот же флакон с образцом до и после лиофилизации. Vortex образцы снова и снова то, пока не появятся решения однородной.

6. Перечисление

1. Ничья 100 мкл из каждого образца и сделать 10-кратные серийные разведения. Из разведения инОстальные 100 мкл высевают в TSA-пластин. Планшеты инкубировали при температуре и времени, необходимого.

7. Характеристика Формулировка Замирание

1. Возьмите небольшое количество, 5 - 10 мг, образца и заключить его в DSC-алюминиевые кастрюли с крышкой. Подготовьте пустой поддон в качестве ссылки.
2. Задайте настройки сканирования DSC температурной программы. Программы охлаждения установлен, чтобы имитировать стадии замораживания в сублимационной сушки программы. Это делается в качестве охлаждающей кинетика может влиять на Tg 'гидратированного составов. Перед началом отопительного сканирование начинается сбить температуру значительно ниже ожидаемого TG »исследуемых составов, обычно -100 ° С
3. Выберите соответствующую скорость нагрева, обычно со скоростью нагрева 5 - 40 ° C / мин используется. Записанный сигнал теплового потока выражается в ваттах и ​​будет зависеть от скорости нагрева. Более высокая скорость нагрева даст больший сигнал TG ».
4. Установить диапазон температур, так что яT охватывает как TG », и таяние композиции.

8. Поверхностное натяжение Измерения гидратированных композиции

1. Экспериментальная установка в этом эксперименте по методу дю Noüy измерить поверхность.
2. Очистите кольца платина и мерный сосуд тщательно. Судно промывают ацетоном, протереть безворсовой тканью, а затем сожгли на внутренней части с бесцветным пламенем. Кольцо светится красным в бесцветным пламенем.
3. Заполнить емкость с раствором и дать поверхности урегулировать перед измерением. Для решений, где равновесное состояние достигается только после длительного времени, например, полимеры, простой установки, использованной здесь предоставят качественные данные.
4. Для составов с высокой вязкостью, например, растворами 2% (вес / вес) HEC или НРМС, поверхностное натяжение должно быть измерено на растворах низкой концентрации, а затем экстраполированы. Это можно сделать, воспользовавшись тем, чтоснижение поверхностного натяжения выравнивается при концентрациях ниже 0,5% (вес / вес).

9. Рентгеновского анализа Сухие композиции

1. Возьмем небольшое количество матрица / бактерии и загрузить его на держатель образца.
2. Установите держатель образца в рентгеновском дифрактометре.
3. Для анализа любого кристаллического настоящее фазы в образце EVA пакет программ от Bruker могут быть использованы.

10. Электронная микроскопия

1. Возьмем небольшое количество матрица / бактерии из флаконов и закрепить его на заглушку SEM.
2. Загрузите держатель SEM в распыления для нанесения покрытий (Thermo VGScientific Поляронный SC7640 использованы в настоящей работе) и пальто образца с несколькими нм Au / Pd или Pt. В этих экспериментах распыления параметры были: 1900 В, 20 мА и 20 сек, в течение ~ 5 - 10 нм Au / Pd покрытия. Покрытие снижает электрическую зарядку во время получения изображения. Рекомендуется начать с тонким слоем и, если оплата сохраняется и вызывает изображениеартефактов, выборка должна быть покрыта снова.
3. Загрузите держатель SEM в камере SEM. Выберите соответствующие параметры визуализации. Для инструмента, используемого на рисунке 2 (FEI Strata DB235) мы использовали 5 кВ ускоряющего напряжения, spotsize 3, рабочее расстояние 5 мм и детектор вторичных электронов.
4. При необходимости, можно использовать сфокусированным ионным пучком, чтобы сократить сечений бактерии встроенный в полимере, чтобы показать более подробно.

Representative Results

Таблица 1 показывает данные по разработке состава, тепловой события, записанные с помощью ДСК при нагревании замороженной композиции, состав сухих образцов и поверхностное натяжение формулировки решений. Т _г 'сахарозы была определена до -40 ° С ^{2, 3} и может быть трудно обнаружить на сахарозу концентрации ниже 20% вес / вес. Термального события при -35 ° C, вероятно, связано с началом растворения льда ^2. Кристаллическая структура обнаружен рентгеновским в HEC и НРМС образцов, а также видно на SEM (см. рис 2b и 2c) перекрываются с нормальной формы кристалла NaCl.

Фиг.1А показывает выживание данных для грамотрицательных P. putida и грамположительных А. chlorophenolicus сформулированы в различных составах на основе сахаридов. Следует отметить, что тенденция в том, как хорошо составы поддерживать выживание клеток является одинаковым для бого вида бактерий. Сюжет показано на рисунке 1b иллюстрирует корреляцию между сублимационной сушки выживания и поверхностном натяжении составах.

2 показана СЭМ-изображение сухих композиций. Для четырех полимеров показано здесь, матрицу, составленную имеет вид "четкие": бумага взаимосвязанных гладкие листы, в которых бактерии внедряются, выводя при этом гофры. Для Фиколл и сахароза, листы толщиной около 1 мкм и 10 - 20 мкм в ширину, с Фиколл имеющие гладкую поверхность. НРМС и НЕС образуют очень тонкие листы, возможно, из-за того, что количество полимера меньше в этих на основе целлюлозы составов, чем в других (табл. 1). Кроме того, кристаллы соли наблюдались HEC и ГПМЦ, причем последний показывает большее количество осадка на поверхности листа полимера. Бактерии более легко увидеть на основе целлюлозы составов, поскольку листы йвнутренняя. В сахарозы и Ficoll, они в основном наблюдалось гофрировки в противном случае гладкой поверхности.

Композиция Композиция	Тепловые событий, обнаруженных в замороженных составы	Структура сухого состава	Поверхностное натяжение составов невысушенный (MN м -1)
10% сахарозы	начало растворения льда, -35 ° C	аморфной сахарозы	72 ± 0,1
10% Ficoll, 150 мМ NaCl	T G ', -22 ° C	аморфного Фиколл	68 ± 0,3
2% HEC, 150 мМ NaCl	эвтектического плавления льда и NaCl, -28 ° C	аморфного HEC, кристаллические NaCl	64 ± 0,6
2% НРМС, 150 мМ NaCl	эвтектического плавления льда и NaCl, -27 ° C	52 ± 0,8

Таблица 1. Состав различных составов и свойств водных или сухие композиции. Концентрации полимера КОК и НРМС было максимальным для достижения достаточно толстым крышка матрицы бактерий, но все еще ​​приемлемое решение в отношении к вязкости.

Рисунок 1.) Выживаемость сублимированного P. putida (белый) и А. chlorophenolicus (серые), когда сформулированы в решения, основанные на дисахарид сахароза или полимеров Ficoll, HEC и НРМС, B) Соотношение выживаемости клеток после сублимационной сушки и поверхностное натяжение не-высушенных композиций.

Фаigure 2. СЭМ изображения P. putida в четырех различных составов: а) сахароза, б) Фиколл, С) HEC, D) НРМС. Бактерии трудно увидеть в а) и б), так как полимерный лист довольно толстая и может окутать бактерии полностью, в) и г) бактерии появляются более заметно на поверхности. В г), они могут быть отделены от большого количества соль выпадает в осадок из-за их формы и наоборот, как они представлены как продолговатые, темно телец.

Discussion

Мотивом для этого исследования было изучить некоторые свойства состава, что может иметь важное значение для выживания клеток в процессе лиофилизации. Хотя внутренняя толерантность сушки варьируется между различными видами, как показано на фиг.1А, тенденция того, насколько хорошо различные составы поддержки выживания клеток аналогична. Это информативная, чтобы начать со сравнения сахарозы и Фиколл. Считается, что ключевым фактором для состава для поддержки выживания клеток является возможность разработки ингредиент (ы) для замены воды в процессе сушки, таким образом сохраняя структуру белков и мембран клетки и в сухом состоянии. Дисахариды, такие как сахароза, но и показать это трегалозой собственности, в то время как полимеры, такие как полисахарид крахмал не ^5,11. Полимеры считается слишком большой, чтобы взаимодействовать с мембранных липидов таким же образом, как дисахариды. Другим свойством важным для успешного сублимационной сушкиния микроорганизмов является способность опорной матрицы витрификации (т.е.. стали аморфного твердого вещества) в процессе лиофилизации. Аморфная структура выгодна для экранирования и хранение клетки отделяли. Интересно, что и дисахариды и полимеры легко витрифицироваться при сублимационной сушки правильно выполнена. Наши результаты показывают, что как сахароза и Ficoll составов на основе стать аморфным после сублимационной сушки, см. Таблицу 1, и выживание поддержки клетки одинаково хорошо. Тем не менее, существуют значительные различия между двумя сахаридов. В отличие от сахарозы, молекула Ficoll есть с молекулярной массой 400 кДа, слишком велик, чтобы заменить воду во взаимодействии с липидной мембраны в процессе сушки вымораживанием, ^{4, 5.} Кроме того, как молекулы Ficoll запрещено периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий, снова вследствие их размеров ^6, клеточное поглощение Ficoll маловероятно. Исходя из этого, мы полагаем, что защитный эффект полоДед по сахароза состав не в первую очередь из-за клеточное поглощение дисахарид, важных для воды замещающей мощности внутриклеточных структур ^{7, 8.} Скорее всего, возможности для поддержки Фиколл выживаемость клеток связано с свойства, общие для обоих Фиколл и сахароза формулировки, например, аморфной структурой.

Говоря о полимерах, как видно из фиг.1А, что способность полимерных композиций для поддержки выживания клеток меняется. Рентгеноструктурный анализ показал, что NaCl кристаллизуется при лиофилизации и сосуществовали с иным аморфной структурой HEC и НРМС составов. Нет кристаллический материал не был обнаружен в Ficoll композиции на основе. NaCl могут образовывать комплексы с гидроксильных остатков в углеводы ^{9, 10.} В Фиколл и HEC-препараты на основе NaCl, чтобы гидроксильная группа молярное соотношение было 1:11 и 1:01, соответственно, объясняя, почему кристаллизация не было обнаруженоВ Ficoll основе композиции. Разделение фаз между NaCl и полимеры целлюлозы наблюдалась также в DSC-исследований. Эвтектического плавления была записана во время нагревания замороженных HEC и ГПМЦ составы, указывающий, что разделение фаз происходит в замороженном состоянии. Морфологией и микроструктурой разработке раскрывается с помощью СЭМ изображение (рис. 2) и подтверждает DSC и рентгеновских данных. Бактериальные клетки видны выступающие из листов с нанесенными NaCl кристаллы хорошо видны на поверхности HEC-листов. На основании сходства выживаемости бактерий сформулированы в HEC-решения и решения Фиколл по сравнению с ГПМЦ мы заключаем, что состояние соли, которые могут быть дисперсными в виде кристаллов или растворенный в полимере, не коррелирует с выживаемости клеток. Вместо того, выживаемость клеток показана зависимость с поверхностным натяжением из составов, см. фиг.1В. Для снижения напряженности поверхности, LАуэр выживаемость записываются для бактерий. Заметим, однако, что измеренное поверхностное натяжение показывает взаимодействие между растворенными веществами, т.е. сахарозы и полимеры и молекулы растворителя. Тем не менее это позволяет косвенным предположение, что поверхностная активность полимеры могут быть связаны с их склонность взаимодействовать также с поверхности клеток в дестабилизирующим образом. Поскольку концентрация растворенных веществ увеличивается во время замораживания, негативные последствия могут быть усилена объясняя, почему негативное влияние поверхностно-активных полимеров не были замечены, когда только хранения бактерий в полностью увлажняющие составы.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.