Summary
Per purificare zigoti di
Abstract
Zigoti sono intermedi essenziali tra aploidi e diploidi stati del ciclo di vita di molti organismi, tra cui il lievito (Figura 1) 1. S. Saccharomyces zigoti risultato dalla fusione di cellule aploidi di tipo accoppiamento distinte (Mata, MATalpha) e danno luogo a corrispondenti diploidi stabili che successivamente generano ben il 20 progenie diploide a causa delle loro divisioni mitotiche sorprendentemente asimmetrica 2. Formazione dello zigote è orchestrato da una complessa sequenza di eventi: In questo processo, fattori solubili accoppiamento legano a recettori cognate, innescando cascate di segnalazione recettoriali che facilitano interruzione del ciclo cellulare e culminano fusione cellula-cellula. Zigoti può essere considerato un modello per la funzione delle cellule progenitrici o staminali.
Anche se molto si è imparato a conoscere la formazione di zigoti e sebbene zigoti sono stati utilizzati per studiare cellule molecolari questioni di interesse generale signiicance, quasi tutti gli studi hanno fatto uso di miscele di accoppiamento in cui sono mescolati con una popolazione zigoti maggioranza di cellule aploidi 3-8. Molti aspetti della biochimica della formazione dello zigote e la vita continua dello zigote restano pertanto non indagato.
Rapporti di purificazione di zigoti lievito descrivere i protocolli base alle loro proprietà di sedimentazione 9, tuttavia, questa procedura sedimentazione basata non cede quasi il 90% di purezza nelle nostre mani. Inoltre, ha lo svantaggio che le cellule sono esposte a sorbitolo ipertonica. Abbiamo quindi messo a punto un procedimento di purificazione versatile. A questo scopo, coppie di cellule aploidi esprimono proteine fluorescenti verdi o rossi sono stati co-incubate per permettere la formazione zigote, raccolte in tempi diversi, e gli zigoti risultanti sono stati purificati utilizzando un protocollo basato citometria di flusso ordinamento. Questa tecnica fornisce una valutazione conveniente visiva di purezza e di maturazione. La purezza mediadella frazione è circa il 90%. Secondo i tempi di raccolta, zigoti diversi gradi di maturità possono essere recuperati. I campioni purificati forniscono un comodo punto di partenza per "-omiche" studi, per il recupero della progenie iniziale, e per lo studio sistematico di questa cellula progenitrice.
Protocol
1. La crescita delle cellule aploidi
- Grow S. cellule di Saccharomyces dallo sfondo S288C (BY4741) in condizioni standard 10.
- Trasforma aploidi per esprimere uno dei due marcatori fluorescenti cospicui 10. I marcatori di scelta sono GFP solubili espressa nel citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizzato con BglII 11) e una singola proteina ribosomale, RPL25, fuso con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, da A. Johnston). Ci aspettiamo che le equivalenti a due colori protocolli di purificazione potrebbe fare uso di altre proteine fluorescenti brillanti che vengono sintetizzati dalle cellule aploidi parentali. In alternativa, la parete cellulare può essere etichettato con lectine fluorescenti.
- Sulla purificazione giorno precedente zigote, inoculare 5 ml culture di ciascun tipo di cellula e crescere con agitazione per una notte a 23 ° C per raggiungere A600 non superiore a 1,0. Grow trasformanti GFP (ATY4442) in completo terreno sintetico di cui 2% di glucosio (CSM-glucosio) unand RPL25-mCherry trasformanti (ATY4552) in sintetico terreno selettivo privo uracile 10. Mantenere colture parallele di ciascun tipo cellulare con agitazione a temperatura ambiente.
2. Conduzione di una croce
- Regolare la densità ottica (A600) di ciascun campione di 1,0 in terreno fresco. [1 Unità di densità ottica ~ 3 x 10 7 cellule / ml]
- Miscelare volumi uguali di due culture, vortice brevemente 3 volte, seguiti da un vortice più per 10 sec.
- Preparare CSM-glucosio piatti. Le piastre sono identiche a quelle utilizzate per la crescita di routine e sono stati asciugati 45 min dopo la colata e solidificazione del agar 10.
- Distribuire ben 20 40-ml goccioline della miscela 1 centimetro dal bordo della superficie di CSM-glucosio piastre. Quando le goccioline sono dapprima applicato alla superficie avviare il timer per misurare il tempo trascorso. Una volta che il liquido è stato assorbito (circa 30 min), coprire i piatti e lasciarli indisturbati a rootemperatura m.
3. Preparazioni raccolta
- Campioni raccolto dopo 1,75-2,5 hr a 23 ° C lavando ripetutamente singole goccioline secche dalla piastra usando 150 ml di glucosio-CSM freddo, mantenendo le piastre in ghiaccio. Ripetutamente lavare gocciolina 10-20 volte con lo stesso mezzo di massimizzare il recupero. Raccogliere in 15 ml provette Falcon su ghiaccio.
- Sonda ultrasuoni i campioni 10x al 60% di ampiezza con un sonicatore Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) su ghiaccio.
- Verificare in un microscopio fase che aggrega poche o nessuna rimangono. 15-50% delle cellule sono attesi sono formate zigoti a questo punto.
- Lasciare il tubo di cellule in posizione verticale indisturbata in ghiaccio per 10 min quale ulteriore misura precauzionale (per permettere di risolvere aggregati).
- Recuperare il più in alto del 90% del volume e filtrare attraverso una rete di nylon (BD Falcon tubo in polipropilene con tappo filtro (Rif. 352235)). In un esperimento tipico, 10 7 cellulerecuperato da una piastra a questo punto erano diluiti in 4 ml di glucosio-CSM.
4. Citometria a Flusso
- Ordinare le celle utilizzando la riflessione Sony iCyt Citometro modello di flusso, (altamente automatizzata ordine parallela) HAPS1 con una punta di 100 micron. Per eccitazione GFP, utilizzare il blu argon-ion, 250 milliwatt laser a 488 nm. Per eccitazione mCherry, utilizzare i 100 milliwatt laser a 561 nm. Anche se non si ha esperienza con altre macchine, ci aspettiamo che Becton Dickinson FACSAria, Becton Afflusso Dickson o Beckman Coulter MoFlo XDP sarebbe bene se equipaggiato con i laser corretti.
- Base ordinamento parametri su un grafico a dispersione in avanti rispetto indietro per cancello cellule vitali. Stabilire una trama di emissione di 615 + / - 30 nm filtro passa-banda (mCherry) rispetto a 525 + / - 25 nm filtro passa-banda (GFP) per dividere gli eventi in quattro quadranti, "Rosso + Verde-", "Rosso + Verde +", "Red- Green-"e" Rosso-Verde + "(Figura S2). Utilizzare le cellule non fluorescente come f di serieo la determinazione del "Red-Green-" quadrante.
- Celle di ordinamento con una pressione di 21,5 psi guaina, una frequenza gocciolina di 43.400 gocce / sec, e una pressione di 20,5 psi campione.
- In ordine iniziale ("Recovery Mode"): Raccogliere i campioni in provette Eppendorf refrigerati contenenti 250 ml di freddo CSM-glucosio. Sedimenti 10 sec alla massima velocità in una microcentrifuga refrigerata (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) e aspirare la soluzione di flusso (citometria a flusso soluzione guaina (PBS con 1 mM EDTA) BioSure Catalog No. 1027). Risospendere in 500 ml freddo CSM-glucosio.
- Secondo tipo ("Modalità Purezza"): Condurre il tipo come per l'ordinamento iniziale, usando la modalità "purezza" opzione. Sedimenti il purificato le cellule e risospendere il pellet in 500 ml-1.0 ml CSM-glucosio. Agitare per 15 minuti in piastre da 24 pozzetti a 23 ° C per consentire il recupero metabolico.
5. DeltaVision Microscopia
- Preparare pad agarosio come segue: portare una sospensione di 1,5% agarosio (ultrapuraAgarosio, Invitrogen, catalogo # 15.510-07) in CSM-glucosio a ebollizione, brevemente vortice, e quindi applicare campioni 0,3 ml della soluzione di agarosio alla superficie orizzontale vetrini standard e coprirli immediatamente con una seconda slitta (senza applicazione di pressione).
- Dopo raffreddamento per 10 minuti, rimuovere delicatamente la slitta superiore facendolo scorrere orizzontalmente, avendo cura di lasciare una superficie liscia e non disturbare lo strato di agarosio. (Quando la slitta superiore è stato rimosso, il campione di cellule deve essere applicata entro 1-2 min. Quando tenuti in una camera umida a temperatura ambiente senza rimuovere la slitta superiore, tamponi possono essere conservati fino a un giorno prima dell'uso.)
- Campioni di sedimenti e depositi aliquote da 1 ml di pellet su pattini di agarosio (senza toccare la superficie). Immediatamente coprire il campione con un quadrato n ° 1 coprioggetto. Tagliare via l'eccesso di agarosio con un unico taglio lametta. Sigillare le preparazioni con vaselina erogati da una siringa.
- Immagine con Deltavision (Applied Precision) con un obiettivo 100x immersione in olio senza binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve z-stack utilizzando il programma Softworx 5.0.0 ( http://www.api.com/softworx.asp ) ed elaborare minimamente. Successive z-aerei sono stati generalmente raccolti a intervalli di 0,2-0,4 micron.
6. Risultati rappresentativi
Livelli di intensità di fluorescenza in cellule aploidi trasformate: Il livello di fluorescenza nei aploidi è illustrato nella figura S1. Prima del, controinterrogatorio epifluorescente dimostrato che essenzialmente tutte trasformanti GFP erano verdi e che tutti i trasformanti mCherry, anche se spesso debole, erano rossi. Per garantire che tutte le cellule utilizzate per la croce erano effettivamente fluorescente, abbiamo utilizzato la sottopopolazione con la più brillante segnale fluorescente.
Resa: Aopo l'ordinamento iniziale, il Rosso Verde + campione + (figura S2) include in genere 8-20% del numero di ingresso di cellule e un numero eccessivo di cellule aploidi, forse a causa della persistente adesione cellula-cellula. Poiché arricchimento alta non si ottiene con una specie singola, il campione deve essere parzialmente purificato sonda sonicata due volte al 60% dell'ampiezza seguita da re-ordinamento. (Sorta di recupero in genere una durata compresa tra 1-2 ore, mentre il secondo tipo richiede solo 15 min.) Delle cellule sottoposte al secondo tipo, i + Rosso Verde + campioni inclusi 23-52% delle celle di input.
Esame microscopico Fase: Esame al microscopio a contrasto di fase è emerso che la purezza della preparazione zigote finale in media circa il 90% rispetto al 21 Preparazioni (che vanno dal 86% al 91%). I contaminanti erano o aploidi verdi o rossi, o coppie di aploidi che erano in contatto tra loro. Figura 3 cataloga la percentuale di zigoti che hannonessuna gemma, boccioli mediale (Med), germogli laterali (Lat) né boccioli terminali (Term), il numero di aploidi coppie dello stesso colore ("2Same") o colore diverso ("2Hap"), aploidi e come singoli ( HAP). Quando le cellule sono state raccolte dopo 1,75 ore, più del 50% sono stati unbudded e le altre sottocategorie (mediale, con gemme laterali o terminali) erano ugualmente rappresentati. Dopo 2,5 ore ci sono stati numero approssimativamente uguale di zigoti in ciascuna delle quattro categorie (unbudded, con gemme mediale, laterale o terminale).
Osservazioni al microscopio (Figura 4):
La struttura di zigoti sembra rimanere invariato durante la purificazione. In base alla durata della croce, la popolazione ha avuto proporzioni diverse di zigoti unbudded e germogliato, come spiegato sopra. Poiché entrambi i aploidi verde e rosso mostrato notevoli variazioni di intensità del segnale fluorescente, alcuni zigoti erano prevalentemente rosso mentre altri erano prevalentemente verde, come si osserva dalla Comparing le singole immagini a colori alle immagini combinate in Figura 4. Si noti inoltre che la GFP (MW 26kDa) entra nel nucleo e può essere trovato nel nucleo anche quando i nuclei non sono fusi. Vacuoli spiccano come neri non fluorescenti sfere.
Il prodotto finale di purificazione produce una popolazione variegata a vari stadi di sviluppo. Zigoti etichettati Una fusione non hanno subito. Di tipo B sono unbudded zigoti. Tipo C hanno una piccola gemma. Tipo D hanno un bocciolo più grande, e zigoti di tipo E sono in procinto di subire citochinesi. Si noti inoltre che molti dei zigoti precedenti presentano ancora un non fluorescente linea mediana divisione (*), e che la vacuolare "struttura di ereditarietà" (I) 12 può essere spesso visto estendersi dal zigote nella gemma. In alcuni casi, il segnale verde ha ridistribuito nel compagno in misura molto maggiore che il segnale rosso. Questo riflette il ritardo di trasferimento che è caratteristica di polisomi (Tartakoff, in preparazione).
6 zigoti, il che è sufficiente per molte immunoblot, utilizzando procedure rivelazione chemiluminescente. Usando fenolo-cloroformio protocolli di isolamento si estraggono circa 1,5 mg di RNA da questo numero di cellule.
Poiché gli zigoti purificati sono stati refrigerati, prima di ulteriori analisi si consiglia di incubazione a 23 ° C in terreno di crescita.
Figura 1. Cronologia della formazione dello zigote. Zigoti come intermedia tra aploidi e diploidi. Questo diagramma mostra l'attivazione classica (shmooing) di aploidi, la loro fusione, e la formazione della gemma iniziale. Germogli può essere sia mediale (M), laterale (L) o terminale (T).
Figura 3. Varietà di zigoti nelle miscele di accoppiamento purificati frazioni. State raccolte dopo 1,75 o 2,5 ore per recuperare frazioni arricchite in zigoti relativamente precoci vs relativamente più maturo. Otto esperimenti indipendenti, indicati con i colori distinti, sono state eseguite per ciascun punto temporale. I grafici indicano i numeri relativi di zigoti che have spazialmente distinti modelli di formazione di gemme. Data la breve durata dell'incubazione (meno di 2,5 ore a temperatura ambiente) tutte gemme osservati sono eventi iniziali zigotici erba.
Figura 4. Esame DeltaVision di frazioni arricchite. Un tipico campo è stato esaminato al microscopio Deltavision. Le illustrazioni mostrano sia i colori sia rosso e verde o singolo. Il rosso corrisponde all'etichetta polisomale (Rpl25p-mCherry) e il verde GFP citosolico. Nota l'arricchimento elevato di zigoti, e le caratteristiche designate subcellulari: i (v) vacuoli, gemme (b), nucleo (n), "struttura di ereditarietà" vacuolare (i), e la partizione (*) che sembra separare il parentale domini in zigoti relativamente presto. Il loro colore variabile globale riflette l'intensità relativa dei aploidi che fuse. Nei casi in cui i due domini parentali mantengonoun colore diverso, equilibrio dei marcatori (GFP citoplasmatica, mCherry-tagged polisomi) era incompleta. Time-lapse studi in corso mostrano che ridistribuisce GFP solubili prima polisomi. Clicca qui per ingrandire la figura .
Supplementari Legends
Figura S1. Fluorescenza di cellule aploidi a sinistra:. Cellule che esprimono polisomi mCherry-tag sono stati esaminati per rilevare un segnale verde. La finestra rettangolare è stato impostato per evitare le cellule negative. Grafico Oriente: cellule che esprimono GFP citosolico sono stati analizzati, mostrando la popolazione nettamente luminosa principale di positivi. Più a destra: cellule che esprimono polisomi mCherry-tag sono stati analizzati. Il rettangolo (identico a quello all'estrema sinistra) comprende più brillanti cellule e permette tuttinegativi da evitare. Il "R2" designazione indica la percentuale di cellule recuperate nel rettangolo indicato.
Figura S2. Distribuzione cellulare in cernita prima e seconda. Questi due colori grafici indicano la percentuale di verde + rosso + cellule nel quadrante in alto a destra (R5). Questa percentuale sale al 52% del secondo tipo. Asse orizzontale: segnale verde. Asse verticale: segnale rosso.
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Discussion
La disponibilità di zigoti purificati dovrebbe facilitare gli studi biochimici tra cui trascrittomica, proteomica e lipidomica, nonché di indagine dei meccanismi attraverso i quali si sottopongono zigoti ciclo cellulare rientro, rimodellamento della parete cellulare, caratteristiche in erba e l'ereditarietà, ecc In alternativa, zigoti possono essere generati a partire con ceppi caratteristici portatori di mutazioni in uno o entrambi i genitori. Inoltre, gli zigoti purificati, come per cellule aploidi o diploide, possono essere congelati in terreno contenente 15% glicerolo e poi scongelate per monitorare aspetti di erba ricorrente.
Esperimenti preliminari che utilizzano altri marcatori fluorescenti adatti per scopi microscopiche istoni (ad esempio etichetta o proteine mitocondriali) non hanno consentito il recupero affidabile di zigoti, tuttavia, è probabile che la purificazione analoga potrebbe essere realizzato a partire da cellule aploidi cui parete cellulare è stato accoppiato al rosso o fluorofori verdi. Abbiamo evitato sprocedure uch in quanto potrebbero imporre ulteriore stress e colpiscono prime fasi di formazione dello zigote.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. R. Michael Sramkoski per un aiuto con citometria a flusso, il dottor Purnima Jaiswal e il Dr. Di Wu per prima input e Ilya Aylyarov per un aiuto con le illustrazioni. Supportato da NIH Grant R01GM089872 e la Citometria e Microscopia strumento Imaging Core del Comprehensive Cancer Center, causa (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
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