Summary
बर्फ बाध्यकारी (IBPS) प्रोटीन, एंटीफ्ऱीज़र प्रोटीन के रूप में भी जाना जाता है, बर्फ विकास को बाधित और ऊतकों की cryopreservation में उपयोग के लिए एक आशाजनक additive हैं. मुख्य करने के लिए बैंकिंग कार्मिक चयन संस्थान की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता उपकरण nanoliter osmometer है. हम एक घर डिजाइन ठंडा एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार मंच से विकसित की है और एक कस्टम निर्मित LabVIEW दिनचर्या का उपयोग नियंत्रित. nanoliter osmometer यहाँ वर्णित एक अति संवेदनशील तरीके में नमूना तापमान चालाकी.
Protocol
0. प्रारंभिक प्रक्रियाएं
- कांच समाधान इंजेक्शन के लिए केशिका एक केशिका डांड़ी (Narishige, टोक्यो, जापान) का उपयोग करते हुए, एक गिलास केशिका सूक्ष्म ट्यूब (ब्रांड GMBH, Wertheim, जर्मनी) से ठीक खोलने के साथ एक तेज विंदुक तैयार. खोलने के आकार केशिका के माध्यम से हवा को पारित करने के लिए साफ पानी में ठीक बुदबुदाती प्राप्त द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए. यदि केशिका बंद कर दिया है, तो एक यह अपनी बढ़त को तोड़ने से खोल सकता है. यह दबाव या ट्यूब दीवारों युक्त पानी के खिलाफ इसे धीरे scratching से पूरा किया जा सकता है. केशिका जैसे कि उद्घाटन लगभग अवरुद्ध है, लेकिन पर्याप्त रूप से उप मिलीमीटर बुलबुले के गठन की अनुमति खोलने तैयार करो.
- कॉपर डिस्क सफाई 0.1% माइक्रो-90 साबुन (कोल परमार, Vernon हिल्स, इलिनोइस, संयुक्त राज्य अमेरिका) में 10 मिनट के लिए तांबे Sonicate डिस्क, फिर दोहरा आसुत जल से धो लो. डिस्क एक isopropanol समाधान (तकनीकी) में परिचय और 10 मिनट के लिए फिर से sonicate. पंखसहयोगी, फ़िल्टर्ड हवा का उपयोग डिस्क सूखी. यह सफाई प्रयोगों के बीच आईबीपी प्रदूषण से बचने के महत्वपूर्ण चरण है.
- डबल परत coverglass विधानसभा एक coverglass विधानसभा कवर कांच की सतह पर नमी संघनक बिना नमूना अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए तैयार किया गया था. यह दो coverslips कि फिर एक गर्म गोंद बंदूक के साथ चिपके थे के बीच एक Drierite (WA हैमंड Drierite, Xenia, ओहियो, संयुक्त राज्य अमेरिका) कण (व्यास में 2 मिमी) रखने के द्वारा प्राप्त किया गया था. यह विन्यास संक्षेपण कि दृश्य ब्लॉक जब नमूना कम तापमान ठंडा करने के लिए किया गया था और की जरूरत है हटाया अवलोकन खिड़की पर शुष्क हवा उड़ा सकता रोका.
1. शीतलक स्टेज सेट अप
- 4 मिमी भीतरी व्यास Tygon ट्यूब (सेंट - गोबिन, पेरिस, फ्रांस) जल प्रवाह और ठंडा चरण के इनलेट आउटलेट कनेक्ट है, और एक पानी पंप करने के लिए पानी के प्रवाह इनलेट ट्यूब कनेक्ट.
- ठंडा मंच टी के प्रवेश के लिए एक 4 मिमी भीतरी व्यास Tygon ट्यूब कनेक्टशुष्क हवा देने ओ. हवा एक लाइन में Drierite स्तंभ का उपयोग सूख गया था.
- हवा और पानी पंप चलाना. ध्यान दें कि ठंडा तत्वों एक गर्मी सिंक के बिना नहीं भागना चाहिए.
- तापमान नियंत्रक, कैमरा, और LabVIEW दिनचर्या पर मुड़ें.
2. नमूना तैयार
- एक 7 मिमी व्यास तांबे डिस्क डिस्क के माध्यम से 500 सुक्ष्ममापी drilled छेद होने के पीछे की ओर एक 3-4 विसर्जन तेल बी (Cedar Grove Cargille प्रयोगशालाओं, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका) के μl छोटी बूंद रखें.
- विसर्जन तेल नीचे का सामना करना पड़ पक्ष के साथ ठंडा मंच पर तांबे डिस्क स्थिति.
- एक 0.7 मिमी भीतरी व्यास Tygon 2 मिलीलीटर कांच सिरिंज (Poulten ग्राफ, Wertheim, जर्मनी) के लिए दूसरे छोर पर जुड़ा ट्यूब केशिका ट्यूब (कुंद धार) से कनेक्ट करें.
- केशिका ट्यूब का उपयोग करने से पहले, केशिका के छोटे से खोलने की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि खोलने एक उपयुक्त आकार (प्रारंभिक प्रक्रियाओं देखें).
- धीरे धीरे gla डालने केएस एस तैयार आईबीपी प्रोटीन नमूना ट्यूब (सुक्ष्ममापी 2.4 सांसद 20 मिमी में आईबीपी - GFP CACL 2 और 8 पीएच में 25 मिमी Tris एचसीएल, तैयारी की जानकारी के लिए 10 संदर्भ देखें) में केशिका और ग्लास सिरिंज खींच जब तक केशिका गिलास 0.1 में शामिल प्रोटीन समाधान के μl.
- LabVIEW सॉफ्टवेयर के माध्यम से वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू.
- केशिका गिलास (प्रोटीन समाधान युक्त) की तेज धार एक ठंडा मंच पर तांबे डिस्क में छेद में डालें.
- जबकि माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखने (ओलिंप, टोक्यो, जापान, 10x उद्देश्य), ध्यान गिलास केशिका टिप के साथ विसर्जन तेल परत घुसना, और सिरिंज (बहुत नाजुक) गिलास प्रेस करने के लिए प्रोटीन (~ 10 nl) की एक छोटी राशि वितरित समाधान के लिए एक 200 सुक्ष्ममापी छोटी बूंद बनाने.
- डबल परत coverglass विधानसभा (प्रारंभिक प्रक्रियाएं देखें) साथ ठंडा चरण में छेद कवर.
3. वें गतिविधि मापन
- पूर्वएस एस ठंडा बटन और -40 के लिए तापमान ° सी. सेट
- प्रारंभ में, इस समस्या का समाधान छोटी बूंद स्पष्ट हो जाएगा. कम तापमान पर, आम तौर पर रेंज में -30 डिग्री सेल्सियस -35 डिग्री सेल्सियस, छोटी बूंद परिवर्तन रंग, यह दर्शाता है कि समाधान जम गया है. तुरंत बाद नमूना जमे हुए है, तापमान धीरे धीरे वृद्धि जब तक थोक बर्फ पिघला करने के लिए शुरू होता है. तापमान की क्रमिक वृद्धि लिए तापमान है है कि नमूना की पूरी पिघलने में परिणाम सकता के overshooting से बचने के लिए आवश्यक है.
- एक 50x उद्देश्य के लिए स्विच और तापमान का समायोजन करके बर्फ पिघल शुरू. यह समायोजन इंटरैक्टिव है, और अंतिम चरण आमतौर पर 0.002 डिग्री सेल्सियस कम तापमान कदम का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं पिघला करने के लिए जारी रखें जब तक एक एकल क्रिस्टल बनी हुई है. क्रिस्टल की अंतिम आकार 10 मीटर के आसपास होना चाहिए. उच्चतम तापमान जिस पर पिघलने रह गया है पिघलने बिंदु निर्धारित किया जाता है और बाद में वीडियो विश्लेषण चरण में सही निर्धारित है. <> ली क्रिस्टल के पिघलने बिंदु से नीचे एक डिग्री सेल्सियस के कुछ सैकड़ा तापमान सेट और एक 10 मिनट की देरी के साथ तापमान रैंप शुरू. Ramping दर के रूप में वांछित समायोजित करें. इस समय के दौरान, क्रिस्टल IBPS को उजागर किया जाएगा.
- 10 मिनट जोखिम समय के पूरा होने पर, तापमान LabVIEW दिनचर्या के नियंत्रण के तहत स्वत: कम हो जाएगा.
- तापमान घटने के रूप में क्रिस्टल आकार को ध्यान से देखें. कुछ बिंदु पर, बर्फ क्रिस्टल के अचानक फट देखा जा सकता है. तापमान जिस पर यह तब होता है क्रिस्टल फट तापमान के रूप में विख्यात है.
- वीडियो विश्लेषण का उपयोग करने के लिए सही पिघलने बिंदु और फट तापमान को निर्धारित करने के लिए. सबसे पहले, वीडियो विश्लेषण का उपयोग करके, सही पिघल बिंदु पर लगता है. याद है कि उच्चतम तापमान जिस पर पिघलने रह गया है पिघलने बिंदु निर्धारित किया जाता है. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में इस पिघल बिंदु दस्तावेज़. फिर, सही क्रिस्टल फट तापमान को निर्धारित करने के लिए, और इस मूल्य दस्तावेज़के रूप में अच्छी तरह से. पिघलने बिंदु और हिमांक, या क्रिस्टल फट तापमान के बीच अंतर आईबीपी समाधान के थर्मल हिस्टैरिसीस गतिविधि है.
4. समय निर्भर वें गतिविधि के मापन
- बर्फ की एक एकल क्रिस्टल तैयार 3.1-3.3 धारा में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें.
- क्रिस्टल के गठन के बाद, वांछित के रूप में रैंप की देरी समय निर्धारित करते हैं, और रैंप पर बारी.
- तापमान एक निश्चित दर पर कम (ऑपरेटरों 'की आवश्यकताओं के अनुसार) स्वतः ही एक बार रैंप देरी समय बीत चुका है.
- तापमान दस्तावेज़ जिस पर क्रिस्टल फट होता है. जोखिम समय (क्रिस्टल गठन और क्रिस्टल फट के बीच समय) की गणना.
- विभिन्न देरी बार के लिए प्रयोग दोहराने और जोखिम समय के एक समारोह के रूप में वें गतिविधि साजिश TH गतिविधि के समय निर्भरता का मूल्यांकन.
Representative Results
वें समय निर्भरता का मापन
LabVIEW संचालित nanoliter osmometer सटीक वें गतिविधि माप के प्रदर्शन की सुविधा. लगातार तापमान में कमी के दर वें निर्भरता समय के माप की अनुमति दी. तापमान सटीक नियंत्रण nanoliter osmometer द्वारा सक्षम इन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण था. क्रिस्टल के गठन से समय अवधि (पिघलने की प्रक्रिया के अंत में) के रूप में क्रिस्टल (क्रिस्टल फट) के चारों ओर बर्फ की अचानक वृद्धि जब तक समाधान में बैंकिंग कार्मिक चयन संस्थान के लिए एक बर्फ क्रिस्टल के जोखिम समय में परिभाषित किया गया है. हमने पाया है कि बर्फ क्रिस्टल के जोखिम बैंकिंग कार्मिक चयन संस्थान के लिए समय महत्वपूर्ण वें गतिविधि प्रभावित. आईबीपी जोखिम (एक कुछ सेकंड) के लघु अवधि के सांसद आईबीपी GFP (2.4 सुक्ष्ममापी) समाधान (5 चित्रा) में एक कम वें गतिविधि का उत्पादन किया. TH गतिविधि आईबीपी जोखिम समय के साथ वृद्धि हुई है जब तक यह 4 मिनट आईबीपी जोखिम पर एक पठार तक पहुँच. उच्च सांद्रता में आईबीपी, थालीau कम समय पर पहुँच गया था.
चित्रा 1. योजनाबद्ध आरेख illustrating IBPS बर्फ adsorbed. 10 से अनुमति के साथ अपनाया है.
चित्रा 2 ठंडा मंच. ए) खुर्दबीन पर ट्यूबों के लिए जुड़ा हुआ है. बी) ऊपरी नेतृत्व के बिना. सी) योजनाबद्ध आरेख.
चित्रा 3 LabVIEW इंटरफ़ेस का स्क्रीनशॉट. Clयहाँ ick बड़ा आंकड़ा देखने.
चित्रा 4 तापमान स्थिरता ग्राफ. तापमान नियंत्रक तापमान 0.01 डिग्री सेल्सियस हर 15 सेकंड कम सेट किया गया था.
चित्रा 5 IBPS के लिए बर्फ क्रिस्टल जोखिम समय के एक समारोह के रूप में सांसद आईबीपी वें गतिविधि. हर बार बिंदु 3-6 प्रयोगों की औसत है.
Discussion
यह काम एक कंप्यूटर नियंत्रित nanoliter osmometer है कि असाधारण तापमान नियंत्रण के साथ TH गतिविधि के सटीक मापन के लिए सक्षम बनाता है के आपरेशन को दर्शाता है. किसी भी प्रणाली तापमान के प्रति संवेदनशील, अवांछित तापमान gradients बचा जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत उपकरण में तापमान gradients से बचने के लिए, परीक्षण समाधान छोटी बूंद तांबे डिस्क ठंडा मंच (2.7 कदम) में एक छेद के केंद्र में तैनात किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, एकल क्रिस्टल छोटी बूंद के केंद्र में होना करने के बजाय किनारों के पास (ज्यादातर मामलों में, यह अनायास होगा) चाहिए. समय वर्णित निर्भरता इंगित करता है कि ठंडा दर TH रीडिंग को प्रभावित कर सकते हैं. इस प्रकार, हम समय की एक रिपोर्ट के दौरान जो क्रिस्टल समाधान करने के लिए संपर्क किया गया था ठंडा करने के लिए पहले, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ठंडा दर सहित सुझाव देते हैं. हम आम तौर पर 10 मिनट पहले इंतजार कर रहे थे नीचे 0.01 पर तापमान ramping डिग्री सेल्सियस प्रत्येक 4 सेकंड कदम.
LabVIEW नियंत्रित सहoling चरण एक औंधा माइक्रोस्कोप जो microfluidic उपकरणों thermally चालाकी से किया जा सकता है के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया था. इस प्रणाली के समाधान विनिमय बर्फ क्रिस्टल और IBPS EGFP 9, 10, 16 के साथ टैग शामिल प्रयोगों के प्रदर्शन की सुविधा. LabVIEW नियंत्रित सिस्टम एक नामित आदत डाल बिजली सर्किट के माध्यम से 3040 तापमान नियंत्रक जोड़ने के द्वारा एक Clifton चरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस तरह की एक प्रणाली Davies प्रयोगशाला 17 में संचालित है. LabVIEW सॉफ्टवेयर और नामित आदत डाल Clifton चरण के लिए बिजली के सर्किट डिजाइन अनुरोध पर उपलब्ध हैं.
अंत में, हम एक nanoliter osmometer है कि संवेदनशील नियंत्रण और तापमान के हेरफेर और तापमान में वृद्धि और कमी की दर (° .002 सी संवेदनशीलता के साथ), एक LabVIEW दिनचर्या के माध्यम से वास्तविक समय विश्लेषण के लिए एक वीडियो इंटरफ़ेस के साथ समन्वय की सुविधा का वर्णन. इस प्रणाली प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दर नियंत्रित प्रयोगों कि importan हैं प्रदर्शन कर सकते हैंबर्फ के साथ बातचीत आईबीपी के कैनेटीक्स की जांच करने के लिए टी. इस तरह के प्रयोगों कई लंबी बहस IBPS की कार्रवाई की व्यवस्था के आसपास के मुद्दों को संबोधित कर सकते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध ISF, NSF, और ईआरसी द्वारा समर्थित किया गया. हम रैंडी Milford, माइकल Koren, डौग Shafer, और जेरेमी Dennison से तापमान मंच के साथ तकनीकी मदद को स्वीकार करना चाहते हैं. सॉफ्टवेयर के विकास के साथ सहायता या चेन, Di Xu, राजेश Sannareddy, और सुमित भट्टाचार्य द्वारा प्रदान किया गया. हम हमारे सहयोगियों के प्रोफेसर पीटर एल डेविस और डॉ. लॉरी ए ग्राहम सांसद आईबीपी प्रोटीन और उपयोगी चर्चा के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. हम भी प्रयोगशाला के सदस्यों धन्यवाद डॉ. माया बार - Dolev, Yangzhong किन, डॉ. Yeliz Celik, डॉ. नाताल्या Pertaya, Ortal Mizrahy, और अपने उपयोगकर्ता की प्रतिक्रिया के लिए Shlomit लड़का.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
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