Summary
Hémocytes d'insectes effectuer de nombreuses fonctions importantes, tant immunitaires et non immunitaires, à tous les stades de développement des insectes. Notre connaissance actuelle des types hémocytaires et de la fonction provient d'études sur les insectes des modèles génétiques. Ici, nous présentons une méthode pour l'extraction, la quantification et la visualisation des hémocytes des chenilles sauvages.
Abstract
Hémocytes d'insectes (l'équivalent de mammifères globules blancs) jouent un rôle important dans plusieurs processus physiologiques tout au long du cycle de vie d'un insecte 1. Dans les stades larvaires des insectes appartenant aux ordres des lépidoptères (papillons) et des diptères (mouches vraies), les hémocytes sont formés à partir de la glande lymphatique (un organe spécialisé hématopoïétique) ou des cellules embryonnaires et peuvent être transportés jusqu'au stade adulte. Hémocytes embryonnaires sont impliqués dans la migration cellulaire au cours de règlement sur le développement et la chimiotaxie cours de l'inflammation. Ils participent également à l'apoptose des cellules et sont essentiels pour l'embryogenèse 2. Hémocytes arbitrer le bras cellulaire de la réponse immunitaire innée des insectes qui comprend plusieurs fonctions, telles que l'agrégation cellulaire cellule propagation,, formation de nodules, la phagocytose et l'encapsulation des envahisseurs étrangers 3. Ils sont également responsables de l'orchestration spécifiques insectes défenses humorales cours de l'infection, comme le production de peptides antimicrobiens et d'autres molécules effectrices 4, 5. La morphologie et la fonction hémocytes ont été principalement étudiés dans génétiques ou physiologiques modèles d'insectes, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster 6, 7, les moustiques Aedes aegypti et Anopheles gambiae 8, 9 et le sphinx du tabac, Manduca sexta 10, 11. Cependant, peu d'informations existent actuellement sur la diversité, la classification, la morphologie et la fonction des hémocytes en espèces d'insectes non du modèle, en particulier celles recueillies auprès de 12 sauvage.
Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour extraire les hémocytes des chenilles sauvages. Nous utilisons l'avant-dernier stade Lithacodes fasciola (papillon jaune lingot d'épaules) (figure 1) et Euclea delphinii (aiguillat chêne limace) chenilles (Lepidoptera: Limacodidae) et montrent que des volumes suffisants de l'hémolymphe (sang des insectes)On peut isoler et nombres comptés à partir de larves hémocytaires individu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier efficacement types hémocytaires chez ces espèces, ainsi que dans d'autres chenilles de lépidoptères liées récoltées sur le terrain, ou il peut être facilement combiné avec des dosages immunologiques conçus pour étudier la fonction des hémocytes suite à une infection microbienne ou avec des organismes parasitaires 13.
Protocol
1. Préparation des matériaux
- Préparer aiguilles (1-2 um et pointe conique 3-4 mm) en utilisant des tubes capillaires en verre de borosilicate et un extracteur micropipette. Réglages de l'appareil: rampe: 561; vitesse: 20; chaleur: 560; retard: 1; traction: 100; pression: 500.
- Préparer la solution de collecte: 60% de milieu de Grace (GM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 20% de tampon anticoagulant (98 mM NaOH, 186 mM de NaCl, 1,7 mM EDTA et 41 mM d'acide citrique, pH 4,5 ). La solution ci-dessus est préparée dans des conditions stériles frais et conservés dans la glace en tout temps.
- Préparer la solution tampon d'incubation: 90% de GM supplémenté avec 10% de FBS. Cette solution est également fraîchement préparés et conservés sur la glace en tout temps.
- Préparer un total d'au moins 15 pi x le nombre d'insectes pour la collecte et les solutions d'incubation.
2. L'injection de chenilles avec la solution de Collection
- Anesthésier avant-dernière inslarves de goudron en les refroidissant dans la glace pendant 20 min avant l'extraction hémocytes.
- Adapter l'extrémité émoussée d'une aiguille propre capillaire (16-gauge) dans le tube qui est relié à une seringue 20 ml en verre (figure 2). Laisser le tube contenant la solution de collecte de s'ouvrir sur le banc du laboratoire et remplir lentement le capillaire avec le tampon. Le capillaire est généralement rempli à environ 10-15 ul de solution de collecte, en fonction de la taille de la chenille (environ 1 ul de solution par 10 mg de masse corporelle totale chenille = 0,01% de la masse corporelle totale). Reposer l'aiguille sur une boule d'argile qui est placé à côté de la loupe binoculaire.
- Placez la chenille dans une boîte de Pétri. L'insecte doit être placé sur le côté de sorte que les stigmates sont bien visibles (figure 3).
- Lors de l'affichage sous un microscope à dissection, maintenez la chenille en place avec une paire de pinces et placer la fermeture aiguille à l'un des stigmates, où l'encuticule secte est généralement plus doux. Appuyez doucement sur l'aiguille capillaire contre le corps de l'insecte. Une fois que l'aiguille a pénétré dans la cuticule, injecter le volume total de la solution dans la chenille (figure 3). Il est important d'éviter l'injection de bulles d'air dans la chenille. Le corps de la chenille va gonfler (par exemple, l'augmentation de volume de 20%) suite à l'injection, mais ne doit pas éclater ou suinter.
- Retour à la chenille de la glace, le positionnement de l'insecte dorsalement tampon pour éviter toute fuite de la plaie (Figure 3).
- Répétez les étapes 2.1 à 2.4 pour chaque chenille utilisé pour l'extraction hémolymphe. A ce stade, permettre à tous les insectes pour se détendre sur la glace pendant 30 minutes avant de continuer.
3. Extraction des hémocytes
- Placez la chenille dans une boîte de Pétri sous la loupe binoculaire.
- Faire un peu profonde (2-3 mm de long) incision dans la région postérieure de la chenille en utilisant un scalpe stérile l (figure 3). Prenez soin de ne pas endommager l'intestin ou d'autres organes internes, l'objectif est de percer la cuticule attentivement et de recueillir le mélange tampon / hémolymphe des insectes contenant hémocytes individuels.
- Pressez doucement à l'aide de la chenille souple pinces en plastique tout en recueillant le mélange hémolymphe (environ 10-20 pi) avec une pipette pourboire de 10 ul, encore une fois en prenant soin de ne pas léser les tissus internes (figure 3). Hémolymphe est collectée à partir de la gouttelette pressé à partir du corps de la chenille. Jetez les restes de la chenille.
- Recueillir hémolymphe de chaque individu chenille en différents étiquetés siliconé 0,5 ml microtubes.
- Ajouter un volume égal de la solution d'incubation (environ 10-20 pi) pour chaque échantillon recueilli hémolymphe d'un individu chenille. Conserver les échantillons hémolymphe sur la glace en tout temps.
- Répétez les étapes 3.1 à 3.5 pour chaque chenille utilisé dans l'expérience.
- Mélanger l'échantillon hémolymphe et la solution d'incubation immédiatement avant hémocytes de comptage. Ce traitement permet une séparation adéquate des hémocytes et empêche l'agglutination.
- Utiliser un embout de pipette propre pour transférer 10 ul d'échantillon hémolymphe mélangé avec la solution d'incubation sur un hémocytomètre.
- L'utilisation d'un microscope composé, compter et noter le nombre des hémocytes dans au moins 15 des grands carrés (superficie d'un carré: 0,04 mm 2, profondeur: 0,1 mm) de la grille centrale de l'hémocytomètre (figure 3). Ajouter ces valeurs pour obtenir une somme totale du nombre d'hémocytes dans les cases 15.
- Rincer le hémocytomètre et son toboggan couvert à fond en utilisant une bouteille de lavage avec de l'eau distillée et désionisée et essuyez avec Kimwipes (Kimberly-Clark) entre chaque échantillon.
- Répétez les étapes 04.01 à 04.04 pour chaque échantillon hémolymphe.
- Calculer le nombre moyen d'hémocytes par ml d'hémolymphe volume pour chaque chenille, comme suit:
Le volume total de chaque carré de la grille hémocytomètre: (0,04 mm 2 secteur) × (0,1 mm de profondeur) = 0,004 mm 3 × 15 carrés = 0,06 mm 3 = le volume total de l'ensemble des 15 carrés pris en compte.
(Somme du nombre total des hémocytes dans les 15 carrés pris en compte / le volume total de l'ensemble des 15 carrés pris en compte) x 2 = facteur de dilution du nombre d'hémocytes / mm 3 x 1,000 = le nombre d'hémocytes / ml d'hémolymphe.
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Representative Results
Le protocole décrit ici permet la collecte d'un volume minimum de 10-20 ul d'hémolymphe d'insecte des chenilles individuelles. Hémocytes recueillies à l'aide de cette méthode sont libres d'agglutination cellulaire, défauts mélanisation, débris de tissus ou d'autres contaminants. Par conséquent hémocytes peuvent être facilement observés et comptés sous le microscope, et plusieurs insectes peuvent être observés dans un Hosur quelques-uns. Nous avons observé que la majorité des hémocytes dans nos échantillons étaient composés de plasmatocytes 3 (hémocytes propagation asymétrique) (figure 4). Nous sommes en train de caractériser les différents types hémocytaires trouvés dans ces chenilles en détail (Stoepler et al., Données non publiées). La méthode décrite ici fournit un moyen rapide et précis pour compter le nombre total des hémocytes des chenilles individuelles recueillies sur les expériences de terrain.
Bien que la densité hémocytes peuvent varier considérablement entre et au sein des espèces d'insectes 1 </ Sup>, nous avons constaté que le nombre des hémocytes de L. fasciola chenilles intervalle de 1,10 × 10 6 à 8,23 x 10 6 cellules / ml d'hémolymphe (moyenne: 3,51 × 10 6, n = 31 chenilles), et sont dans l'intervalle de valeurs précédemment rapportées dans d'autres espèces de lépidoptères 14.
Figure 1 Photographie d'un avant-dernier stade fasciola Lithacodes (Lepidoptera: Limacodidae). Chenille. La longueur du corps typique de ces chenilles varie de 10-15 mm en avant-dernière stades ultimes. Crédit photo: John T. Lill.
Figure 2. Configuration aiguille d'injection. Une seringue en verre est relié à une aiguille capillaire par l'intermédiaire d'une aiguille à extrémité émoussée et des tubes en plastique (panneaux 1-4). Un morceau d'argile plastique est utilisé pour reposer l'aiguille capillaire (5). La chenille est placé dans une boîte de Petri pour l'injection de la solution de collecte (6).
Figure 3. Hémocytaire méthode d'extraction. (A) Le réfrigéré chenille est injecté avec la solution de collecte, (b) après l'injection, le corps de la chenille va gonfler légèrement, et l'insecte injecté est laissé au repos sur de la glace pendant 30 min, (c, d) on effectue une découpe à l'aide un scalpel propre, la chenille est comprimé à l'aide d'une paire de pinces en plastique pour forcer l'hémolymphe sur le corps à travers l'incision, et les hémocytes sont recueillies avec une pipette, (e) les hémocytes sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre.
Figure 4. Microscopie picture montrant hémocytes extraits de Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) chenilles (grossissement: 20x).
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Discussion
Méthodes d'extraction hémocytes d'insectes d'importance médicale et les insectes lépidoptères modèle ont déjà été signalés 9, 14. Méthodes d'extraction hémocytaires sont adaptées en fonction des espèces d'insectes, le stade de développement de l'insecte et de ses caractéristiques morphologiques. Par exemple, l'isolement hémolymphe de larves de Manduca peut être facilement réalisée en coupant la corne recourbée près de l'extrémité de l'abdomen 15. Parce que les chenilles limaces (Limacodidae) n'ont pas cette structure abdominale, nous avons développé un protocole distinct pour l'extraction de l'hémolymphe de petite taille chenilles recueillies sur le terrain. Cette méthode s'avère efficace pour isoler des volumes suffisants hémolymphe contenant un grand nombre de cellules hémocytaires qui peuvent être stockés ou traités pour d'autres expérimentations. En outre, la collecte des hémocytes de moustiques adultes comprend une étape fastidieuse qui consiste en l'ablation minutieuse des jambes, des ailes et de l'extrémité de l'abdomen 16
Nous avons l'intention d'utiliser cette méthode dans les études futures de caractériser morphologiquement les types de cellules hémocytaires des différents stades de développement de la forêt récoltés chenilles. Ce test peut également fournir la première étape critique pour isoler les hémocytes sains d'examiner en détail plusieurs aspects physiologiques de la réponse immunitaire cellulaire d'insecte, y compris l'effet des divers stades de développement et des conditions nutritionnelles sur le nombre total d'hémocytes dans chenilles naïfs ou infectés provenant de leur environnement naturel. Compte tenu de l'exposition chronique des larves de lépidoptères à une gamme de différents agents pathogènes dans la nature, ainsi que la présence potentiellement continue de leurs symbiotes microbiens, il est prévu que ces insectes possèdent types d'hémocytes avec des propriétés différentes par rapport aux cellules immunitaires trouvés dans le laboratoire d'élevage insectes. En outre, ce protocole d'extraction hémocytes peut également être appliquée à des études avec d'autres groupes d'insectes, ce qui permet immunologique liés à des dosages doit être intégrée dans les études écologiques sur le terrain, ce qui accroît notre compréhension des mécanismes de défense cellulaire en espèces d'insectes non-agricole ou de modèle écologique importance. En conclusion, notre méthode sera une ressource précieuse pour les biologistes, les écologistes insectes et ceux qui cherchent à comprendre l'interaction fonctionnelle entre l'abondance des hémocytes et la capacité des populations d'insectes sauvages pour résister microbienne ou parasitiinfections c.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
TMS a été pris en charge par la bourse Harlan Trust (GWU) au cours de cette étude. Le financement de collecte sur le terrain et de reproduction L. fasciola et E. delphinii a été fourni par NSF grant DEB 0642438 à JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
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