Summary
Die Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an den Synapsen stark beeinflusst geclusterten synaptischen Stärke. Diese Methode quantifiziert fluoreszenzmarkierten Neurotransmitter-Rezeptoren in drei Dimensionen mit Single-Auflösung in Synapsen
Abstract
Synapse Stärke bezieht sich auf die Amplitude des postsynaptischen Antworten auf präsynaptische Freisetzung von Neurotransmittern Ereignisse, und hat einen großen Einfluss auf die Gesamt-neuronalen Schaltkreis-Funktion. Synapse Stärke hängt entscheidend von der Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an Synapsen auf der postsynaptischen Membran gruppierten. Rezeptor-Ebenen sind entwicklungsgeschichtlich, etabliert und kann durch Rezeptortransport zwischen Oberflächen-lokalisierten, subsynaptischen und intrazellulären Pools, die für wichtige Mechanismen der synaptischen Plastizität und Neuromodulation verändert werden. Rigorosen Methoden zur synaptisch-lokalisierte Neurotransmitter-Rezeptor Fülle quantifizieren sind unerlässlich, um synaptischen Entwicklung und Plastizität zu studieren. Die Fluoreszenzmikroskopie ist optimal, weil es räumliche Information erhält, unterscheiden synaptischen aus nicht-synaptischen Pools und Unterscheiden zwischen Rezeptorpopulationen lokalisiert, um verschiedene Arten von Synapsen. Die genetischen Modellorganismus Caenorhabditis elegans ist besonders gut für diese Studien aufgrund der geringen Größe und der relativen Einfachheit seines Nervensystems, seine Transparenz, und die Verfügbarkeit von leistungsfähigen genetischen Techniken geeignet und ermöglicht Untersuchung der nativen Synapsen in intakten Tieren.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Neurotransmitter-Rezeptoren in C. elegans. Sein wesentliches Merkmal ist die automatisierte Identifikation und Analyse einzelner Synapsen in drei Dimensionen in mehreren Ebenen konfokalen Mikroskop Ausgabedateien, Tabellieren Position, Volumen, Intensität der Fluoreszenz, Fluoreszenz und insgesamt für jede Synapse. Dieser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber der manuellen Analyse der z-Ebene konfokale Projektionen von Daten. Erstens, weil jede Ebene des konfokalen Datensatz enthalten ist, werden keine Daten über z-Ebene Projektion verloren, in der Regel auf Pixelintensität Durchschnitte oder Maxima basiert. Zweitens Identifizierung von Synapsen automatisiert ist, aber durch die ex überprüft werdenperimenter wie die Datenanalyse geht, so dass eine schnelle und genaue Extrahierung von Daten aus einer großen Anzahl von Synapsen. Hunderte bis Tausende von Synapsen pro Probe leicht erhalten werden, produzieren große Datensätze statistische Energie zu maximieren. Überlegungen zur Vorbereitung C. elegans zur Analyse und Durchführung konfokale Bildgebung an Variabilität zwischen den Tieren innerhalb Behandlungsgruppen zu minimieren werden ebenfalls diskutiert. Zwar entwickelt, um C zu analysieren elegans postsynaptischen Rezeptoren, ist dieses Verfahren im Allgemeinen für jede Art von synaptisch-lokalisierten Protein oder Tat, einem Fluoreszenz-Signal, das diskrete Cluster, Punkte oder Organellen lokalisiert ist nützlich.
Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1) Herstellung von Proben, 2) konfokale Abbildung, und 3) Bildanalyse. Schritt 1 und 2 sind spezifisch für C elegans, und Stufe 3 ist allgemein anwendbar auf jede punktförmige Fluoreszenz-Signal in der konfokalen Aufnahmen.
Discussion
Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um quantitative Multi-Parameter-Daten für große Populationen von Synapsen in C extrahieren elegans, bei gleichzeitiger Maximierung der Konsistenz innerhalb Behandlungsgruppen. Drei Merkmale tragen zu diesen Zielen. Zunächst wird Immunfärbung auf synchrone Wurm Populationen durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle Tiere gleich alt sind. Dieser Schritt ist wichtig, weil Entwicklungs-Regulierung der Expression Effekte der experimentellen Behandlung zu verschleiern kann (z. B. UNC-49 GABA-Rezeptor Immunfluoreszenz variiert ein Vielfaches während der Entwicklung (K. Davis et al., In Vorbereitung)). Darüber hinaus können Permeabilisierung und Fixierung sehr variabel sein, so dass quantitative Vergleiche schwierig. Mit synchronisierten Kulturen minimiert dieses inhärente Variabilität, die Verbesserung der Zuverlässigkeit der Technik. Andere Möglichkeiten, diese Variabilität behandeln sind mit einem zweiten Antikörper an einen unabhängigen Ziel, die unabhängig voneinander visualisiert werden können als interneSteuerung zur Permeabilisierung oder bildgebende Proteine in lebenden Würmer, welche die Notwendigkeit zur Permeabilisierung einfach umgangen GFP-markierten. Doch diese letztgenannte Ansatz führt neue Probleme, weil das endogene Protein wird nicht mehr direkt, also potentielle Artefakte aufgrund von Inkonsistenzen in Transgenexpression / Kopienzahl, strukturelle Veränderungen aufgrund der Fusion von GFP, oder nicht-physiologische Expression der Transgene gemessen werden müssen betrachtet. Keine einzige Methode ist perfekt, ideal, bestätigende Daten können mit mehreren Ansätzen werden. In diesem Protokoll hat sich die Größe der Starterkulturen wurde optimiert, um in ausreichender Zahl von fixierten und gefärbten Würmer für die konfokale Analyse führen. Große Anzahl von Würmern sind erforderlich, da die geometrischen Kriterien verwendet, um Würmer für die Bildgebung wählen streng sind, was ist der zweite Spielfilm des Protokolls zum Variabilität zu minimieren. Das gleiche anatomische Struktur muss in jedem Tier abgebildet werden (entweder die meisten biologisch relevanten Inhalt oder einebeliebig ausgewählte Stelle im Falle der breiten Gewebeverteilung des Proteins von Interesse), und diese Struktur orientiert sein in Richtung der Objektivlinse mit nur geringen Abweichungen auf beiden Seiten. Dieses Kriterium erhöht die Konsistenz indem Schwankungen in der Menge von dazwischenliegendes Gewebe, die Streuung von Anregung und Emission, beeinflussen können die Signalstärke. Es ist wichtig, dass dies das einzige Kriterium verwendet, um Würmer wählen ist, da es einfach zu Bias die Ergebnisse auf der Erwartung eines bestimmten Ergebnisses beruht. In der Tat lassen sich am besten Experimente durchgeführt blinde, soweit möglich. Das dritte Merkmal, das die Macht dieser Technik beiträgt, ist die automatisierte Identifikation und quantitative Charakterisierung der synaptischen Clustern in drei Dimensionen mit Endgeschwindigkeit. Diese Analyse ist einfach und schnell, zur Identifizierung und Tabellieren Hunderte bis Tausende von einzelnen Synapsen für jede experimentelle Bedingung. Noch wichtiger ist, umfasst Endgeschwindigkeit Daten von allen der Ebenen der Mehrebenen-confocal Daten-Stacks, statt Verwerfen von Daten zur Erzeugung der 2-dimensionalen z-Projektionen in früheren Protokollen verwendet. Stromabwärts von dieser Analyse kann experimentellen Gruppen im Hinblick auf die insgesamt synaptischen Fluoreszenz pro Tier, die räumliche Verteilung von Synapsen, und Häufigkeitsverteilungen der Bände, insgesamt Fluoreszenz und maximale Fluoreszenz einzelner Synapsen verglichen werden. Diese Parameter lassen sich offenbaren Schlüssel Übergänge anzeigt synaptischen Entwicklung Ereignisse, die Rollen von Entwicklungs-und regulatorische Proteine und synaptische Plastizität.
Die Quantifizierung der Fluoreszenz-Signale mit Endgeschwindigkeit, hat Anwendungen in der Neurobiologie über die Analyse von permeabilisierten festen C. elegans Proben, wobei nützlich für die Quantifizierung eines Fluoreszenzsignals lokalisiert mit hohem Kontrast Puncta. Daher ist es für die Analyse von festen Geweben oder Zellen von einem Organismus. Allerdings führt Fixierung und Permeabilisierung zu Visualisierung von insgesamt synaptischen Protein Bevölkerungs unabhängig davon, ob sie der Oberfläche exprimiert, während für die Rezeptoren zumindest, trägt nur die Oberfläche-Fraktion zum Ausdruck zu synaptischen Stärke sind. Endgeschwindigkeit-Analyse kann auch verwendet werden, um Oberflächen-exprimierten Populationen, sofern nicht durchdringbar Fixierbedingungen verwendet zu quantifizieren. Endgeschwindigkeit Analyse wird auch nützlich sein, Protein Dynamik in lebenden Zellen zu studieren. Viele Proteindomänen Shuttle zwischen vesikulären und extrazellulären Umgebungen mit unterschiedlichen pH-Wert während neuronale Signalübertragung Events (z. B. Carboxy-Terminus von Synaptobrevin während der synaptischen Vesikelfreisetzung 8-10, oder die Amino-terminalen Domänen von Neurotransmitter-Rezeptoren in Handels an die Zelloberfläche 11). Fusing pH-sensitiven Ekliptik GFP-Tags in diese Regionen können in vivo-Reporter dieser Übergänge, die quantitativ untersucht werden kann mit einer Endgeschwindigkeit Ansatz zu produzieren. Ebenso GFP-Markierung von Neuropeptid-Gene führt zu GFP-markierten Vesikeln mit dichtem Kern, dass de-Fleck alsdiese Vesikel mit der Plasmamembran 12; Endgeschwindigkeit Analyse kann in diesem Zusammenhang als Assay für spezifische Freisetzung von Neuropeptiden in vivo nützlich. Der Vorteil der Endgeschwindigkeit, Analyse in all diesen Einstellungen ist seine Fähigkeit, schnell zu identifizieren und zu quantifizieren, eine große Anzahl von Synapsen, so dass feine Unterschiede in ihrer individuellen Eigenschaften oder Ausschüttungen an die Bevölkerung mit statistischen Strenge demonstriert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei A. Benham für die Unterstützung bei der Entwicklung des Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde vom NIH finanziert NS06747 auf BAB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. | |||||||||
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T.
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
