Summary
אנו מתארים שיטה משולבת להשתלה המדויקת, stereotactic של תאי multiforme glioblastoma אדם לתוך המוח של עכברים בעירום וסידורי עוקבים
Abstract
multiforme glioblastoma (GBM) הוא סרטן מוח ראשוני בדרגה גבוהה עם הישרדות חציונית של 14.6 חודשים בלבד בבני אדם, למרות טיפול, שיטה תלת סטנדרטי המורכב של כריתה כירורגית, הקרנות לאחר הניתוח וכימותרפיה temozolomide 1. גישות טיפוליות חדשות באופן ברור יש צורך לשפר את ההישרדות ואת איכות חיי מטופל. הפיתוח של אסטרטגיות טיפול יעילות יותר יהיה בעזרת מודלים של בעלי חי GBM כי לסכם מחלה אנושית עדיין לאפשר הדמיה סידורית כדי לפקח על גדילת גידול ותגובה לטיפול. במאמר זה, אנו מתארים הטכניקה שלנו להשתלת stereotactic המדויקת של תאי סרטן GBM יו imageable לתוך מוחם של עכברים בעירום וכתוצאה מxenografts גידול שלסכם מאפיינים קליניים עיקריים של GBM 2. שיטה זו מניבה גידולים לשעתק וממוקמות במקומות אנטומיים מדויקים תוך מתן בתחום הדמית vivo bioluminescent סדרתי כדי לפקח על תוךצמיחת גולגולת xenograft ותגובה לטיפולים 3-5. שיטה זו גם נסבלת היטב על ידי בעלי החיים בעלי תחלואת perioperative נמוך ותמותה.
Protocol
הכנת תאים סרטניים לפני ניתוח א
- U251 תאי multiforme glioblastoma transduce עם וקטור ביטוי lentiviral (pGreenFire, המערכה Biosciences) ליציבות להביע את גן בלוציפראז הגחלילית.
- תאים אלה גודלו ב10 מ"ל של השינוי של מלא Dulbecco של המדיום של הנשר (DMEM), אשר מורכב מDMEM בתוספת סרום 10% עובריים עגל, 1% פניצילין סטרפטומיצין, וחומצות אמינו לא חיוניות 1% בבקבוקון תרבית רקמת T75 דוגר ב 5% C0 2 ו 37 ° C.
- לבצע תרבית תאים סטנדרטית, החל בשטיפת התאים עם פוספט נאגר מלוח (PBS) ואחרי trypsinizing.
- להרוות טריפסין עם DMEM מלא, להעביר את הפתרון לבקבוק 50 מיליליטר חרוטים ולקבוע את הריכוז הסלולרי באמצעות מונה קולטר.
- צנטריפוגה את התאים שנקטפו בDMEM מלא ל 3 דקות בקצב של כ 3000 סיבובים לדקה.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב שלf התקשורת משאירה רק גלולה של תאים בחלק התחתון של בקבוק 50 מיליליטר החרוטים.
- עובד במהירות כדי למנוע את התאים מפני התייבשות, מחדש להשעות את התאים בנפח הטרי DMEM המלא כדי להשיג את הריכוז הרצוי של 50,000 תאים / μl והעברה לבקבוקון סטרילי 2 מ"ל מונח על קרח.
- תאים על קרח צריכים להיות vortexed בקצרה על הגדרה נמוכה מדי ~ 20 דקות כדי למנוע הידבקות תא. תאים ניתן להשתמש בבטחה לimplantations תוך גולגולתי עד שעות לאחר הצבה על קרח.
השרשת xenograft orthotopic B.
- שוקל athymic NCR עכבר עירום (נו / נו) להקים בסיס משקל, לפני השתלה. בדרך כלל אנחנו בוחרים עכברים 6-10 שבועות של גיל עם משקולות בין 17 ו 24 גרם.
- 1 שעה לפני ההשתלה, מראש תרופות משככות כאבים לעכבר עם 5 מ"ג / ק"ג של סם meloxicam אינו הסטרואידים אנטי הדלקתי באמצעות הזרקה תת עורית לטיפול בכאב שלאחר הניתוח ודלקת.
- Anesthetizדואר החיה עם זריקת intraperitoneal מתערובת קטמין / xylazine במינון של 140 מ"ג / ק"ג ו 10 מ"ג / קילו בהתאמה.
- ודא שהעכבר הוא די הרדים ידי הערכת התגובה הספונטנית של בעל החיים לקמצוץ בוהן. אם בעל החיים מגיבים לקמצוץ בוהן, לעכב את ההליך עד להרדמה תיכנס לתוקף או לשקול הזרקת הרדמה נוספת (<25% מהסכום המקורי).
- הכן את העכבר מורדם למיצוב בStoelting הדיגיטלי רק לפלטפורמת Stereotactic מאוס (Stoelting Inc) על ידי משדל את השיניים החותכות של העכבר בשורת העקיצה עוצר החוטם והידוק מהדק האף מעל החוטם תוך ההבטחה כי ראשו של העכבר הוא על מטוס ברמה.
- העבר את העכבר המאופק לפלטפורמת stereotactic Stoelting, התאמת המיצוב של בעלי החיים, כך שקצות פסי אוזניו בסוף הזנב של תעלת האוזן. ברגע שמיצוב גולגולת לזנבו של בעל החיים כבר adjusטד, לאבטח את סרגל הביס למסגרת stereotactic. העכבר צריך להיות מונח על צלחת חברת פלסטיק חימום (הרווארד Apparatus) מאובטחת עם קלטת לפלטפורמת Stoelting לספק משוב ויסות טמפרטורה מבוקרת במהלך הניתוח.
- התאם את הגובה של סורגי אוזן כנדרשת ולאחר מכן לקדם את סורגי האוזן לחלק הזנב של תעלת האוזן, אבטחתן כך שראשו של העכבר הוא במישור אופקי ומשותק במגע אצבע. לעקוב בזהירות לסימנים של מצוקה נשימתית לאחר השמה של סורגי האוזן. שחרר ומחדש את העמדה שאם בעל החיים במצוקה.
- הכנס את הקצה המשומן של בדיקת חום בפי טבעת המחוברת לבקר טמפרטורת TCAT-2DF (Apparatus הרווארד) לניטור הטמפרטורה של בעל החיים ולספק בקרת משוב לצלחת החימום ממוקמת מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב 36 מעלות צלזיוס במהלך ההליך.
- החל משחת עיניים לעיניים לprevent ייבוש.
- החל תמיסת פולידין לחלק העליון של ראשו של העכבר כדי לחטא את אתר החתך, מקפיד שלא לגעת בעיניים.
- בצע קמצוץ בוהן כדי לאשר את העכבר הוא מחוסר הכרה, ומספק כמות קטנה של קטמין הנוסף / xylazine (<25% מהמינון הראשוני) במידת צורך.
- לנקות קצת 0.45 מ"מ Burr התרגיל (Stoelting) שצורף לתרגיל (Foredom Microdrill) באמצעות כרית אלכוהול ולאחר מכן לחטא את המקדח בחרוז זכוכית מעקר (Germinator 500, CellPoint מדעי) עבור 15 שניות, לטבול רק את המקדח לתוך חרוזי המעקר.
- באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך סנטימטר 0.75 longitudinally באמצע הקרקפת משתרעת מהרמה של עיני caudally. אשר להדמיה של גבחת.
- הצרף מחזיק מקדחה לפלטפורמת Stoelting ולמקם את מקדחה (Foredom Microdrill) עם קצת 0.45 מ"מ Burr תרגיל (Stoelting) במחזיק המקדחה, לקבע אותו בתפקיד.
- הנח את המקדח בדיוק מעל tהוא גבחת ולאחר מכן אפס מתוך x, y, z קואורדינטות של תצוגת stereotactic הדיגיטלית. העבר את קצה המקדח לעמדה אחורי 2 מ"מ ורוחב 1.5 מ"מ לגבחת באונה הימנית במוח ולקדוח לתוך הגולגולת של החיה עם מקדחת Foredom, מנקב רק העצם. צמר גפן סטרילי ניתן להשתמש בעדינות לחזור בו את הקצוות של החתך כדי להקל הדמיה של הגולגולת.
- הסר את התרגיל והתרגיל מבעל פלטפורמת stereotactic.
- צרף משאבת מזרק מזרק Nanomite (Apparatus הרווארד) לפלטפורמת stereotactic.
- מסיר את התאים מקרח וגם עדינות מערבולת הבקבוקון המכיל את התאים הסרטניים עם פולסים קצרים או בעדינות קפיצית הבקבוקון מחדש להשעות את התאים. צייר את 7 μl של השעית התא דרך 30 מד "מחט 1 ארוכה שטוחה פוע מחוברת למזרק 10 μl (המילטון מזרק). הימנע מבועות אוויר גדולות במזרק. ודא כי אין בועות אוויר ב6 μl הראשוני של נוזל WHich יהיה הנפח הכולל הוזרק לעכברים. בועות אוויר קטנות בμl 1 הנותרים הן לא עניין. הימנע קופצים לצייר חוזר ונשנה של השעית התא אם אפשר כדי למזער את הניזק לתאים.
- מקם את המזרק הטעון לתוך מזרק המזרק. שימוש בכרית אלכוהול, והסרת חלק מנוזל השעית התא שמופיע בקצה המחט על מנת למנוע זיהום של אתר החתך עם תאים סרטניים שעלולות לגרום לגידול ההולך וגובר במרחב extracranial.
- הגדר את משאבת ההזרקה, כדי לספק 6.0 μl בשיעור של 0.5 μl / דקה. Μl 1 מתוך השעית תא שנותרה במזרק לאחר ההשתלה מבטיחה כי בועות האוויר שלעתים קרובות אוספות במזרק לא מזריקות לבעלי החיים. הזרקה של בועות אוויר עלולה לגרום לתסחיף אוויר קטלני.
- לקדם את מחט המזרק לתוך חור Burr שמירה ניצבת מחט (90 מעלות) לגולגולת. ברגע שהמחט חצתה את הגולגולת, אפס coordinאטס על הצג הדיגיטלי ואז להתקדם לאט stereotactic קצה המחט על פני תקופה של 4 דקות עד שהוא מגיע לעומק של 2.5 מ"מ. המחט עוברת דרך הקליפה וחלקים של ההיפוקמפוס האחורי. X, y, z קואורדינטות להשתלת stereotactic נבחרו לייצר גידול בעמדה רוחבית באונה המוחית תוך הימנעות פגיעה במבני מוח קריטיים כגון התלמוס וקרבה לחדרי לב ובכך מקטינים את הסיכוי לזריעת הנוזל השדרתי עם תאים סרטניים שעלול לגרום לגידולים בעמוד שדרה לא רצויים. מיקום יחסי לגבחת אחורי נבחר כדי להפחית את הסיכוי לגידול גדול, מתקדם מקומי ulcerating למסלול. השהה עם המחט בעומק של 2 דקות ולאחר מכן ליזום השתלה של תאים.
- במהלך השתלה, לייבש את הגולגולת שוב ושוב עם חנית ספוג מייקרו כדי להסיר כל נוזל גידול המכיל שאולי refluxed מתוך חור הצרימה, במהלךהשתלה. למנוע שיבוש המחט עם ספוג מייקרו. הסרת נוזל זה אמורה להפחית את הסיכוי לגידול ההולך וגובר במרחב extracranial.
- לאחר ההזרקה היא מוחלטת, להשאיר את המחט במוח לכ 2 דקות ולאחר מכן למשוך את המחט באיטיות על פני תקופה של 3-4 דקות.
- שחרר את ברי אוזניים ועוצרות את החוטם ולהסיר את העכבר ממנגנון stereotactic.
- סגור את חור הקוץ בגולגולת בשעוות עצם סטרילי הופקד על ידי שפשוף שעווה הלוך ושוב מעל לבור שBurr מקצה העץ של מוליך סטרילי כותנה שקצו. המשך להפעיל שעוות עצם, עד שהבור אטום לחלוטין ושעוות עצם איטום חור קלף היא סומק עם הגולגולת הסמוכה.
- Re-מקורבי שולי החתך עם מטליות כותנה סטריליים והחלים דבק רקמות וטרינרית כדי לאטום את הפצע, מקפיד להימנע מחשיפת העיניים לדבק של בעלי החיים.
- לבסוף, הנח את העכבר על משטח חימום המוגדר 37 מעלותC עד שהחיה משחזר את הכרתו. להעביר את בעלי החיים בחזרה לכלוב המקורי שלו פעם אחת על העכבר הוא ערני ומגיב.
ג bioluminescent הדמיה (BLI) כדי לפקח על גדילה ותגובה לטיפול גידול
הוראות קצרות פעלו להדמית bioluminescent.
- הרדם עכברים מושתלים בעבר עם גידול בחדר עם 2% isoflurane וחמצן.
- בעוד העכברים מורדמים, מזריק אותם מתחת לעור או או intraperitoneally עם 60 μl של מלח אשלגן D-luciferin המדולל ב PBS לריכוז של 50 מ"ג / מ"ל.
- הפעל את זרימת ההרדמה אל אצטרובלי האף בסורק הדמית bioluminescent ולהעביר את העכברים במהירות לסורק הצבת חוטמיהם בגביעי האף.
- מקם חוצצים שחורים בין העכברים להגביל את הדימום של אות bioluminescent מגידול בעוצמת אות גבוהה לגידול צמוד עם אות נמוכה בהרבה.
- שימושתוכנת תמונת החיים, לקחת חשיפות סידוריות תכופות למשך תקופה כוללת של עד 30 דקות לאחר הזמן של הזרקה של D-luciferin. אנו בעד קביעת זמן החשיפה ל" אוטומטי "כדי להגביל את הסבירות לתמונה מתחת או חשופת יתר. לא חשיפה יחידה צריכה להיות> 5 דקות.
- בצע לחזור הדמית bioluminescent במרווחי הזמן מתאימים. הדמיה שבועית סידורית היא אפשרות סבירה לניסויים אורכיים רבים בדיקות לתגובה לטיפול.
- לאחר רכישה של תמונות, השתמש בתוכנת תמונת חיים לנתח גידולים על ידי ציור אזור של עניין (ROI) מסביב לכל גידול בכל תמונה שנרכשה במהלך פגישת הדמית bioluminescent. החל אזור שני, קטן יותר של ריבית לאגף התחתון של כל עכבר בכל תמונה כרקע של אזור עניין כדי לתקן את אות bioluminescent של גידול המבוססת על המידה של עוצמת אות רקע bioluminescent. אנחנו מעדיפים להשתמש בהגדרה "הזיו" ולא "ספירות" כפלטערכים עבור אות bioluminescent.
- לייצא את תוצאות ההחזר על ההשקעה לתוך Excel ולקבוע את אות bioluminescent רקע המותאמת המרבית לכל עכבר.
- חזור על הדמית bioluminescent כפי שצוין לניטור סדרה של גידול. בניסויים שלנו, אנו מבצעים BLI השבועי. אנחנו מעדיפים קביעת האות המקסימלי BLI לישיבת הדמיה ניתנה על ידי לקיחת חשיפות תכופות מעל 5-30 דקות לאחר הזרקה של D-luciferin.
תוצאות מייצגות ד
טכניקת השתלת stereotactic זה קשור לשיעור גידול מוצלח קח של 90-100% ועם תמותת perioperative נמוכה שהיא בדרך כלל פחות מ 5%. הסיכון לתופעות לוואי בלתי צפויות הוא נמוך גם עם טכניקה זו, כולל סיבוכים כגון זריעה של חוט השדרה מתאי גידול מושתל לחדרי לב, או צמיחת גידול extracranial משתי הזריעה של החתך עם תאים סרטניים או סגירה לקויה של חור Burrllowing גידול תוך גולגולתי להרחיב דרך הפתח בגולגולת.
ניתוח vivo לשעבר של xenografts גידול הפגין אזורים צפויים של היפוקסיה, ביטוי VEGF מוגבר, ונימק. מיקרוסקופיה פלורסנט לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הביע ביציבות על ידי שורת תאי GBM גילתה אופי infiltrative של xenografts אלה.
איור 1 מציג את התוצאות של השתלה מוצלחת stereotactic טיפוסית של תאי GBM במוח של עכבר. זו בדיקת MRI מוח T2 משוקללת של מוח עכבר הופיע עם מגנט 9.4 טסלה 21 ימים לאחר השתלה בטכניקה שתוארה כאן. איור 1 מגלה מוקד בודד של גידול באונה הימנית (צוף בורוד) מדידת 19 מ"מ 3 שlocalizes לקואורדינטות המדויקות של אתר ההשתלה.
איור 2 מציג את התוצאות של הדמית bioluminescent באמצעות techn iques מתואר כאן לקבוצה של 10 עכברים עם גידולים מושתלים stereotactically שהיו שווה מרובדת מבוססת על עוצמת אות bioluminescent מרבית לקבל גם הקרנת גולגולת (4 x 4 שברים יומיים GY) או ללא טיפול כלל. בניסוי זה, bioluminescent ההדמיה מראה כי הקרנות מעכבות את שגשוגם של גידולים המושתלים, וכתוצאה מכך אין עלייה באות bioluminescent המזוהה, ואילו את האות לעלייה ניכרת בגידולי שליטה מדומה מוקרנים, עקב התפשטות בלתי מבוקרת של התאים הסרטניים.
איור 1 (וידאו). סעיפי MRI עטרה של מוח עכבר המכיל גידול multiforme glioblastoma U251 עם contouring של נפח הגידול (בצבע ורוד). הסריקה בוצעה באמצעות פרוטוקול משוקלל T2 ספין הד בסורק 9.4 טסלה. לחץ כאן לצפייה בסרט.
מחדש 2 "src =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
איור 2. 10 עכברים עם גידולי multiforme glioblastoma מושתלים stereotactically טופלו גם עם טיפול חיצוני אלומת קרינה עד 16 Gy ב 4 שברים או ללא טיפול. עכברים צלמו עם הדמית bioluminescent לפני הטיפול ושבוע לאחר תחילת הטיפול. הגרף מציג פליטת אור יחסית מחושבת כשינוי קיפול החציוני בו שינוי הקיפול מוגדר כיחס שווי BLI מקסימאלי נוכחי לשווי מקסימאלי BLI טיפול מראש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה של השתלת stereotactic של תאים סרטניים בעכברים המתוארים במאמר זה reproducibly מייצרת גידולים, אשר סביר לסכם דפוס infiltrative ומהיר צמיחה של גליובלסטומה multiforme הקלינית 2, 6-8. טכניקה זו במיוחד היטב מתאימה לניסויי stratifying עכברים באופן שווה לקבוצות טיפול שונות בי גידולים לשעתק גודל דומה ומאפיינים ביולוגיים ובמקומות אנטומיים ספציפיים רצויים. השתלת Stereotactic של תאים סרטניים תוך שימוש בטכניקות שאנו מתארים אמורה להיות בקלות להשגה על ידי מעבדות מחקר translational ביותר 7,9-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר אנדרו הולנדר, שרה דייויס, לי שומן, טים ג'נקינס, וד"ר Xiangsheng שו לסיוע המומחה שלהם. אנו מכירים בתמיכתו של ד"ר אן קנדי. BCB נתמך בהדרכת ביולוגית קרינת גרנט C5T32CA009677. JFD נתמך פרס קריירת Wellcome ורוז למדענים רפואיים (1006792) על. JLB נתמך על עליות המענק (5 R25 CA140116-03). ברצוננו להודות ד"ר סטיב האן עידודו ותמיכה סייעה להפוך את המחקר שלנו אפשרי. אנחנו גם רוצים להודות לאוניברסיטת פנסילבניה Nano-יו ממשק המרכז (NBIC) ודניס ד"ר Discher לעידוד והערותיו מועילות. אנו מכירים במתקן הדמית החיה הקטן (סייף) באוניברסיטת פנסילבניה לשימוש במתקני גרעין MRI ואופטיים / פליטת אור שלהם. טכניקות אלו פותחו כחלק מפרויקטים שנתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות (-NS076548 RC1 CA145075 וK0801).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
- Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro. 3, e00063 (2011).
- Shelton, L. M. A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion. J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).
- Brehar, F. M. The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain. J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Radaelli, E. Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease. Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).
- Baumann, B. C. Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy. , Submitted (2012).
- Baumann, B. C. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).
- Park, S. S. MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).
- Szentirmai, O. Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect. Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).
- Dinca, E. B. Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
