Summary
Um Zygoten zu reinigen
Abstract
Zygoten sind wesentliche Zwischenprodukte zwischen haploiden und diploiden Zustände im Lebenszyklus vieler Organismen, einschließlich Hefe (Abbildung 1) 1. S. cerevisiae Zygoten resultieren aus der Fusion von haploiden Zellen unterschiedlicher Paarungstyp (MATa, MATalpha) und führen zu entsprechenden stabilen Diploide erzeugen, die nacheinander so viele wie 20 diploiden Nachkommen als ein Ergebnis ihrer asymmetrischen auffallend mitotische Teilungen 2. Zygote Bildung wird durch eine komplexe Abfolge von Ereignissen orchestriert: In diesem Prozess binden lösliche Paarungsfaktoren an Rezeptoren verwandt, Auslösung Rezeptor-vermittelten Signalkaskaden, die Unterbrechung des Zellzyklus und gipfeln erleichtern Zell-Zell-Fusion. Zygoten kann als ein Modell für die Vorläufer-oder Stammzellen-Funktion sein.
Obwohl viel über die Bildung von Zygoten gelernt und obwohl Zygoten wurden verwendet, um Zellen molekulare Fragen von allgemeinem signif untersuchenicance fast alle Studien haben den Einsatz der Paarung Mischungen, in denen Zygoten mit einer Mehrheit der Bevölkerung von haploiden Zellen 3-8 vermischt sind. Viele Aspekte der Biochemie der Zygote Bildung und der anhaltenden Lebens der Zygote bleiben daher unerforscht.
Berichte der Reinigung von Hefe Zygoten beschreiben Protokolle auf ihren Sedimentationseigenschaften 9 basiert, aber diese Sedimentation-basierten Verfahren nicht erzielen fast 90% Reinheit in unseren Händen. Darüber hinaus hat es den Nachteil, dass Zellen auf Sorbit hypertonischen freiliegen. Wir haben daher eine vielseitige Reinigungsverfahren entwickelt. Zu diesem Zweck waren Paare von haploiden Zellen, rot oder grün fluoreszierende Proteine coinkubiert um Zygote Formation, zu verschiedenen Zeiten geerntet und die resultierenden Zygoten wurden unter Verwendung eines auf Basis der Durchflusszytometrie Sortier-Protokoll zu ermöglichen. Diese Technik bietet eine bequeme visuelle Beurteilung der Reinheit und Reifung. Die durchschnittliche Reinheitder Fraktion beträgt ca. 90%. Gemäß der Zeitsteuerung der Ernte können Zygoten unterschiedlicher Reifegrade rückgewonnen werden. Die gereinigten Proben bieten eine bequeme Ausgangspunkt für "-schaftlichen" Studien, für die Wiederherstellung der ursprünglichen Nachkommen und für eine systematische Untersuchung dieser Progenitorzellen.
Protocol
Ein. Haploid Cell Growth
- Wachsen S. cerevisiae-Zellen aus dem S288C Hintergrund (BY4741) unter Standardbedingungen 10.
- Transform Haploiden entweder Ausdruck von zwei auffälligen Fluoreszenzmarker 10. Die Markierungen der Wahl sind lösliche GFP im Zytoplasma exprimiert (pEG220, URA3/YIp, linearisiert mit BglII 11) und eine einzige ribosomalen Protein, RPL25 mit mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, aus A. Johnston) fusioniert. Wir erwarten, dass gleich zwei-color Aufreinigungsprotokolle konnte Verwendung anderer hell fluoreszierende Proteine, die von den haploiden parentalen Zellen synthetisiert werden können. Alternativ könnte die Zellwand mit fluoreszierenden Lektine kennzeichnen.
- Am Tag vor Zygote Aufreinigung inokulieren 5 ml Kulturen von jedem Zelltyp und wachsen sie unter Schütteln über Nacht bei 23 ° C bis A600 erreichen höchstens 1,0. Wachsen GFP Transformanten (ATY4442) in kompletten synthetischen Medium mit 2% Glucose (CSM-Glucose) einernd RPL25-mCherry Transformanten (ATY4552) in synthetischer selektiver Medium ohne Uracil 10. Pflegen parallelen Kulturen jedes Zelltyps unter Schütteln bei Raumtemperatur.
2. Die Durchführung einer Kreuz
- Einstellen der optischen Dichte (A600) jeder Probe auf 1,0 in frischem Medium. [1 Optische Dichte Einheit ~ 3 x 10 7 Zellen / ml]
- Mischen gleicher Volumina der beiden Kulturen Wirbel kurzzeitig 3 mal, um eine längere Vortex für 10 sec, gefolgt.
- Bereiten CSM-Glucose-Platten. Die Platten sind identisch mit denen für die routinemäßige Wachstum verwendet und wurden 45 Minuten nach dem Gießen und Erstarren des Agars 10 getrocknet.
- Verteilen so viele wie 20 ml 40-Tröpfchen des Gemisches 1 cm von der Kante der Oberfläche der CSM-Glucose-Platten. Wenn die Tröpfchen werden zunächst auf die Oberfläche aufgetragen startet den Timer zur Messung verstrichenen Zeit. Sobald die Flüssigkeit aufgesogen ist (ca. 30 min), die Platten abdecken und lassen sie ungestört bei room Temperatur.
3. Harvesting Vorbereitungen
- Ernteproben nach 1,75-2,5 h bei 23 ° C durch mehrmaliges Waschen einzelnen getrockneten Tröpfchen von der Platte unter Verwendung von 150 ml kaltem CSM-Glucose, halten die Platten auf Eis. Wiederholt waschen das Tröpfchen Bereich 10-20 mal mit dem gleichen Medium zur Erholung zu maximieren. Sammle in 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis.
- Sonde beschallen die Proben 10x bei 60% Amplitude mit einer Fisher FB120 Ultraschallgerät (120Watt, 120Volt, Freq 20kHz) auf Eis.
- Überprüfen Sie in einem Phasenkontrastmikroskop, dass nur wenige oder gar keine Aggregate bleiben. 15-50% der Zellen erwartet gebildet Zygoten an dieser Stelle haben.
- Verlassen das Rohr von Zellen in einer vertikalen Position ungestört auf Eis für 10 min als weitere Sicherungsmaßnahme (damit Aggregate absetzen).
- Recover den obersten 90% des Volumens und filtern sie durch ein Nylonnetz (BD Falcon Polypropylen Rohr mit Sieb Kappe (Ref 352235)). In einem typischen Experiment, 10 7 Zellenerholte sich von einer Platte waren zu diesem Zeitpunkt in 4 ml CSM-Glucose verdünnt.
4. Durchflusszytometrie
- Sortieren Zellen unter Verwendung des Sony ICYT Reflection Modell Durchflusszytometer, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 mit einer 100 Mikrometer Spitze. Für GFP Anregung, den blauen Argon-Ionen, 250 Milliwatt-Laser bei 488 nm. Für mCherry Erregung, mit der 100 Milliwatt-Laser bei 561 nm. Obwohl wir noch keine Erfahrung mit anderen Maschinen, erwarten wir, dass Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx oder Beckman Coulter MoFlo XDP wäre schön, wenn sie mit den richtigen Laser ausgestattet.
- Basis Sortierparameter an einem vorderen vs zurück Streudiagramm um Tor auf lebensfähigen Zellen. Stellen Sie eine Emission Grundstück von 615 + / - 30 nm Bandpassfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm Bandpassfilter (GFP), um die Ereignisse in vier Quadranten unterteilt, "Rot + Grün-", "Rot + Grün +", "Red- Green-"und" Rot-Grün + "(Abbildung S2). Verwenden nichtfluoreszierenden Zellen als Standard foder Bestimmung der "Red-Green-Quadranten".
- Sortieren von Zellen mit einer Hülle Druck von 21,5 psi, ein Tröpfchen Frequenz von 43.400 Tropfen / sec und einer Probe Druck von 20,5 psi.
- Initial Sort ("Recovery Mode"): Die Proben in ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit 250 ml kaltem CSM-Glucose. Sediment 10 sec bei Höchstgeschwindigkeit in einem gekühlten Mikrofuge (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) und saugen Sie den Flow-Lösung (Durchflusszytometrie Mantel-Lösung (PBS mit 1 mM EDTA) BioSure Katalog Nr. 1027). Resuspendieren in 500 ml kaltem CSM-Glucose.
- Zweitens Sort ("Purity Mode"): Führen Sie die Art wie für die ursprüngliche Art, mit der "Reinheit Modus". Sediment das gereinigte Zellen und Resuspendieren der Pellets in 500 ml 1,0 ml-CSM-Glucose. Schütteln für 15 min in 24-Well-Platten bei 23 ° C, um metabolische Erholung zu ermöglichen.
5. DeltaVision Microscopy
- Bereiten Agarose Pads wie folgt: Bringen Sie eine Suspension von 1,5% Agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) in CSM-Glukose aufkochen, kurz vortexen und wenden dann 0,3 ml Proben des Agarose-Lösung auf die Oberfläche des horizontalen Standard-Glas-Dias und decken Sie sie auf einmal mit einem zweiten Schlitten (ohne Ausüben von Druck).
- Nach dem Abkühlen für 10 min, entfernen Sie vorsichtig die obere Schieber, indem es horizontal, kümmert um eine glatte Oberfläche zu verlassen und nicht auf die Agarose-Schicht zu stören. (Wenn die obere Folie entfernt worden ist, so sollte die Probe von Zellen innerhalb von 1-2 min angewendet werden. Wenn in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur ohne Entfernen der oberen Folie gehalten, Pads für gespeichert werden bis zu einem Tag vor der Verwendung.)
- Sedimentproben und Kaution 1 ml Aliquots des Pellets auf Agarose-Pads (ohne Berührung der Oberfläche). Sofort die Probe mit einem quadratischen Nr. 1 Deckglas. Schneiden Sie überschüssige Agarose mit einer einseitig geschliffenen Rasierklinge. Verschließen Sie die Präparate mit Vaseline aus einer Spritze verzichtet.
- Bild mit Deltavision (Applied Precision) mit einem 100x Ölimmersionsobjektiv ohne Binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve z-Stacks mit dem Softworx 5.0.0 Programm ( http://www.api.com/softworx.asp ) und verarbeiten minimal. Sukzessive z-Ebenen wurden im Allgemeinen bei 0,2-0,4 Mikron Abständen entnommen.
6. Repräsentative Ergebnisse
Fluoreszenzintensität Ebenen in transformierten haploiden Zellen: Die Höhe der Fluoreszenz in den Haploiden ist in Abbildung S1 dargestellt. Bevor das Kreuz, Epifluoreszenz Untersuchung zeigte, dass im Wesentlichen alle GFP Transformanten grün waren und dass alle mCherry Transformanten, obwohl oft schwächer, waren rot. Um sicherzustellen, dass alle Zellen für das Kreuz verwendet tatsächlich um fluoreszierende, nutzten wir die Subpopulation mit dem hellsten Fluoreszenzsignal.
Rendite: Aach der ersten Art, die Rot + Grün + Probe (Abbildung S2) umfasst in der Regel 8-20% des Eingangs Anzahl der Zellen und eine übermäßige Anzahl von haploiden Zellen, vielleicht wegen der anhaltenden Zell-Zell-Adhäsion. Da hohe Anreicherung nicht mit einer einzigen Art erreicht, sollte die teilweise gereinigte Probe sein Sonde resuspendiert und zweimal mit 60% Amplitude durch Umsortieren gefolgt. (Recovery Arten dauern in der Regel zwischen 1-2 Stunden, während die zweite Art benötigt nur 15 min.) Von den Zellen der zweiten Art ausgesetzt, enthalten die Rot + Grün + Proben 23-52% der eingesetzten Zellen.
Phase mikroskopische Untersuchung: Prüfung durch Phasenkontrast-Mikroskopie zeigte, dass die Reinheit des Endproduktes Zygote Vorbereitung ca. 90%, gemittelt über 21 Präparate (von 86% auf 91%). Die Verunreinigungen waren entweder grün oder rot Haploiden, oder Paare von Haploiden, die in Kontakt miteinander sind. Abbildung 3 tabellarisch den Prozentsatz von Zygoten, die habenkeine Knospe, medialen Knospen (Med), seitlichen Knospen (Lat) oder Endknospen (Term), die Anzahl von gepaarten Haploiden der gleichen Farbe ("2Same") oder andere Farbe ("2Hap"), sowie einzelnen Haploiden ( Hap). Wenn die Zellen nach 1,75 h geerntet wurden, wurden mehr als 50% unbudded und die weitere Unterkategorien (mit medialen, lateralen oder Endknospen) waren gleichermaßen vertreten. Nach 2,5 Stunden waren ca. gleiche Anzahlen von Zygoten in jeder der vier Kategorien (unbudded mit medialen, lateralen oder terminalen Knospen).
Mikroskopische Beobachtungen (Abbildung 4):
Die Struktur der Zygoten scheint zu bleiben während der Reinigung unverändert. Nach der Dauer des Kreuzes hatte der Population unterschiedliche Anteile unbudded und geknospten Zygoten, wie oben erläutert. Da sowohl die grünen und roten Haploiden zeigten erhebliche Unterschiede im Fluoreszenzsignal Intensität, waren einige Zygoten überwiegend rot während andere überwiegend grün, wie Comparin beobachtet wirdg die einfarbigen Bilder auf die kombinierten Bilder in 4. Man beachte auch, dass der GFP (MW 26kDa) den Kern eintritt und kann im Kern selbst wenn die Kerne haben nicht fusioniert gefunden werden. Vakuolen stehen als schwarze nicht-fluoreszierenden Kugeln.
Das Endprodukt der Reinigung ergibt eine diverse Population in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Zygoten mit A nicht durchlaufen Fusion. Typ B Zygoten werden unbudded. Typ C haben eine kleine Knospe. Typ D haben eine größere Knospe, und Typ E Zygoten sind dabei Zytokinese unterziehen. Man beachte auch, dass viele der zuvor Zygoten immer noch eine nicht fluoreszierende medialen Teilungslinie (*), und dass die vakuoläre "Vererbung Struktur" (I) 12 kann oft gesehen aus der Zygote in der Knospe zu verlängern. In manchen Fällen hat der grüne Signal in den Partner zu einem viel größeren Ausmaß, dass das Rotsignal umverteilt. Dies spiegelt die Verzögerung der Übertragung charakteristischen Polysomen (Tartakoff, in Vorbereitung) ist.
6 Zygoten, was ausreichend ist für viele Immunoblots unter Verwendung Chemilumineszenznachweis Verfahren. Verwendung von Phenol-Chloroform isoliert Protokollen wir extrahieren etwa 1,5 mg RNA aus dieser Anzahl von Zellen.
Da die gereinigten Zygoten haben gekühlt worden, vor der weiteren Analyse empfiehlt Inkubation bei 23 ° C in Wachstumsmedium.
Abbildung 1. Chronologie der Zygote Bildung. Zygotes als Vermittler zwischen Haploiden und Diploiden. Dieses Diagramm zeigt die klassische Aktivierung (shmooing) der Haploiden, ihre Fusion und die Bildung der ersten Knospe. Knospen kann entweder mediale (M), laterale (L) oder Terminal (T).
Abbildung 3. Sorten von Zygoten in den gereinigten Fraktionen. Mating Mischungen wurden nach 1,75 oder 2,5 h bis Fraktionen in einem relativ frühen vs relativ reifer Zygoten angereichert erholen geerntet. Acht unabhängigen Experimenten, die von den unterschiedlichen Farben bezeichnet, wurden für jeden Zeitpunkt ausgeführt. Die Diagramme zeigen die relative Anzahl von Zygoten, dass have räumlich unterschiedlichen Mustern der Knospenbildung. Angesichts der kurzen Dauer der Inkubationszeit (weniger als 2,5 Stunden bei Raumtemperatur) alle Knospen beobachtet wurden, sind erste zygotischen angehenden Ereignisse.
Abbildung 4. DeltaVision Prüfung angereicherten Fraktionen. Ein typisches wurde von Deltavision Mikroskopie untersucht. Die Abbildungen zeigen entweder beide rot und grün oder einzelne Farben. Die rote entspricht der Polysomen Etikett (Rpl25p-mCherry) und der grün cytosolische GFP. Beachten Sie die hohe Anreicherung von Zygoten, und die benannten subzelluläre Merkmale: die Vakuolen (v), Knospen (b), Kern (n), Vakuole "Vererbung Struktur" (i), und die Partition (*), die die elterliche Trennung scheint Domänen in relativ frühen Zygoten. Ihre variablen Gesamtfarbe spiegelt die relative Intensität der Haploiden, die fusioniert. In Fällen, in denen die beiden elterlichen Domains behalteneine deutliche Farbe war Äquilibrierung der Marker (cytoplasmatische GFP-markierten Polysomen mCherry) unvollständig. Zeitraffer-Studien im Gange zeigen, dass lösliche GFP verteilt vor Polysomen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Ergänzende Legends
Abbildung S1. Fluoreszenz von haploiden Zellen Ganz links:. Zellen, mCherry-markierten Polysomen wurden untersucht, um ein grünes Signal zu erkennen. Das rechteckige Fenster wurde eingestellt, um die negativen Zellen zu vermeiden. Mittlere Kurve: Zellen, die cytosolische GFP analysiert wurden, zeigt die deutlich heller Ballungszentren Positives. Ganz rechts: Zellen, die mCherry-markierten Polysomen wurden analysiert. Das Rechteck (identisch mit der auf dem ganz links) enthält die hellsten Zellen und ermöglicht allenNegative zu vermeiden. Die Bezeichnung "R2" bedeutet den Prozentsatz an Zellen innerhalb des vorgegebenen Rechtecks zurückgewonnen.
Abbildung S2. Zellverteilung in ersten und zweiten Sortierung. Diese zweifarbigen Flächen geben den Anteil der Grün + rot + Zellen in dem oberen rechten Quadranten (R5). Dieser Anteil erhöht sich auf 52% in der zweiten Sorte. Horizontale Achse: grünes Signal. Vertikale Achse: rotes Signal.
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Discussion
Die Verfügbarkeit von gereinigtem Zygoten sollten biochemische Untersuchungen einschließlich Transkriptom, Proteom und Lipidomics sowie Untersuchung der Mechanismen, durch die Zygoten unterziehen Zellzyklus re-entry, Zellwand Umbau, angehende und Vererbung Eigenschaften, etc. Alternativ zu erleichtern, könnte Zygoten die ausgehend werden mit Stämmen, die charakteristische Mutationen in einem oder beiden Elternteilen. Darüber hinaus können die gereinigten Zygoten, wie für haploide oder diploide Zellen, können in Medium, das 15% Glycerol eingefroren und aufgetaut, um später Aspekte der wiederkehrenden Knospung überwachen.
Vorläufige Experimente unter Verwendung anderer geeigneter Fluoreszenzmarker für mikroskopische Zwecke (zB markiert Histone oder mitochondriale Proteine) nicht zuverlässige Wiederherstellung von Zygoten erlaubt, jedoch ist es wahrscheinlich, dass vergleichbare Reinigung erreicht könnte beginnend mit haploiden Zellen, deren Zellwände werden auf rot oder gekoppelt worden grüne Fluorophore. Wir haben es vermieden, such Verfahren seit sie zusätzliche Stress könnte und beeinflussen frühen Stadien der Zygote Bildung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. R. Michael Sramkoski für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie, Dr. Purnima Jaiswal und Dr. Di Wu für frühere Eingang und Ilya Aylyarov Hilfe zu den Illustrationen. Unterstützt durch NIH Grant R01GM089872 und Cytometry & Imaging Microscopy Core Facility des Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
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