Summary
Denna artikel beskriver i detalj ett protokoll till elektroporera i livmodern hjärnbarken och hippocampus vid E14.5 hos möss. Vi visar också att detta är en värdefull metod för att studera dendriter och ryggar i dessa två cerebrala regioner.
Abstract
In utero elektroporering (IUE) har blivit en kraftfull teknik för att studera utvecklingen av olika regioner av den embryonala nervsystemet 1-5. Hittills detta verktyg allmänt har använts för att studera regleringen av cellulär proliferation, differentiering och neuronal migrering speciellt i utvecklingen av cerebral cortex 6-8. Här har vi närmare vårt protokoll för att elektroporera i livmodern hjärnbarken och hippocampus och ge bevis för att detta tillvägagångssätt kan användas för att studera dendriter och ryggar i dessa två cerebrala regioner.
Visualisering och manipulering av neuroner i primära kulturer har bidragit till en bättre förståelse av de processer som är involverade i dendrit, ryggen och synaps utveckling. Men nervceller växer in vitro inte utsätts för alla de fysiologiska signaler som kan påverka Dendrite och / eller ryggrad bildning och underhåll under normal utveckling. Vår kunskap om dendritiska och ryggrad strukturer
Slutligen ger IUE ett användbart verktyg för att identifiera funktionella interaktioner mellan gener involverade i dendrit, ryggen och / eller synaps utveckling. I själva verket, till skillnad från andra genöverföringsmetoder såsom virus, är det enkelt att kombinera multipla RNAi eller transgener i samma cellpopulation.
Sammanfattningsvis är IUE en kraftfull metod som redan har bidragit till karakterisering av molekylära mekanismer som ligger bakom hjärnfunktion och sjukdom och den bör också vara användbara vid studium av dendriter och ryggar.
Protocol
I Storbritannien, möss inrymt, uppfödd och behandlas enligt de riktlinjer som godkänts av inrikesministeriet under djuret (vetenskapliga förfaranden) Act 1986.
1. Förberedelser: DNA-lösning och Needles
- Rena plasmid-DNA med en endotoxinfri Maxi-prep kit. Framställning av plasmid-DNA-lösning för injektion till önskade koncentrationer i vatten och tillsätt Fast Green (slutlig koncentration av 0,05%) för att visualisera injektioner. Effektiviteten av elektroporering är starkt beroende av DNA-koncentrationen. En koncentration av 1 pg / pl i allmänhet används. Denna koncentration är tillräcklig för att visualisera elektroporerade nervceller utan att påverka deras utveckling. Emellertid, enligt den promotor som används i plasmidvektorn (låg expressionsnivå med cytomegalovirus promotor / förstärkare, starkt uttryck i nivå med cytomegalovirusets omedelbara tidiga förstärkare och kyckling β-aktinpromotor-fusion (CAG)-promotor) samt storleken och stabilitet hos det uttryckta proteinet, kan denna koncentration justeras (0,25 | ig / | il till 5 pg / pl).
- Dra glas nålar med hjälp av en mikropipett avdragare.
2. Framställning av operationen
- Autoklavera kirurgiska instrument och fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Framställ analgetisk lösning i PBS (buprenorfin, Vetergesic, slutlig koncentration av 30 pg / ml). Väg gravida musen och injicera subkutant 0,1 mg / kg Vetergesic minst 30 minuter före operationen. Under denna tid framställa det kirurgiska området. Slå på värmedynor och återhämtningen kammare. Placera steril PBS i varmt vattenbad och alla sterila instrument och material på sterila dukar. Placera platina elektroder i en PBS fylld bägare och ansluta till elektroporator. Fylla nålen med den DNA-lösningen med användning av en microloader spets, ansluter nålen till det kapillära hållaren och nypa av spetsen på nålen med en kirurgtång.
- Söva en gravid mus (E14.5-E15.5) med isofluran i syre bärare (syre 2 l / min) med hjälp av en narkos induktion kammare. Vänta till dess att djuret förlorar righting reflex.
- Överföra djuret till ett "för-kirurgi" masken. Placera en droppe Eye Gel på varje öga för att förhindra hornhinnesår av ögonen medan mamman är under narkos. Använd en elektrisk rakapparat att raka håret av buken. Rengör det rakade området en gång med clorhexidine att samla flygande hår.
- Överföra djuret till en andra mask i det kirurgiska området. Placera musen med ryggen på värmedyna. Starta operation när pedalen reflexen har gått förlorad.
- Sätt på masken och sterila handskar. Täcka djuret med en steril duk (med ett litet hål över buken) för att förhindra att vävnad och instrument från att kontamineras av de hudområden som inte har rakats och desinficeras. Rengör det rakade området ent åtminstone 3 gånger med clorhexidine. Använd en annan steril bomullspinne varje gång. Använda en skalpell för att göra ett vertikalt snitt längs mittlinjen (~ 1 cm lång) genom huden. Med sax, göra en liknande snitt i muskeln i buken längs linea alba (vit linje som består mestadels av kollagen bindväv).
- Välj de mest tillgängliga embryon och placera ringen tången mellan två embryon och försiktigt dra embryonala kedjan ut ur bukhålan. Från denna punkt, hålla embryona hydrerad med steril förvärmd PBS.
Ingen mikroskop krävs för visualisering.
4. Injektion av DNA och Elektroporering
- Börja med en av de mest laterala embryon gör det lättare att hålla reda på vilka embryon elektroporerades. Dra inte för mycket på embryona, eftersom detta ökar risken för blödning. Manipulera läget av embryot inuti fostersäcken med användning av de ring-pincett ochstabilisera huvudet av embryon mellan ringarna. Pressa försiktigt pressa upp embryot närmare livmoderväggen.
- Med den andra handen, ta kapillär hållaren och stick in nålen försiktigt i mitten av halvklotet att rikta den laterala ventrikeln. Tryck på pedalen för att injicera ca 1 | il DNA-lösning blandades med Fast Green (mindre än 1 | il för att studera dendriter). Du bör observera det gröna färgämnet fylla den laterala ventrikeln. Kritiska steg: - Skärpan av nålen är avgörande att tränga igenom ordentligt livmoderväggen. Det är viktigt att minimera rörelse av nålen vid ytan av livmoderväggen och efter införande i ventrikeln eftersom en förstoring av hålet kommer att resultera i läckage av fostervatten och embryot dör. Undvik fartyg piercing blod i livmoderväggen, eftersom detta kommer att resultera i blödning och embryo död.
- Det är viktigt att inte injicera en alltför stor volym av DNA in i den laterala ventrikeln eftersom det kommer att inducerahydrocefalus (inte överstiger 2 pl kl E14.5). Volymen av DNA-justeras i enlighet med syftet av experimentet. Om 1 | il används i allmänhet för de flesta experiment, är en mindre volym av DNA (cirka 0,5 | il) som krävs för dendritbildning och ryggrad analys. I själva verket några isolerade celler behöver riktas för att visualisera och mäta dendritiska bersån på elektroporerade nervceller. - Placera elektroderna på sidorna av embryot huvudet med den positiva (+) paddla på samma sida som den injicerade kammaren för cortex elektroporering eller på motsatt sida av den injicerade kammaren för Hippocampus elektroporering (Figur 2). Applicera sedan fem 30V elektriska pulser (50 msek varaktighet) vid 1 sek intervall. Avgörande steg: Undvik att ström över placenta eftersom detta kommer att resultera i embryo döden.
Alla embryona i en gravid mus kan elektroporeras, vanligtvis med samma DNA-konstruktionen för att undvika förvirring. Men en lång operation minskning är det för överlevnaden av embryon. Bukhålan bör inte öppnas längre än 30 minuter.
5. Kirurgi efter elektroporering
- Efter elektroporera embryona, lägg PBS i bukhålan och använda ringen pincett för att ersätta livmoderhornet på sin ursprungliga plats. Suturera bukväggen och hud med Vicryl absorberbara suturer.
- Placera djuret i en återvinningskammare tills den aktiveras (vanligen 5-10 minuter) och sedan överföra i en bur placeras på en värmedyna.
6. Efter operation
Kontrollera mössens beteende för att bedöma smärta, lidande eller ångest och väga djuren 24 h och 48 timmar efter operationen. Vid behov kan analgetika administreras för att minimera smärta och obehag.
7. Tissue Processing
Samla elektroporerade embryona eller ungarna vid embryonala eller postnatal steg som krävs för försöket.
ove_content "> - För analys vid embryonala stadier (t ex för att studera cellproliferation och migration):Euthanize mamma via cervikal dislokation och samla embryona. Efter halshuggning, välj hjärnor som fått adekvat elektroporerade, vilket indikeras av mängden och placeringen av den fluorescerande signalen, visualiseras hela skallen med en fluorescerande kikare. Dissekera hjärnan ur skallen och fixa övernattning i 4% PFA och sedan i 20% sackaros / PBS över natten. Bäddas in i OCT-förening, frys vid -80 ° C och sektionen med användning av en kryostat.
- För analys vid postnatal steg (t ex för att studera dendriter och ryggar):
Bedöva avkomman eller vuxna möss med intraperitoneal injektion av pentobarbiton (40-60 mg / kg) och utför transkardiell perfusion med PBS, följt av 4% PFA i PBS. Dissekera hjärnan ur skallen och efter-fix i 4% PFA natten. Efter tvättningar i PBS, avsnitt hjärnorna med en vibratom (100 pm sektioner för dendrite analys). Montera sektionerna i Aqua Poly / fäste med 0.16-0.19 mm tjocka täckglas att bilden dendriter och ryggar.
8. Representativa resultat
Figur 3 visar exempel på elektroporerade cellerna i hjärnbarken (figurerna 3A, B), i CA1 (figurerna 3C, D) och i dentate gyrus i hippocampus (figurerna 3E, F). Vildtypsmöss elektroporerades vid E14.5 med en GFP-konstrukt (pCA-b-EGFPm5 ljuddämpare 3) och hjärnorna skördades vid postnatal dag (P) 14. Genom att injicera en liten volym DNA-lösning (0,5 | il eller mindre av en lösning vid 1 pg / pl), är ett fåtal celler märkta, vilket möjliggör visualisering av den dendritiska förgrening av isolerade GFP + celler (figur 3), såväl som deras ryggar vid högre förstoring (Figur 4).
<stark> Figur 1. Schematisk representation av elektroporation protokoll som kan användas för att studera dendriter och ryggar. (A) Elektroporering av en GFP-konstruktionen för att jämföra dendriter och ryggar i vildtyp-och mutant-möss. (B) Elektroporering av GFP-shRNA (GFP uttrycks från samma konstruktion) för att jämföra dendriter och ryggar i möss elektroporerade med en shRNA konstruera specifika för en gen av intresse (X) eller en kontroll shRNA. (C) IUE kan användas tillsammans med en Cre inducerbara systemet för att begränsa uttryck av shRNA till önskvärd tidsperiod. I detta experiment en vektor som uttrycker en form av Cre-rekombinas, som kan aktiveras av 4-hydroxitamoxifen (CAG-ER T2 Creer T2; 1 pg / pl) 10, elektroporeras tillsammans med en vektor som uttrycker en specifik shRNA i en Cre-beroende sätt (1 pg / pl och med en rekombination indikator (CALNL-GFP-konstruktionen, GFP-uttryck induceras genom Cre;. 1 pg / pl) 10 verkningsgradency av knockdown kan förbättras genom att öka koncentrationen av den shRNA samt öka CAG-ER T2 Creer T2 koncentration.
Figur 2. Spatial kontroll av elektroporering. Denna siffra visar var att placera paddla elektroderna enligt DNA injektionsstället för att rikta hjärnbarken eller hippocampus.
Figur 3. Visualisering av den dendritiska spindeln in utero elektroporerades celler i hjärnbarken och hippocampus. (A, B) Koronala sektioner som visar GFP + pyramidala celler i hjärnbarken, (CD) pyramidala celler i CA1 av hippocampus och (E, F), granulceller i gyrus dentatus i P14. En GFP konstruktion (PCA-b-EGFPm5 ljuddämpare 3) elektroporerades vid E14.5. Högre förstoring bilder (B, D, F) visar att IUE är en effektiv metod för att visualisera dendriter. Skalstrecken representerar 50 pm (B, D och F), 150 ^ m (A, C, E).
Figur 4. Visualisering av Dendritutskotten i P14 nervceller som elektroporerades i livmodern vid E14.5 med GFP-uttryckande konstruktion. (A, B) med hög förstoring bilder av ryggrader från basala dendriter hippocampala pyramidala neuroner. Skalstrecken representerar 5 pm (A) och 2 ^ m (B).
Discussion
IUE är ett kraftfullt verktyg för att manipulera genexpression inte bara i rummet utan även med tiden. Vi visar här att denna teknik kan användas för att visualisera och genetiskt manipulera dendriter och ryggar i hjärnbarken och hippocampus hos möss. Förutom de fördelar som tidigare nämnda, är det värt att notera att IUE, i motsats till Golgi-metoden, kan kombineras med immunohistokemi eller hybridisering in situ, vilket tillåter exempelvis att fenotyp de elektroporerade cellerna. Det är också viktigt att nämna att detta förfarande inte inducerar tydliga hjärnan missbildningar trots sin relativa invasivitet. Dessutom, på cellnivå, ändrar IUE inte de elektrofysiologiska egenskaperna hos de elektroporerade neuroner 13. Även om vår demonstration fokuserar på visualisering av dendritiska och ryggrad morfologier kunde IUE av kortikala eller hippocampus neuroner vid E14.5 också användas för att studera andra utvecklingsstörningar händelser såsom axon formation och vägledning. I Lägg tillition, samma typ av protokoll kan genomföras på andra stadier av embryonal utveckling för att rikta olika populationer. Till exempel kan en utvecklingsmässigt mycket sent kortikala elektroporering paradigmen vid E18.5 utföras för att driva expression i astrocytiska progenitorer 1. Liknande sätt, medan en elektroporation av hippocampus vid E14.5 tillåter att rikta CA1-CA3 pyramidala neuroner progenitorer och gyrus granul-cell ursprungsceller samtidigt, skulle en sen hippocampus elektroporering (E18.5 eller tidiga postnatala) tillåter att rikta olika gyrus granul stamfäder 14. I detta fall kan den injicerade volymen av DNA ökas såväl som intensiteten hos strömmen.
Transgener införs genom IUE verkar vara episomala och därför förlorade från celler på varandra följande celldelningar. I postmitotiska celler såsom neuron dock de episomala transgenerna förblir aktiva under flera månader efter elektroporering möjliggör långtidsstudier 13, 15. I vår studie har vi observerat ljusa GFP + celler upp till 7 veckor efter födseln (den senaste tidpunkt vi analyserat) pekar på att embryonal inriktning på kortikala och hippocampus neuronala prekursorer med IUE orsakar bestående uttryck av transgenen från tidiga utvecklingsstadier tidpunkter upp till vuxen ålder.
En ström begränsning av denna teknik är att det är svårt att utöva en exakt kontroll över det totala antalet elektroporerade celler. Emellertid, genom att minska den injicerade volymen av DNA-lösning, har vi visat att det är möjligt att märka ett fåtal celler och att visualisera den dendritiska förgrening av isolerade GFP + celler, såväl som deras ryggar. Dimensionen för den transfekterade området skulle också kunna justeras genom att modifiera parametrarna i elektroporering såsom intensiteten hos strömmen och antalet pulser eller diametern hos de elektroporation paddlar.
Sammantaget IUE är en metod som är enkel att implementera, snabb ocheffektiv för att studera dendriter och ryggar in vivo.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Kathleen Mathers, Dr Jean-Philippe Mocho och Dr Yolanda Saavedra Torres för deras hjälp att utföra i livmodern elektroporation under aseptiska rutiner och Hayley Wood för hennes hjälp för att förbereda ritningar.
EP fick stöd av en långsiktig Federation of European Biochemical Societies (FEBS) gemenskap och en Medical Research Council (MRC) karriärutveckling gemenskap, MAH av Wellcome Trust bidrag till Elizabeth Fisher och Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW med ett EMBO långsiktig gemenskap och RA av en MRC forskarnivå. Detta arbete stöds av ett projektbidrag från Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) och av en Grant-i-Stöd från Medical Research Council (U117570528) till FG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of needles and DNA solution for injection | |||
| Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Fast Green | Sigma | F-7258 | |
| Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl |
| Material for surgery | |||
| Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson Johnson) | W9074 | |
| Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | |
| Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | |
| Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | ||
| Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | |
| Eye gel Viscotears | Novartis | ||
| Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | ||
| Electroporation | |||
| Electroporator | BTX | ECM830 | |
| Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | |
| Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | |
| Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | |
| Tissue processing | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | |
| Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | |
| Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | |
| Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 | |
References
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Castro, D. S. A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets. Genes Dev. 25, 930-945 (2011).
- Pacary, E. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, 1069-1084 (2011).
- Marteau, L. Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon. Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).
- Ramon Moliner, E. Comparative Methods in Neuroanatomy. , Springer. New york. (1970).
- Banks, G. T. Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse. J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. ong-term selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX. Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).
