Summary
私たちは、ヌードマウスとその後シリアルの脳に人間の多形性膠芽腫細胞の正確な、定位注入のための統合方法を説明
Abstract
多形性膠芽腫（GBM）は外科的切除、術後放射線療法とテモゾロミド療法1から構成される標準のトライ集学的治療にもかかわらず、ヒトでのみ14.6ヶ月の生存期間の中央値を持つハイグレード原発性脳腫瘍である。新しい治療法は明らかに生活の患者の生存率と品質を向上させるために必要とされる。より効果的な治療戦略の開発は、人間の病気を再現まだ腫瘍の成長や治療に対する反応を監視するためにシリアルイメージングを可能GBMの動物モデルによって支援されるであろう。本稿では、GBMの2のキーの臨床的特徴を再現腫瘍異種移植片を生じるヌードマウスの脳にバイオイメージング可能GBMの癌細胞の正確な定位注入のための私たちのテクニックを説明します。この方法では、再現性がある腫瘍をもたらし、順次内を監視するために生体内生物発光イメージングを可能にしながら、正確な解剖学的位置に配置されてい頭蓋の異種移植片の成長と治療3-5から応答。また、この方法は、低周術期の罹患率と死亡率を持つ動物での忍容性は良好である。
Protocol
A.術前の腫瘍細胞の調製
- レンチウイルス発現ベクター（pGreenFireは、System Biosciences）で形質U251多形性膠芽腫細胞が安定的にホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現させた。
- これらの細胞は10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、およびでインキュベートT75組織培養フラスコ内の1％非必須アミノ酸を添加したDMEMで構成されていますイーグル培地（DMEM）、の完全ダルベッコ改変10mlの中で成長させた5％CO 2、37℃
- トリプシン処理し、続いて緩衝生理食塩水（PBS）、リン酸で細胞を洗浄から始まり、標準的な細胞培養を行う。
- 完全DMEMでトリプシンをクエンチ、50ミリリットルの三角フラスコに溶液を移し、コールターカウンターを用いて細胞濃度を決定する。
- 毎分約3000回転で3分間完全DMEMで採取された細胞を遠心分離します。
- 遠心分離後の吸引50 mlコニカルフラスコの底部での細胞のペレットのみを残しウェブメディア。
- 50,000細胞/μlおよび氷上に置いた2ミリリットル滅菌バイアルへの転送、所望の濃度を達成するために、新鮮な完全DMEMのボリュームに再懸濁細胞は、乾燥から細胞を防ぐために迅速に取り組んでいます。
- 細胞接着を防ぐために氷の上の細胞を簡単に毎〜20分、低設定にボルテックスして下さい。細胞は安全に氷上に配置した後2時間以内に頭蓋内の着床用に使用することができます。
B.同所性異種移植注入
- ベースライン、着床前の体重を確立するためにヌード胸腺欠損マウスNCR（のnu / nu）を計量する。私たちは通常、17〜24グラムの間の重みを持つマウスの年齢の6-10週を選択します。
- 移植前に1時間、術後の痛みや炎症の治療薬として皮下注射を介して、非ステロイド性抗炎症薬メロキシカムの5 mg / kg投与でマウスをあらかじめ薬で治療。
- AnesthetizE 140 mg / kgを、それぞれ10 mg / kgの用量でケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射を持つ動物。
- マウスはつま先のピンチに対する動物の自発的応答を評価することによって、十分に麻酔をかけていることを確認します。動物がつま先のピンチに応答した場合は麻酔が効果を取るか、または追加の麻酔（元の金額の<25％）を注入することを検討できるようになるまで、手順を遅らせる。
- マウスの頭が上にあることを確保しながら、鼻拘束のかまバーにマウスの切歯をフックと鼻の上にノーズクランプを締めることによってちょうどマウス定位プラットフォーム（Stoelting社）のStoeltingデジタルでの位置決めのために麻酔マウスを準備水平面。
- 耳の棒の先端が外耳道の尾側にあるように、動物の位置を調整し、Stoelting定位プラットフォームに拘束されたマウスを転送します。動物の頭蓋から尾側の位置決めがadjusされたらテッドは、定位フレームにかまバーを固定します。マウスは、手術中にフィードバック制御温度調節を提供するStoeltingプラットフォームにテープで固定固いプラスチック加熱板（ハーバード装置）の上で休憩する必要があります。
- それらは、例えば、マウスの頭が水平面内にあり、指のタッチに固定化されたことを確保し、必要に応じて耳のバーの高さを調節する場合は、外耳道の尾部に耳バーを進める。耳バーを配置した後に呼吸困難の兆候がないかを注意深く監視している。緩めて、動物が苦痛になっている場合、再位置。
- 動物の温度を監視するために、36の動物の体温を維持するために、マウスの下に配置された加熱板にフィードバック制御を提供するためにTCAT-2DF温度コントローラ（ハーバード装置）に接続されている直腸温度プローブ°中にCの潤滑先端を挿入手順。
- preveする目に眼軟膏を適用ntは乾燥。
- 目を避けるように注意しながら、切開部位を消毒するために、マウスの頭の上にベタジンソリューションを適用します。
- マウスを確認するためにつま先のピンチを実行し、必要に応じて追加のケタミン/キシラジン（初期投与量の<25％）の少量を提供する、無意識です。
- 0.45ミリメートルバリドリルビット（Stoelting）アルコールパッドを使用してドリル（Foredomマイクロドリル）に取り付けられており、その後にのみドリルビットを浸漬し、15秒間ガラスビーズ滅菌器（オーチャードグラス500、CellPointサイエンティフィック）のドリルビットを殺菌を清掃殺菌ビーズ。
- 滅菌メスを使用して、尾目の高さから延び半ば頭皮に縦0.75センチメートルの切開を行う。ブレグマの可視化を確認してください。
- Stoeltingプラットフォームにドリルホルダを取り付け、所定の位置に固定して、ドリルホルダで0.45ミリメートルバリドリルビット（Stoelting）とドリル（Foredomマイクロドリル）を置きます。
- まさにトン以上のドリルビットを配置彼はその後ブレグマとゼロアウトのx、y、zは、デジタル定位ディスプレイの座標。骨のみを刺し、位置後方2ミリメートルとForedomドリルで動物の頭蓋骨に右大脳半球とドリルでブレグマ横1.5mmにドリルの先端に移動します。滅菌綿棒を穏やかに頭蓋骨の可視化を容易にするために切開の縁を後退させるために使用することができます。
- 定位プラットフォームからドリルとドリルホルダーを取り外します。
- 定位プラットフォームにNanomiteインジェクタシリンジポンプ（ハーバード装置）を取り付けます。
- 氷から細胞を取り出して、そっと短いパルスを用いて腫瘍細胞を含むバイアルまたは細胞を再懸濁するためにバイアルをフリックどちら優しく渦。 10μLシリンジ（ハミルトンシリンジ）に取り付けられた30ゲージ1 "長いフラットベベル針を介して細胞懸濁液7μlを策定する。シリンジ内の大きな気泡を避けてください。流体の初期6μl中に気泡がないことを確認WHICHは、マウスに注入総量になります。残りの1μlで小さな気泡がない問題になっています。細胞へのダメージを最小限に抑えることが可能であれば、細胞懸濁液の描くアップを繰り返さないようにしてください。
- シリンジ注入器に充填した注射器を置きます。アルコールパッドを使用して、頭蓋外の空間に増殖する腫瘍になることがあり、癌細胞で切開部位の汚染を防止するために、針の先端に現れる細胞懸濁液のいずれかを削除してください。
- 0.5μL/分の速度で6.0μLを提供するために、噴射ポンプを設定します。注入後、シリンジ内に残っている細胞懸濁液1μlのは、頻繁に注射器で収集気泡が動物に注入されていないことを保証します。気泡の注入は、致命的な空気塞栓につながる可能性があります。
- 頭蓋骨に針を垂直（90度）を維持バリ穴に注射針を進める。針は、頭蓋骨、coordin出ゼロを横断した後次に定位デジタルディスプレイ上のATES、それは2.5mmの深さに達するまでゆっくりと4分間かけて針の先端を進める。針は後部海馬の皮質と部分を通過する。のx、y、zは定位注入の座標は、視床と、腫瘍細胞と脳脊髄液を播種の可能性を低減心室への近接などの重要な脳の構造への損傷を回避しながら、大脳半球内に横方向に配置され、腫瘍を発生させるために選ばれました望ましくない脊髄腫瘍を生じさせる可能性がある。ブレグマに対する相対位置が後方の軌道に大きな潰瘍、局所進行性腫瘍の可能性を低減するために選択した。 2分間の深さに針で一時停止した後の細胞の注入を開始します。
- 注入中に、中にバリ穴から還流した可能性のある腫瘍含有流体を除去するために顕微スポンジ槍で繰り返し頭蓋骨を乾かす注入。顕微スポンジで針を中断することは避けてください。この流体を削除すると、頭蓋外の空間に成長する腫瘍の可能性を減少させる必要があります。
- 注入が完了した後、約2分間の脳に針を残して、その後徐々に3から4分間にわたって針を撤回します。
- 耳バーや鼻拘束を緩め、定位装置からマウスを削除します。
- 滅菌綿棒の木製の端から削り穴を行き来ワックスをこすりによって堆積無菌骨ワックスで頭蓋骨の穿頭孔を閉じます。穴が完全に密封され、バリ孔を封止する骨ワックスが隣接頭蓋骨と一直線になっているかまで、骨蝋適用を続行します。
- 再おおよその滅菌綿棒と切開部の縁や動物の目に接着剤の曝露を避けるように注意しながら、傷口を密閉するために獣医組織接着剤を適用します。
- 最後に、37に設定した加熱パッドの上にマウスを置き°動物まで、Cは意識を回復します。マウスは、アラートと応答されると、元のケージに戻し動物を転送します。
C.生物発光イメージング（BLI）は、腫瘍の成長や治療への反応を監視する
簡単な指示には生物発光イメージングのために従ってください。
- 以前に2パーセントイソフルランと酸素室で腫瘍を移植したマウスを麻酔。
- マウスは麻酔ですが、50 mg / mlの濃度になるようにPBSで希釈したD-ルシフェリンカリウム塩の60μlを皮下または腹腔内にそれらを注入。
- 生物発光イメージングスキャナのノーズコーンに麻酔の流れをオンにして、素早くノーズコーンで自分snoutsを置くスキャナにマウスを移す。
- はるかに低い信号と隣接する腫瘍に高信号強度と腫瘍からの生物発光信号の出血を制限するために、マウスの間で黒い仕切りを置きます。
- 使い方リビングImageソフトウェア、D-ルシフェリンの注射の時間の30分後までの合計期間に頻繁にシリアルエクスポージャーを取る。我々は、下または露出オーバーの画像の可能性を制限する "オート"に露光時間を設定好む。単一の露出が> 5分であってはならない。
- 適当な間隔で生物発光イメージングを繰り返し実行します。シリアル毎週イメージングは、治療への反応をテストし、多くの縦の実験のための合理的なオプションです。
- 画像の取得後は、生物発光イメージングセッション中に取得した各画像における各腫瘍の周りに関心領域（ROI）の領域を描画することによって腫瘍を分析するために生きているイメージのソフトウェアプログラムを使用します。背景生物発光信号強度の度合いに基づいて腫瘍の生物発光信号を補正するための関心の背景領域として各画像の各マウスの下側側面に、第2の目的は、小さい領域を適用します。私たちは、 "ラディアンス"の設定ではなく出力として "カウント"を使用して好む生物発光信号の値。
- ExcelにROIの結果をエクスポートし、各マウスの最大バックグラウンドで調整生物発光信号を決定します。
- 腫瘍増殖のシリアルモニタリングに示されるように、生物発光イメージングを繰り返します。私たちの実験では、毎週のBLIを実行します。 D-ルシフェリンの注射後30分 - 我々は5の上に頻繁なエクスポージャーを取ることにより、指定されたイメージングセッションに対する最大のBLI信号を決定することを好む。
D.描写結果
この定位注入法は、90〜100％の成功腫瘍テイク率は、5％より通常小さい低周術期死亡率と関連しています。意図しない副作用の危険性は、腫瘍細胞または穿頭孔の不十分な閉鎖が付いている切開のいずれかの播種から心室、または頭蓋外腫瘍の成長に移植した腫瘍細胞から脊髄の播種などの合併症を含めて、また、この手法の低いA頭蓋骨の開口部を通って拡大して頭蓋内腫瘍をllowing。
腫瘍異種移植片の ex vivo での解析では、低酸素状態の予想領域を実証VEGFの発現、および壊死の増加となりました。安定的に私たちのGBM細胞株によって発現緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光顕微鏡では、これらの異種移植片の浸潤性質を明らかにした。
図1は、マウスの脳へのGBM細胞の典型的な成功した定位注入の結果を示しています。これは21日ここで説明されたテクニックを持つ、移植後9.4テスラの磁石を用いて行ったマウスの脳のT2強調脳MRIスキャンであり、 図1は、19ミリメートル3を測定する右半球（ピンクで輪郭）で腫瘍の単焦点を明らかにするそれは移植部位の正確な座標に局在する。
図2は technを使用して生物発光イメージングの結果を示してい iquesか全脳照射（4Gyの×4毎日の画分）または全く治療を受けることが最大の生物発光信号強度に基づいて均等に層別化された定位的に移植された腫瘍で、10匹のマウスのグループのためにここで説明。この実験では、生物発光イメージングは、信号が実質的に癌細胞の未チェックの増殖による模擬照射対照腫瘍で増加する一方、放射線療法は、検出された生物発光シグナルの増加なしで、その結果、移植された腫瘍の増殖を阻害することを示しています。
図1（ビデオ）。腫瘍体積（ピンク色）の輪郭とU251多形性膠芽腫の腫瘍を含むマウス脳の冠状MRIのセクションを参照してください。スキャンが9.4テスラスキャナの上にスピンエコーT2強調プロトコルを使用して行われた。 ムービーを見るにはここをクリック 。
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図2：定位的に注入された多形性膠芽腫の腫瘍を持つ10匹のマウスは、外部照射4分画に16 Gyの治療または無治療のいずれかで処理した。マウスは、治療開始後、治療前に、毎週の生物発光イメージングで描出された。グラフには、倍の変化が治療前の最大のBLI値を現在最大のBLI値の比として定義される中央値倍数変化として計算された相対生物発光を提示します。
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Discussion
本稿で述べたマウスでは、がん細胞の定位注入の方法が合理的に再現可能な臨床神経膠芽腫膠2、6-8の浸潤および急速な成長パターンを再現腫瘍を発生させる。この手法は、特に匹敵する大きさと生物学的特性および特定の解剖学的位置で再現腫瘍が望まれている別の治療群に均等にマウスを階層化実験に適しています。私たちが説明する技術を用いて、腫瘍細胞の定位的注入はほとんどのトランスレーショナル·リサーチ研究所7,9-11によって容易に達成可能である必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、彼らの専門的な支援のための博士アンドリューホランダー、サラ·デイビス、リー·シューマン、ティム·ジェンキンス、博士Xiangsheng Xuさんに感謝しています。私たちは、博士アンケネディのサポートを承諾。 BCBは、放射線生物トレーニンググラントC5T32CA009677でサポートされていました。 JFDは、医療科学者のためのバローズウェルカムキャリア賞（1006792）でサポートされていました。 JLBは、スーパークラスの助成金（5 R25 CA140116-03）でサポートされていました。我々は、その励ましと支援の研究が可能になる助けた博士スティーブ·ハーンを承認したいと思います。我々はまた、励ましや有益なコメントをペンシルベニアナノバイオインターフェースセンター（NBIC）博士とデニスディッシャー大学に感謝したいと思います。我々は彼らのMRIおよび生物発光/光中核施設の使用のためにペンシルベニア大学で小動物イメージング機能（SAIF）を認める。これらの技術は、米国立衛生研究所（RC1 CA145075とK08-NS076548によってサポートされていたプロジェクトの一環として開発された01）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
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