Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

Published: November 15, 2012 doi: 10.3791/4173
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University

Summary

hemocytes الحشرات تنفيذ العديد من الوظائف الهامة، سواء المناعي وغير المناعة، في جميع مراحل التنمية الحشرات. معرفتنا الحالية للأنواع كرية دموية وظيفة يأتي من الدراسات على نماذج جينية الحشرات. هنا، نقدم طريقة لاستخراج، وقياس تصور hemocytes من اليسروع البرية.

Abstract

hemocytes الحشرات (أي ما يعادل الثدييات خلايا الدم البيضاء) تلعب دورا هاما في العديد من العمليات الفسيولوجية في جميع أنحاء دورة حياة حشرة 1. في مراحل اليرقات من الحشرات تنتمي إلى أوامر من قشريات الجناح (الفراشات والعث) وذوات الجناحين (الذباب الحقيقي)، وتشكل hemocytes من الغدة الليمفاوية (جهاز متخصص المكونة للدم) أو الخلايا الجنينية ويمكن حملها حتى المرحلة الكبار. ويشارك في الهجرة hemocytes الجنينية الخلايا خلال تنظيم وتطوير الكيميائي أثناء الالتهاب. كما تشارك في موت الخلايا المبرمج الخلية وضرورية لمرحلة التطور الجنيني 2. Hemocytes توسط الذراع الخلوية للاستجابة المناعة الفطرية الحشرات التي تضم عدة وظائف، مثل انتشار الخلايا تجميع الخلية، وتشكيل عقيدات، البلعمة والتغليف من الغزاة الأجانب 3. كما أنها مسؤولة عن تدبير محدد الدفاعات الخلطية الحشرات خلال العدوى، مثل العلاقات العامةoduction من الببتيدات المضادة للميكروبات والجزيئات الأخرى المستجيب 4، 5. وقد تم أساسا مورفولوجيا كرية دموية وظيفة درس في نماذج الحشرات وراثية أو فسيولوجية، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 6، 7، الزاعجة المصرية البعوض وأنوفيليس غامبياي 8 و 9 وhornworm التبغ، ماندوكا سيكستا 10 و 11. ومع ذلك، توجد معلومات قليلة حول التنوع حاليا، والتصنيف، ومورفولوجيا وظيفة hemocytes في أنواع الحشرات غير نموذج، وخصوصا تلك التي تم جمعها من البرية ال 12.

نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة لاستخراج hemocytes من اليسروع البرية. ونحن نستخدم ما قبل الأخيرة الطور Lithacodes المتورقة (أصفر الكتف فراشة سبيكة) (الشكل 1) وEuclea delphinii (البلوط شائك سبيكة) اليسروع (قشريات الجناح: Limacodidae) وتبين أن كميات كافية من الدملمف (الدم الحشرات)يمكن أن تكون معزولة وأرقام كرية دموية عد من اليرقات الفردية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة كفاءة أنواع كرية دموية في هذه الأنواع وكذلك في غيرها من اليسروع lepidopteran ذات صلة تحصد من الميدان، أو يمكن أن الجمع بين المقايسات المناعية بسهولة مع مصممة للتحقيق وظيفة كرية دموية بعد العدوى الميكروبية أو الكائنات مع الطفيلي 13.

Protocol

1. تحضير المواد

  1. إعداد الإبر (1-2 و 3-4 ميكرون تلميح تفتق مم) باستخدام أنابيب زجاجية البورسليكات الشعرية ومجتذب micropipette. ضبط الصك: منحدر: 561؛ السرعة: 20؛ الحرارة: 560؛ التأخير: 1؛ سحب: 100؛ الضغط: 500.
  2. إعداد الحل ال: 60٪ من متوسط ​​غريس (GM) تستكمل مع 10٪ من مصل بقري جنيني (FBS) و 20٪ من الاحتياطي تخثر (98 ملي مول هيدروكسيد الصوديوم، 186 مم كلوريد الصوديوم، 1.7 ملي مول EDTA و 41 حمض الستريك ملي، ودرجة الحموضة 4.5 ). ويتم إعداد الحل أعلاه الطازجة تحت ظروف معقمة ويحرص على الجليد في جميع الأوقات.
  3. إعداد الحل عازلة الحضانة: 90٪ من GM تستكمل مع FBS 10٪ من. كما يتم إعداد هذا الحل الطازجة وأبقى على الجليد في جميع الأوقات.
  4. إعداد ما مجموعه لا يقل عن 15 × ميكرولتر عدد من الحشرات لجمع كل من والحلول الحضانة.

2. حقن اليرقات مع الحل كوكتيل

  1. تخدير الإضافية قبل الأخيرةاليرقات من القطران تقشعر لها الأبدان منهم على الجليد لمدة 20 دقيقة قبل استخراج كرية دموية.
  2. تناسب نهاية حادة من إبرة نظيفة الشعرية (عيار 16) إلى أنابيب متصلة حقنة 20 مل زجاج (الشكل 2). ترك الأنبوب الذي يحتوي على حل جمع فتح على مقاعد البدلاء المختبر وملء ببطء مع الشعرية المخزن المؤقت. يتم تعبئة عادة مع حوالي 10-15 الشعرية ميكرولتر من حل جمع، وهذا يتوقف على حجم الدودة (حل ما يقرب من 1 ميكرولتر من 10 ملغ لكل كتلة الجسم الكلي CATERPILLAR = 0.01٪ من مجموع كتلة الجسم). ضع الإبرة على الكرة من الطين التي يتم وضعها بجوار المجهر تشريح.
  3. وضع كاتربيلر في طبق بتري. وينبغي وضع الحشرة على جانبها بحيث spiracles واضحة للعيان (الشكل 3).
  4. أثناء عرض تشريح تحت المجهر، عقد في مكان مع يرقة زوج من ملقط ووضع وثيقة الإبرة إلى واحدة من spiracles، حيث فيبشرة أكثر نعومة الطائفة عموما. اضغط بلطف إبرة الشعرية ضد جسم الحشرة. وبمجرد أن الإبرة قد اخترقت بشرة، وضخ الحجم الكلي للحل في CATERPILLAR (الشكل 3). من المهم تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن في CATERPILLAR. وجسم اليرقة لتنتفخ (على سبيل المثال، زيادة في حجم التداول بنسبة 20٪) بعد الحقن ولكن لا ينبغي أن تنفجر أو طين.
  5. العودة الدودة إلى الجليد، وتحديد المواقع الحشرة ظهريا لمنع العازلة من تسرب للجرح (الشكل 3).
  6. كرر الخطوات من 2،1-2،4 لكل كاتربيلر المستخدمة لاستخراج الدملمف. في هذه المرحلة، السماح لجميع الحشرات لفتور على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل المتابعة.

3. استخراج Hemocytes

  1. وضع كاتربيلر في طبق بتري تحت المجهر تشريح.
  2. جعل الضحلة (2-3 مم) شق في المنطقة الخلفية لCATERPILLAR باستخدام معقم scalpe L (الشكل 3). والحرص على عدم الإضرار الأمعاء أو الأعضاء الداخلية الأخرى، والهدف من ذلك هو ثقب بشرة بعناية وجمع مزيج العازلة / الدملمف تحتوي على hemocytes من الحشرات الفردية.
  3. ضغط على CATERPILLAR بلطف باستخدام ملقط بلاستيكية مرنة في حين جمع المزيج الدملمف (تقريبا 10-20 ميكرولتر) مع نصيحة 10 ميكرولتر ماصة، مع الحرص على عدم مرة أخرى تجرح الأنسجة الداخلية (الشكل 3). يتم جمع الدملمف من قطرات ضغط من جسم اليرقة ل. تجاهل بقايا الدودة ل.
  4. جمع الدملمف من كل CATERPILLAR الفردية في منفصلة المسمى siliconized 0،5 مل أنابيب microcentrifuge.
  5. إضافة حجم مساو من الحل الحضانة (تقريبا 10-20 ميكرولتر) إلى كل عينة تم جمعها من الدملمف CATERPILLAR الفردية. الحفاظ على عينات الدملمف على الجليد في جميع الأوقات.
  6. كرر الخطوات من 3،1-3،5 لكل كاتربيلر المستخدمة في التجربة.
جنيه "> 4. الكمي لHemocytes

  1. خلط العينة الدملمف والحل الحضانة على الفور قبل hemocytes العد. هذا العلاج يسمح لفصل الصحيح من hemocytes ويمنع تراكمها.
  2. استخدام تلميح ماصة نظيفة لنقل 10 ميكرولتر من العينة الدملمف مختلطة مع الحل الحضانة على عدادة الكريات.
  3. باستخدام المجهر المركب، عد وتسجيل عدد من hemocytes في ما لا يقل عن 15 من الساحات الكبيرة (مساحة مربع واحد: 0.04 مم 2، العمق: 0.1 ملم) من الشبكة المركزية للعدادة الكريات (الشكل 3). إضافة هذه القيم للحصول على المجموع الكلي لعدد hemocytes في الساحات 15.
  4. شطف عدادة الكريات وتراجعه غطاء جيدا باستخدام زجاجة غسل بالماء المقطر منزوع الأيونات وجففي ومع Kimwipes (كيمبرلي كلارك) بين كل عينة.
  5. كرر الخطوات من 4،1-4،4 لكل عينة الدملمف.
  6. حساب متوسط ​​عدد hemocytes لكل مل من VOLUM الدملمفه لكل يرقة، على النحو التالي:

الحجم الكلي للكل مربع من الشبكة عدادة الكريات: (0.04 مم 2 منطقة) × (0.1 مم العمق) = 0.004 × 15 مم 3 = 0.06 مم الساحات 3 = الحجم الكلي للجميع الساحات 15 فرزها.

(مجموع العدد الإجمالي للhemocytes في الساحات عد 15 / الحجم الكلي للجميع الساحات عد 15) × 2 = عامل تخفيف عدد hemocytes / مم 3 × 1000 = عدد hemocytes / مل من الدملمف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للجمع وحدة تخزين الحد الأدنى من 10-20 ميكرولتر من الدملمف الحشرات من اليسروع الفردية. Hemocytes جمعها باستخدام هذه الطريقة خالية من التثاقل الخلية، وعيوب التصبغ، والحطام الأنسجة أو غيرها من الملوثات. بالتالي يمكن بسهولة ملاحظة hemocytes وعدها تحت المجهر، ويمكن ملاحظة العديد من الحشرات داخل هوسور قليلة. لاحظنا أن أغلبية hemocytes في عينات لدينا يتألف من plasmatocytes 3 ​​(hemocytes نشر غير متماثلة) (الشكل 4). نحن حاليا تميز الأنواع المختلفة كرية دموية وجدت في هذه اليرقات بالتفصيل (Stoepler وآخرون، بيانات غير منشورة). الطريقة الموضحة هنا يوفر وسيلة سريعة ودقيقة لحساب الأرقام الإجمالية لكرية دموية اليسروع الفردية التي تم جمعها من التجارب الميدانية.

على الرغم من أن الكثافة تختلف اختلافا كبيرا بين كرية دموية وضمن أنواع الحشرات 1 </ سوب>، وجدنا أن الأرقام كرية دموية للL. المتورقة اليسروع مجموعة من 1.10 × 10 6 حتي 8،23 × 10 6 خلية / مل من الدملمف (يعني: 3.51 × 10 6، ن = 31 اليسروع)، وتكون في نطاق القيم ذكرت سابقا في الأنواع الأخرى lepidopteran 14.

الشكل 1
الشكل 1 صورة لالمتورقة قبل الأخيرة Lithacodes الطور (قشريات الجناح: Limacodidae). يرقة. نموذجية طول الجسم من هذه اليرقات يتراوح 10 حتي 15 مم في الطور النهائي قبل الأخيرة ل. الصورة الائتمان: جون T. Lill.

الشكل 2
الشكل 2. حقن إبرة الإعداد. تم توصيل حقنة زجاجية لإبرة الشعرية عبر إبرة حادة نهاية وأنابيب بلاستيكية (لوحات 1-4). يتم استخدام قطعة من الطين البلاستيكية للراحة الإبرة الشعرية (5). يتم وضع كاتربيلر في طبق بتري للحقن مع الحل جمع (6).

الشكل 3
الشكل 3. كرية دموية طريقة الاستخراج. (أ) يتم حقن CATERPILLAR المبردة مع الحل جمع، و (ب) حقن التالية، جسم اليرقة سوف تنتفخ قليلا، ويسمح الحشرة حقنها للراحة على الجليد لمدة 30 دقيقة، (ج، د) يتم إجراء خفض استخدام مشرط نظيفة، وتقلص الدودة باستخدام زوج من ملقط البلاستيك لإجبار الدملمف خارج الجسم من خلال شق، ويتم جمع hemocytes مع ماصة، (ه) يتم عد hemocytes باستخدام عدادة الكريات.

الشكل 4
الشكل 4. بي المجهرcture تظهر hemocytes المستخرجة من delphinii Euclea (قشريات الجناح: Limacodidae) اليسروع (التكبير: 20X).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سبق طرق لاستخراج hemocytes من الحشرات الهامة طبيا والحشرات نموذج lepidopteran ذكرت 9 و 14. يتم تكييفها طرق استخراج كرية دموية وفقا لأنواع الحشرات، والمرحلة التنموية للحشرة ومميزاته المورفولوجية. على سبيل المثال، يمكن عزل اليرقات من الدملمف ماندوكا يقوم بسهولة من قبل القص القرن المنحني قرب نهاية البطن 15. لأن اليسروع سبيكة (Limacodidae) تفتقر هذه البنية في البطن، وقد وضعنا بروتوكولا متميزة لاستخراج الدملمف من اليرقات الصغيرة الحجم التي تم جمعها ميدانيا. هذا الأسلوب يثبت كفاءة لعزل كميات كافية الدملمف التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلايا كرية دموية التي يمكن تخزينها أو معالجتها لمزيد من التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، وجمع البعوض البالغ من كرية دموية تضم في مرحلة تستغرق وقتا طويلا أن ينطوي على إزالة حذرا من الأرجل والأجنحة وغيض من البطن 16

نحن عازمون على الاستفادة من هذا الأسلوب في الدراسات المستقبلية لوصف أنواع الخلايا شكليا كرية دموية من مراحل نمو مختلفة من الغابات المقطوع اليسروع. يمكن هذا الفحص أيضا تقديم الخطوة الأولى الحاسمة لعزل hemocytes صحية لفحص بالتفصيل النواحي الفسيولوجية العديد من الحشرات استجابة المناعة الخلوية، بما في ذلك تأثير مراحل النمو المختلفة والظروف الغذائية على العدد الإجمالي للطاهيةcytes في اليسروع السذاجة أو المصابة تم الحصول عليها من بيئاتها الطبيعية. ونظرا لتعرض المزمن لليرقات lepidopteran لمجموعة من مسببات الأمراض المختلفة في الطبيعة، فضلا عن وجود مستمر من المحتمل المتكافلة على الجراثيم، ومن المتوقع أن هذه الحشرات تمتلك أنواع hemocytes مع خصائص مختلفة مقارنة الخلايا المناعية الموجودة في المختبر التي تغذت على أعلاف الحشرات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخراج كرية دموية هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على دراسات مع مجموعات أخرى من الحشرات، مما يسمح لإدراجها المناعية المرتبطة المقايسات في الدراسات الميدانية البيئية، وبالتالي زيادة فهمنا لآليات الدفاع الخلوية في أنواع الحشرات غير نموذج الزراعية أو البيئية أهمية. في الختام، سوف توفر لدينا طريقة مصدرا قيما للعلماء الأحياء الحشرات، علماء البيئة والمهتمين في فهم التفاعل الوظيفي بين وفرة كرية دموية وقدرة السكان على تحمل الحشرات البرية الميكروبية أو parasitiج العدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد من قبل TMS زمالة الاستئماني هارلان (GWU) خلال هذه الدراسة. تمويل الجمع الميداني وتربية L. المتورقة وE. وقدمت منحة delphinii من قبل NSF DEB 0642438 لJTL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Borosilicate glass tubes Sutter Instruments B100-50-10 OD: 1.0, ID: 0.50 mm
Grace's Medium Sigma G8142
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH3007102 Heat inactivated
Dumont #5 Forceps Fine science tools 11252-40
Neubauer hemocytometer Hausser Scientific 3200
Plastic tubing Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32'
Glass medical syringe Fortuna Optima D-97877 50 ml volume
Blunt end needle Small Parts NE-162PL-25 16 Gauge x 1" length

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
  3. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
  4. Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
  5. Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  6. Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
  7. Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
  8. Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
  9. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
  10. Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
  11. Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
  12. Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
  13. Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
  14. Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
  15. Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
  16. Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 69، التشريح، علم المناعة، علم الأحياء، علم الحيوان، علم الحشرات، المناعة الخلوية، hemocytes، اليسروع البرية، غير نموذج الحشرات، قشريات الجناح،
A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stoepler, T. M., Castillo, J. C.,… More

Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars. J. Vis. Exp. (69), e4173, doi:10.3791/4173 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter