Summary
hemocytes חרקים למלא תפקידים חשובים רבים, הוא חיסון ושאינם מחוסנים, לאורך כל שלבי התפתחות חרקים. הידע הנוכחי שלנו של הסוגים והתפקוד hemocyte מגיע ממחקרים על מודלים גנטיים של חרקים. כאן, אנו מציגים שיטה לחילוץ, כימות והמחשת hemocytes מזחלים פרא.
Abstract
hemocytes חרקים (שווה ערך לתאי דם לבנים יונקים) משחק תפקיד חשוב בכמה תהליכים פיסיולוגיים לאורך כל מחזור החיים של חרק 1. בשלבי זחל של חרקים השייכים לצווים של פרפרים (עשים ופרפרים) וDiptera (זבובים אמיתיים), hemocytes נוצרים מבלוטת הלימפה (hematopoietic איבר מיוחד) או התאים עובריים ויכולה להתבצע דרך לשלב הבגרות. hemocytes העוברי מעורב בנדידת תאים במהלך התפתחות הרגולציה וchemotaxis במהלך דלקת. הם גם ייקחו חלק באפופטוזיס תא והם חיוניים להתפתחות עוברת 2. Hemocytes לתווך זרוע התאית של תגובת החיסון המולדת חרקים שכוללת מספר פונקציות, כגון תא, צבירה מתפשטת תא, היווצרות של גושים, phagocytosis ואנקפסולציה של פולשים זרים 3. הם גם אחראים לניהול הגנה הומורלית חרקים מסוימות במהלך זיהום, כגון יחסי הציבורoduction מיקרוביאלית של פפטידים ומולקולות אחרות מפעיל 4, 5. המורפולוגיה והתפקוד Hemocyte שנחקרו בעיקר במודלים של חרקים גנטיים או פיסיולוגיים, כוללים זבוב פרות, דרוזופילה melanogaster 6, 7, יתושי Aedes aegypti ואנופלס gambiae 8, 9 והטבק hornworm, Manduca 10 סקסטה, 11. עם זאת, מעט מידע קיים היום על הגיוון, סיווג, מורפולוגיה והתפקוד של hemocytes במינים שאינם מודל חרקים, במיוחד אלה שנאספו מ12 הפרועים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לחילוץ hemocytes מזחלים פרא. אנו משתמשים instar Lithacodes fasciola הלפני האחרון (עש קליע צהוב כתפיים) (איור 1) וEuclea delphinii (קליע אלון קוצני) זחלים (פרפרים: Limacodidae) ומראים כי היקפים מספיקים של hemolymph (דם חרקים)יכול להיות מבודד ומספרי hemocyte נספרו מזחלי פרט. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת ביעילות ללמוד סוגי hemocyte במינים אלה, כמו גם בזחלי lepidopteran נלווים אחרים שנקטפו מהשדה, או שזה יכול להיות בקלות בשילוב עם מבחנים אימונולוגיים שנועדו לחקור את תפקוד hemocyte בעקבות הידבקות בחיידקים או אורגניזמים טפילים 13.
Protocol
1. הכנת חומר
- הכן את המחטים (1-2 קצה מיקרומטר ולהתחדד מ"מ 3-4) באמצעות צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט וחולץ micropipette. הגדרות מכשיר: רמפה: 561; מהירות: 20; חום: 560; עיכוב: 1; משיכה: 100; לחץ: 500.
- הכן את פתרון האוסף: 60% מבינוניים של גרייס (GM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו 20% ממאגר נוגד קרישה (98 mM NaOH, 186 המ"מ NaCI, 1.7 mM EDTA וחומצת לימון 41 מ"מ, pH 4.5 ). הפתרון לעיל מוכן טרי בתנאים סטריליים ושמר על קרח בכל העת.
- הכן את פתרון חיץ דגירה: 90% מGM בתוספת 10% FBS. פתרון זה הוא גם מוכן טרי ושמר על קרח בכל העת.
- הכן כולל של לפחות 15 μl × מספר החרקים עבור שניהם אוסף ואת פתרוני הדגירה.
2. הזרקה של זחלים עם פתרון אוסף
- הרדם תוספות הלפני אחרונותזחלי זפת ידי מצמרר אותם בקרח למשך 20 דקות לפני חילוץ hemocyte.
- התאם את הצד הקהה של מחט נימית נקיה (16-מד) לתוך הצינור שמחובר למזרק זכוכית מ"ל 20 (איור 2). השאר את המבחנה המכילה תמיסת האוסף לפתוח על ספסל המעבדה ולמלא את הנימים לאט עם החיץ. הנימים בדרך כלל מלאות בכ 10-15 μl של פתרון אוסף, בהתאם לגודלו של הזחל (כ 1 פתרון μl ל10 מ"ג של מסת גוף כוללת זחל = 0.01% ממסת גוף הכוללת). הנח את המחט על כדור הטיט הממוקם בסמוך למיקרוסקופ לנתח.
- הנח את הזחל בצלחת פטרי. החרק צריך להיות ממוקם בצד שלה, כך שהם נראים בבירור spiracles (איור 3).
- במהלך ההצגה תחת מיקרוסקופ לנתח, החזק הזחל במקום עם זוג מלקחיים ולמקם את המחט הקרובה לאחד מspiracles, שם בציפורן כת היא בדרך כלל רכה יותר. לחץ בעדינות על מחט הנימים נגד הגוף של החרק. ברגע שהמחט חדרה לציפורן, להזריק נפח הכולל של תמיסה לתוך הזחל (איור 3). חשוב להימנע מלהזריק בועות אוויר לתוך הזחל. גופו של הזחל שיתנפח (למשל, גידול בהיקף של 20%) לאחר הזרקה אבל לא צריך להתפוצץ או לטפטף.
- להחזיר את הזחל לקרח, מיצוב חרקי dorsally חיץ כדי למנוע דליפה מהפצע (איור 3).
- חזור על שלבים 2.1-2.4 לכל זחל משמש להפקת hemolymph. בשלב זה, לאפשר לכל החרקים לצנן על קרח למשך 30 דקות לפני שתמשיך.
3. הפקת Hemocytes
- הנח את הזחל בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתח.
- עושה חתך רדוד (2-3 מ"מ אורך) באזור האחורי של הזחל באמצעות scalpe סטרילי l (איור 3). הקפד שלא לפגוע במעיים או האיברים פנימיים אחרים; המטרה היא לנקב את הציפורן בזהירות ולאסוף את תמהיל החיץ / hemolymph מכיל hemocytes מחרקים בודדים.
- לסחוט את הזחל בעדינות באמצעות מלקחי פלסטיק גמישים תוך איסוף תמהיל hemolymph (כ 10-20 μl) עם קצה פיפטה 10 μl, שוב נזהר שלא לפגוע ברקמות הפנימיות (איור 3). Hemolymph נאסף מהאגל לחץ מגופו של הזחל. השלך שרידים של הזחל.
- איסוף hemolymph מכל זחל פרט ל0.5 צינורות נפרדים שכותרת siliconized מיליליטר microcentrifuge.
- הוסף נפח שווה של פתרון הדגירה (כ 10-20 μl) לכל דגימת hemolymph נאספת מזחל פרט. שמור דגימות hemolymph על קרח בכל העת.
- חזור על שלבים 3.1-3.5 לכל זחל השתמש בניסוי.
- מערבב את מדגם hemolymph ופתרון הדגירה מייד לפני hemocytes ספירה. טיפול זה מאפשר הפרדה נכונה של hemocytes ומונע יצירת גושים.
- השתמש בקצה פיפטה נקי להעביר 10 μl של מדגם hemolymph מעורבב עם פתרון הדגירה על hemocytometer.
- באמצעות מיקרוסקופ מתחם, לספור ולרשום את המספר של hemocytes בלפחות 15 הריבועים הגדולים (שטח של ריבוע אחד: 0.04 מ"מ 2, עומק: 0.1 מ"מ) של הרשת המרכזית של hemocytometer (איור 3). הוסף ערכים אלה לקבל סכום כולל של מספר hemocytes ב15 הריבועים.
- שטוף את hemocytometer ושקופית העטיפה שלו ביסודיות באמצעות בקבוק לשטוף במים מזוקקים וdeionized ולנגב יבש עם Kimwipes (קימברלי קלארק) בין כל דגימה.
- חזור על שלבים 4.1-4.4 לכל דגימת hemolymph.
- חישוב המספר הממוצע של hemocytes למ"ל של hemolymph volumדואר לכל זחל, כדלקמן:
נפח כולל של כל ריבוע של רשת hemocytometer: (0.04 2 אזור מ"מ) × (0.1 מ"מ עומק) = 0.004 3 מ"מ × 15 ריבועים = 0.06 מ"מ 3 = נפח הכולל של כל 15 הריבועים נספרו.
(סכום של המספר הכולל של hemocytes ב15 הריבועים נספרו / הנפח הכולל של כל 15 הריבועים נספרו) x 2 = גורם דילול מספר hemocytes / המ"מ x 3 1000 = מספר hemocytes / המ"ל של hemolymph.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר גביית היקף מינימאלי של 10-20 μl של hemolymph חרקים מזחלים בודדים. Hemocytes שנאסף בשיטה זו היא ללא clumping תא, פגמי melanization, פסולת רקמה או מזהמים אחרים. לכן hemocytes ניתן להבחין בקלות וספר מתחת למיקרוסקופ, וכמה חרקים ניתן להבחין בתוך כמה Hosur. הבחנו כי רוב hemocytes בדגימות שלנו היה מורכב מplasmatocytes 3 (hemocytes מתפשט סימטרי) (איור 4). בימים אלו אנו מאפיינים את הסוגים שונים נמצאו בhemocyte זחלים אלה בפירוט (Stoepler et al., נתונים שלא פורסמו). השיטה המתוארת כאן מספקת אמצעי מהיר ומדויק לספירת מספרי hemocyte כלל לזחלים בודדים שנאספו מניסויי שדה.
למרות צפיפות hemocyte יכולה להשתנות במידה רבה בין ובתוך מיני חרקים 1 </ Sup>, מצא כי מספרי hemocyte לL. fasciola טווח זחלים מ1.10 × 10 6-8.23 × 10 6 תאים / מ"ל של hemolymph (ממוצע: 3.51 × 10 6, n = 31 זחלים), והם נמצאים בטווח ערכים שדווחו בעבר במיני lepidopteran אחרים 14.
איור 1 תצלום של instar Lithacodes fasciola הלפני האחרון (פרפרים: Limacodidae). זחל. אורך גוף אופייני לזחלים אלה נע 10-15 מ"מ בהלפני אחרון לinstars האולטימטיבי. צילום: ג'ון ט ליל.
איור 2. התקנת מחט הזרקה. מזרק זכוכית מחובר למחט נימים באמצעות מחט סוף בוטה וצינורות פלסטיק (לוחות 1-4). פיסת חימר פלסטיק משמשת למנוחת המחט נימית (5). הזחל מונח בצלחת פטרי לזריקה עם פתרון האוסף (6).
איור 3. שיטת החילוץ Hemocyte. () הזחל המצונן מוזרק עם פתרון האוסף; (ב) הזריקה הבאה, גופו של הזחל שתתנפח מעט, והחרק הזריק מותר לנוח על קרח למשך 30 דקות; (ג, ד) חתך הוא עשה שימוש נקי אזמל, הזחל הוא לחץ באמצעות זוג מלקחי פלסטיק לכפות hemolymph אל מחוץ לגוף דרך החתך, וhemocytes נאספים עם פיפטה, (ה) hemocytes נספרים באמצעות hemocytometer.
איור 4. Pi המיקרוסקופיcture מראה hemocytes חולץ מEuclea delphinii (פרפרים: Limacodidae) זחלים (גדלה: 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות לחילוץ hemocytes מחרקים רפואיים חשובים וחרקי מודל lepidopteran העבר דיווח 9, 14. שיטות חילוץ Hemocyte מותאמות על פי מיני חרקים, השלב ההתפתחותי של החרק ותכונות המורפולוגיות שלה. לדוגמה, בידוד hemolymph מזחלי Manduca יכול להתבצע בקלות על ידי חיתוך הקרן המעוקלת סמוך לסוף הבטן 15. בגלל זחלי קליע (Limacodidae) חסרי מבנה בטן זו, פתח פרוטוקול ברור להפקת hemolymph מזחלים קטנים בגודל השדה שנאספו-. שיטה זו מוכיחה יעילה לבידוד כרכי hemolymph מספיקים המכילים מספר רב של תאי hemocyte שניתן לאחסן או מעובד לניסויים נוספים. בנוסף, אוסף hemocyte מבוגר יתושים כולל צעד זמן רב שכרוכים בהסרה הזהירה של רגליים, כנפיים וקצה הבטן 16
בכוונתנו לנצל שיטה זו במחקרים עתידיים מורפולוגית לאפיין סוגי התאים hemocyte משלבי התפתחות שונים של זחלי היער שנקטף. assay זה יכול גם לספק את הצעד הקריטי הראשון לבידוד hemocytes הבריא לבחון בפירוט כמה היבטים פיסיולוגיים של התגובה החיסונית התאית החרקים, לרבות ההשפעה של שלבי התפתחות שונים ובתנאים תזונתיים על המספר הכולל של חמוcytes בזחלים נאיביים או נגועים המתקבלים מסביבתם הטבעית. בהתחשב בחשיפה הכרונית של זחלי lepidopteran למגוון של פתוגנים שונים בטבע, כמו גם הנוכחות הרציפה של הפוטנציאל symbionts מיקרוביאלי שלהם, שצפוי שהחרקים האלה יש סוגים של hemocytes עם מאפיינים שונים בהשוואה לתאי חיסון שנמצאו במעבדה שגדלה חרקים. בנוסף, פרוטוקול החילוץ hemocyte זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים עם קבוצות אחרות של חרקים, המאפשר למבחנים חיסוניים הקשורות לישולבו מחקרי שדה אקולוגיים, ובכך להגביר את ההבנה של מנגנוני הגנה סלולריים במיני חרקים שאינם מודל שלנו חקלאי או אקולוגי חשיבות. לסיכום, השיטה שלנו תספק משאב יקר ערך לביולוגי חרקים, אקולוגים ומעוניינים בהבנת יחסי הגומלין התפקודיים בין שפע hemocyte והיכולת של אוכלוסיות חרקי בר לעמוד חיידקים או parasitiזיהומי ג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
TMS נתמך על ידי מלגת הרלן הנאמנות (GWU) במהלך מחקר זה. מימון לאוסף שדה ורביית L. fasciola וא delphinii סופק על ידי מענק NSF DEB 0642438 לJTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F.
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R.
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
