Summary
Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série subseqüente
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) é um alto grau de cancro cerebral primário com uma sobrevida média de apenas 14,6 meses em humanos, apesar do tratamento modalidade tri-padrão consiste na ressecção cirúrgica, pós-operatório de radioterapia e quimioterapia temozolomida 1. Novas abordagens terapêuticas são claramente necessárias para melhorar a sobrevida do paciente e qualidade de vida. O desenvolvimento de estratégias mais eficazes de tratamento seria auxiliada por modelos animais de GBM que recapitular doença humana ainda permitir imagens em série para acompanhar o crescimento do tumor e resposta ao tratamento. Neste artigo, descrevemos a nossa técnica para a implantação estereotáxica precisa de bio-representável células cancerosas GBM no cérebro de camundongos nude, resultando em xenotransplantes tumorais que recapitulam principais características clínicas da GBM 2. Este método produz tumores que são reprodutíveis e estão localizados em locais anatómicos precisos, permitindo simultaneamente in vivo imaging bioluminescente para monitorar intra serialmentecrescimento de xenoenxertos de crânio e resposta a tratamentos 3-5. Este método também é bem tolerado pelos animais com morbilidade e mortalidade perioperatória baixo.
Protocol
A. Preparação pré-operatória de células tumorais
- Transduzir células U251 de glioblastoma multiforme, com um vector de expressão lentiviral (pGreenFire, Sistema Biosciences) para estavelmente expressam o gene da luciferase do pirilampo.
- Estas células foram cultivadas em 10 ml de Modificação de Dulbecco completa de meio de Eagle (DMEM), que consiste de meio DMEM suplementado com soro de vitela fetal a 10%, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de aminoácidos não essenciais em um frasco de cultura T75 tecido incubação a 5% de C0 2 e 37 ° C.
- Realizar a cultura de células padrão, começando com a lavagem das células com tampão fosfato salino (PBS), seguido por trypsinizing.
- Extingue-se a tripsina com DMEM completo, transferir a solução para um balão cónico de 50 ml, e determinar a concentração celular utilizando o Contador Coulter.
- Centrifugar as células recolhidas em DMEM completo durante 3 minutos a aproximadamente 3000 revoluções por minuto.
- Após a centrifugação, aspirar def os meios de comunicação, deixando apenas um pellet de células no fundo do frasco cónico de 50 ml.
- Trabalhando rapidamente para evitar que as células de secar, voltar a suspender as células num volume de fresco de DMEM completo para obter a concentração pretendida de 50.000 células / uL e transferir para um frasco de 2 ml estéreis colocados em gelo.
- Células no gelo deve ser brevemente agitadas em um nível baixo a cada ~ 20 min para impedir a adesão celular. As células podem ser utilizadas com segurança para implantes intracranianos de até duas horas após a colocação em gelo.
B. Implantação heteróloga ortotópico
- Pesar nu atímicos NCr mouse (nu / nu) para estabelecer uma linha de base, peso pré-implantação. Nós geralmente selecionar ratos 6-10 semanas de idade com peso entre 17 e 24 gramas.
- 1 h antes da implantação, pré-medicar o rato com 5 mg / kg de não-esteróides anti-inflamatórios de meloxicam por meio de injecção subcutânea para o tratamento de dor pós-operatória e inflamação.
- Anesthetize o animal com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina / xilazina na dose de 140 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente.
- Confirmar que o mouse é suficientemente anestesiado por avaliação da resposta espontânea do animal a uma pitada do dedo do pé. Se o animal responde a pitada do dedo do pé, atrasar o procedimento até que a anestesia pode ter efeito ou considerar injeção de anestesia adicional (<25% do valor original).
- Prepare o rato anestesiado para posicionamento no Digital Stoelting Apenas para plataforma Rato estereotáxica (Stoelting Inc.) ligando os dentes do rato incisivos na barra de mordida do limitador focinho e apertar a braçadeira de nariz sobre o focinho, assegurando que a cabeça do rato está em um plano de nível.
- Transferir o rato contido na plataforma estereotáxica Stoelting, ajustando a posição do animal, de modo que as pontas das orelhas são barras na extremidade caudal do canal auditivo. Após o posicionamento do animal crânio-a-caudal foi adjusTed, garantir a barra de mordida para o quadro estereotáxico. O rato deve ser assente numa placa de aquecimento firme plástico (Harvard Apparatus) fixado com fita para a plataforma Stoelting para fornecer feedback controlado regulação da temperatura durante a cirurgia.
- Ajuste a altura das barras de ouvido, se necessário e, em seguida, avançar as barras de ouvido na parte caudal do canal do ouvido, prendendo-os de tal forma que a cabeça do rato está em um nível plano e imobilizado no toque de dedo. Monitorar cuidadosamente para sinais de desconforto respiratório após a colocação das barras de ouvido. Solte e re-posição se o animal está em perigo.
- Introduzir a ponta lubrificada de uma sonda de temperatura rectal ligado ao controlador de temperatura TCAT-2DF (Harvard Apparatus) para monitorar a temperatura do animal e para proporcionar controlo de realimentação para a placa de aquecimento posicionado por baixo do rato para manter a temperatura do corpo do animal a 36 ° C durante o procedimento.
- Aplicar pomada oftálmica para os olhos para Prevent secagem.
- Aplicar a solução de betadine para o topo da cabeça do rato para desinfectar o local de incisão, tendo o cuidado de evitar os olhos.
- Realizar uma pitada de igual para confirmar o rato está inconsciente, proporcionando uma pequena quantidade adicional de cetamina / xilazina (<25% da dose inicial) quando necessário.
- Limpar a 0,45 milímetros broca rebarba (Stoelting) ligado à broca (Foredom Microdrill), utilizando uma compressa de álcool e, em seguida esterilizar a broca numa esfera de vidro esterilizador (Germinator 500, CellPoint Scientific) durante 15 seg, imergindo apenas o bit de perfuração em os grânulos de esterilizador.
- Utilizando um bisturi esterilizado, fazer uma incisão 0,75 centímetros longitudinalmente na metade do couro cabeludo, que se estende desde o nível dos olhos cauda. Confirmar a visualização do bregma.
- Fixar o suporte à plataforma de perfuração Stoelting e coloque uma broca (Foredom Microdrill) com uma broca 0,45 milímetros rebarba (Stoelting) no suporte da broca, prendendo-o na posição correcta.
- Coloque a broca exatamente sobre tele bregma e zero-a x, y, z coordenadas do visor estereotaxia digital. Move a ponta da broca para a posição 2 milímetros posterior e 1,5 mm lateral à bregma no hemisfério cerebral direito e broca no crânio do animal com a broca Foredom, perfurando apenas o osso. Uma mecha de algodão estéril, pode ser usado para suavemente retrair as bordas da incisão para facilitar a visualização do crânio.
- Remover a broca de perfuração e o suporte da plataforma estereotáxica.
- Anexar o Nanomite injector da bomba de seringa (Harvard Apparatus) para a plataforma estereotáxica.
- Remover as células de gelo e, ou vórtice suavemente o frasco contendo as células tumorais com pulsos breves ou suavemente apertar o frasco para re-suspender as células. Desenha-se 7 uL da suspensão de células através de uma agulha de calibre 30 um chanfro "longa e plana ligada a uma seringa de 10 ul (Hamilton seringa). Evite grandes bolhas de ar na seringa. Assegurar que não existem bolhas de ar na pi 6 inicial de fluido which será o volume total injectado no rato. Pequenas bolhas de ar no ul uma restantes são de nenhum interesse. Evite a repetição de draw-ups da suspensão de células, se possível para minimizar os danos às células.
- Posicionar a seringa carregada no injector de seringa. Usando uma compressa de álcool, remover todo o líquido de suspensão de células que aparecem na ponta da agulha, para evitar a contaminação do local da incisão com as células cancerosas que podem resultar em crescimento do tumor, no espaço extracranianas.
- Definir a bomba do injector para proporcionar 6,0 uL, a uma taxa de 0,5 uL / min. O pi 1 de suspensão de células remanescente na seringa após a implantação garante que as bolhas de ar que frequentemente recolhem na seringa não são injectados no animal. Injecção de bolhas de ar pode resultar em uma embolia de ar fatal.
- Avançar a agulha da seringa no orifício de trepanação manter a agulha perpendicular (90 graus) com o crânio. Uma vez que a agulha atravessou o crânio, zero a coordinates no visor estereotaxia digital e depois lentamente avançar a ponta da agulha ao longo de um período de 4 minutos até atingir uma profundidade de 2,5 mm. A agulha passa através do córtex e do hipocampo porções posterior. O x, y, z coordenadas estereotáxicas para implantação foram escolhidos para gerar um tumor lateralmente posicionado dentro do hemisfério cerebral, evitando danos às estruturas cerebrais críticas, tais como a proximidade do tálamo e para os ventrículos, reduzindo assim a probabilidade de sementeira do líquido cefalorraquidiano com células tumorais que pode dar origem a indesejáveis tumores medulares. A localização posterior em relação ao bregma foi seleccionada para reduzir a probabilidade de um tumor grande, localmente avançado ulcerativa na órbita. Pausa com a agulha a uma profundidade de 2 min e, em seguida, iniciar a implantação de células.
- Durante a implantação, secar o crânio repetidamente com uma lança de esponja de microcirurgia para remover qualquer líquido contendo tumor que pode ter refluxo para fora do orifício de trepanação duranteimplantação. Evite interromper a agulha com a esponja de microcirurgia. A remoção deste líquido deve reduzir a probabilidade de crescimento do tumor, no espaço extracranianas.
- Após a injecção está completa, deixar a agulha no cérebro durante 2 min e, em seguida, lentamente, retirar a agulha ao longo de um período de 3-4 min.
- Solte os bares de ouvido e retentoras focinho e remover o mouse do aparelho estereotáxica.
- Fechar o orifício de trepanação no crânio com cera de osso estéril depositado por esfregando cera e para trás através do orifício de trepanação do fim de madeira de um aplicador com ponta de algodão estéril. Continuar a aplicar a cera de osso até que o furo é completamente selado e a cera de osso vedar o orifício de trépano é nivelada com o crânio adjacente.
- Re-aproximar as bordas da incisão com cotonetes de algodão estéril e aplicar cola de tecido para selar veterinária a ferida, tendo o cuidado para evitar a exposição de cola para os olhos do animal.
- Por último, coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento definida para 37 °C até que o animal recupera a consciência. Transferir o animal de volta para sua gaiola original, uma vez que o mouse está alerta e receptivo.
C. Bioluminescent Imaging (BLI) para acompanhar o crescimento do tumor e resposta à terapia
Breves instruções seguem para a imagem de bioluminescência.
- Anestesiar ratos previamente implantados com tumor em uma câmara com 2% de isoflurano e oxigênio.
- Quando os ratos são anestesiados, injecta-los por via subcutânea ou por via intraperitoneal com 60 ul de D-luciferina sal de potássio diluído em PBS para uma concentração de 50 mg / ml.
- Ligue o fluxo de anestesia para os cones de nariz do digitalizador de imagem de bioluminescência e rapidamente transferir os ratos para o scanner colocando os focinhos dos cones de ogiva.
- Posicionar divisórias pretas entre os ratos para limitar a hemorragia de sinal a partir de um tumor bioluminescente com alta intensidade de sinal para um sinal de tumor adjacente com muito menor.
- Usoo software Image estar, tomar frequentes exposições em série por um período total de até 30 min após o momento da injecção de D-luciferina. Somos a favor de definir o tempo de exposição para "Auto" para limitar a probabilidade de uma imagem sob ou sobre-exposto. Nenhuma exposição única deve ser> 5 min.
- Realize repetir imagem de bioluminescência em intervalos apropriados. Imagem semanal de série é uma opção razoável para muitos experimentos longitudinais teste de resposta ao tratamento.
- Após a aquisição das imagens, utilizar o programa de software para analisar Imagem vivo de tumores através da elaboração de uma região de interesse (ROI) em torno de cada tumor em cada imagem adquirida durante a sessão de imagiologia bioluminescente. Aplicar uma região, segundo e menor de interesse para o flanco inferior de cada rato em cada imagem como uma região de fundo de interesse para corrigir o sinal bioluminescente do tumor em função do grau de intensidade do sinal de fundo bioluminescente. Nós preferimos usar o "Radiance" configuração em vez de "conta" como a saídavalores de sinal bioluminescente.
- Exportar os resultados de ROI em Excel e determinar o sinal de fundo ajustado máximo bioluminescente para cada rato.
- Repita imagiologia bioluminescente, tal como indicado para a monitorização do crescimento do tumor em série. Em nossos experimentos, executamos BLI semanal. Nós preferimos que determina o sinal de BLI máxima para uma sessão de imagem tomado como exposições constantes ao longo de 5 - 30 min após a injecção de D-luciferina.
D. Representante Resultados
Esta técnica de implante estereotáxica está associada com uma taxa de sucesso de tumor ter de 90-100% e com baixa mortalidade perioperatória, geralmente menos do que 5%. O risco de efeitos secundários indesejáveis é baixa, com esta técnica, incluindo complicações como a semeadura da medula espinal a partir de células de tumor implantadas nos ventrículos, ou o crescimento do tumor a partir de qualquer extracraniana semeadura da incisão com células tumorais ou de encerramento inadequado do orifício de trépano umllowing tumor intracraniano de expansão, através da abertura no crânio.
Análise ex vivo de xenoenxertos de tumores demonstraram zonas previstas de hipóxia, o aumento da expressão de VEGF e necrose. Microscopia de fluorescência para a proteína fluorescente verde (GFP), expressos de forma estável por nossa linha celular GBM revelou a natureza infiltrativa destes xenoenxertos.
A Figura 1 mostra os resultados de uma implantação estereotáctica típica bem sucedida de células de GBM para o cérebro de um rato. Esta é uma varredura do cérebro T2 ressonância magnética de um cérebro de camundongo realizada com um ímã Tesla 9,4 21 dias após a implantação com a técnica descrita aqui. Figura 1 revela um único foco de tumor no hemisfério direito (contorno na cor rosa), medindo 19 milímetros 3 que se localiza as coordenadas precisas do local de implantação.
A Figura 2 mostra os resultados de imagiologia bioluminescente usando o techn iques aqui descrito para um grupo de 10 ratinhos com tumores implantados estereotaxicamente que estavam uniformemente estratificada com base na intensidade de sinal máxima bioluminescente para receber ou irradiação craniana (4 x 4 Gy fracções diárias) ou nenhum tratamento. Nesta experiência, imagiologia bioluminescente mostra que a terapia de radiação inibe a proliferação dos tumores implantados, resultando em nenhum aumento no sinal detectado bioluminescente, enquanto que o sinal aumenta substancialmente em tumores mock-irradiados de controlo, devido a proliferação incontrolada de células cancerosas.
Figura 1 (Vídeo). Coronal seções de ressonância magnética de um cérebro de camundongo contendo um U251 tumor glioblastoma multiforme com contorno do volume do tumor (em rosa). A varredura foi realizada em um spin-eco protocolo T2 ponderado em um scanner Tesla 9.4. Clique aqui para ver filme .
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Figura 2. 10 ratinhos com tumores implantados estereotaxicamente glioblastoma multiforme foram tratados com terapia de feixe externo de radiação a 16 Gy em fracções de 4 ou nenhum tratamento. Ratos foram fotografadas com imagiologia bioluminescente, antes do tratamento e semanalmente após o início do tratamento. O gráfico apresenta a bioluminescência relativo calculado como a mudança de dobragem mediana onde a mudança de dobragem é definida como a razão entre o valor de corrente máxima para BLI pré-tratamento BLI valor máximo.
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Discussion
O método de implantação estereotáxica de células de cancro em ratinhos descritos neste documento de forma reprodutível gera tumores que razoavelmente recapitulam o padrão de infiltração e rápida de crescimento do glioblastoma multiforme clínico 2, 6-8. Esta técnica é especialmente bem adequado para as experiências ratinhos estratificando uniformemente para diferentes grupos de tratamento em que os tumores de tamanho comparável reprodutíveis e propriedades biológicas e em localizações anatómicas específicas são desejáveis. Implantação estereotáxica de células tumorais usando as técnicas que descrevemos devem ser facilmente alcançável por laboratórios de pesquisa mais translacionais 7,9-11.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Somos gratos ao Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Shuman Lee, Tim Jenkins, e Xiangsheng Dr. Xu por sua assistência especializada. Agradecemos o apoio do Dr. Ann Kennedy. BCB foi apoiado para a formação Biologia Radiação Grant C5T32CA009677. JFD foi apoiado sobre o Prémio Carreira Burroughs Wellcome para cientistas médicos (1.006.792). JLB foi apoiada sobre a concessão Supers (5 R25 CA140116-03). Nós gostaríamos de agradecer o Dr. Steve Hahn cujo incentivo e apoio ajudou a tornar possível a nossa pesquisa. Gostaríamos também de agradecer à Universidade da Pensilvânia Nano-Bio interface Center (NBIC) e Dennis Dr. Discher para o incentivo e comentários úteis. Nós reconhecemos a Facilidade de Imagem de Pequenos Animais (SAIF) da Universidade da Pensilvânia, pelo uso de suas instalações fundamentais de ressonância magnética e óptica / bioluminescência. Estas técnicas foram desenvolvidas como parte de projetos que foram apoiados pelos Institutos Nacionais de Saúde (RC1 CA145075 e K08-NS07654801).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
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