Summary
Noyaux cardiaque sont isolés par sédimentation de densité et immunomarquées avec des anticorps contre matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) d'identifier et de trier les noyaux des cardiomyocytes par cytométrie de flux.
Abstract
Identification des noyaux des cardiomyocytes a été difficile dans des coupes de tissus comme la plupart des stratégies de compter uniquement sur les protéines marqueurs cytoplasmiques 1. Les événements rares dans les myocytes cardiaques tels que la prolifération et l'apoptose nécessite une identification précise des noyaux des myocytes cardiaques pour analyser le renouvellement cellulaire dans l'homéostasie et dans des conditions pathologiques 2. Ici, nous fournissons une méthode pour isoler les noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus par la sédimentation de densité et immunomarquage avec des anticorps contre le matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) et après le tri par cytométrie en flux. Cette stratégie permet une analyse à haut débit et l'isolement avec l'avantage de travailler aussi bien sur les tissus frais et congelés documents d'archives. Cela permet d'étudier des documents déjà recueillis dans des biobanques. Cette technique est applicable et testé dans un large éventail d'espèces et adapté à de multiples applications en aval tels que le carbone-14 datant 3, cellule-cyarticle analyse 4, la visualisation des analogues de la thymidine (BrdU par exemple et les UDI) 4, l'analyse du transcriptome et épigénétiques.
Protocol
1. Isolement des noyaux cardiaque
- Tubes ultracentrifugeuse Coat (Tubes à centrifuger Beckman # 363664) avec 10 ml de solution de revêtement de 1% de BSA / PBS. Reboucher les tubes et les laisser tourner pendant 30 min dans un rotateur tube. Retirer la solution de revêtement et de laisser la centrifugeuse tubes d'air sec (un tube par cœur de la souris est nécessaire pour l'analyse des cœurs de souris, en alternance jusqu'à 5 cœurs de souris ou 1 g de tissu cardiaque d'une espèce différente (par exemple l'homme) peuvent être traitées dans un tube).
- Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées sur la glace. Disséquer le ventricule gauche du cœur de souris frais ou congelés composant logiciel enfichable avec un scalpel. Remarque, ce protocole est optimisé pour le coeur de la souris, mais peut également être adapté pour le rat ou le cœur humain. Vous pouvez également utiliser jusqu'à 1 g de tissu cardiaque d'une espèce différente.
- Couper l'échantillon dans de petites cabines avec un scalpel.
- Transférer les morceaux de tissus dans un tube Falcon de 50 ml remplie avec 15 ml de tampon de lyse.
- Homogénéiser letissu cardiaque avec un T-25 homogénéisateur Ultra-Turrax sonde (IKA) à 24.000 tours par minute pendant 10 sec.
- Diluer l'homogénat avec un volume égal de tampon de lyse à 30 ml.
- Utilisez un verre (40 ml) de continuer à douncer homogénéiser le tissu et sans les noyaux. Effectuer huit coups avec un pilon grand débattement.
- Passez les noyaux brut d'isoler par le biais de 100 um et 70 um en maille de nylon cellule crépine (BD Biosciences), consécutivement.
- Isoler les noyaux brut d'isoler dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) à 700 xg pendant 10 min.
- Eliminer le surnageant soigneusement en inversant les tubes et essuyez l'intérieur du tube avec un papier absorbant. Veillez à ne pas perturber le culot des noyaux.
- Dissoudre les noyaux brut isoler dans 5 ml de tampon de saccharose par la solution de pipetage plusieurs fois de haut en bas. Ajouter un nouveau 25 ml de tampon de saccharose à l'dissous culot.
- Ajouter 10 ml de tampon de saccharose fraîchement préparée à l'enduit tube d'ultracentrifugation (voir l'étape 1.1). </ Li>
- Soigneusement superposer l'ajoute 10 ml de tampon de saccharose, avec les noyaux culot remis en suspension dans un tampon de saccharose dissous de l'étape 1.9.
- Équilibrer les tubes à centrifuger avant de les placer dans un rotor oscillant JS13.1 libre et placer le rotor dans une centrifugeuse à grande vitesse (Beckman Avanti S-25).
- Spin de l'échantillon noyaux à 13.000 xg à 4 ° C pendant 60 min.
- Lorsque la rotation est terminée, enlever les tubes soigneusement du rotor et jeter le surnageant en inversant les tubes et en essuyant le reste des débris de l'intérieur des tubes avec une serviette en papier.
- Dissoudre le culot dans 1 ml de noyaux tampon de stockage des noyaux (NSB, plus de tampon). Remarque: NSB, plus contient 1,5 mM de spermine comme stabilisant l'ADN.
- Passez à l'étape 2.1, immunomarquage des noyaux des cardiomyocytes.
2. Immunocoloration de cytométrie en flux
- Préparer le contrôle négatif pour immunocoloration. Prélever une partie aliquote de 20 sur ul de l'échantillon noyaux et unjj 980 ul de NSB, plus de mémoire tampon.
- Ajouter anti-péricentriolaire matériau 1 anticorps (anticorps de lapin anti-PCM-1, Anticorps Atlas) à l'échantillon des noyaux dans une dilution de 1:500 à immunolabel noyaux des cardiomyocytes. Ajouter l'anticorps d'isotype dans la même dilution que l'anticorps anti-PCM-1 au témoin négatif, préparé à l'étape 2.1.
- Incuber contrôle négatif et le tube échantillon à 4 ° C pendant la nuit.
- Laver l'échantillon témoin négatif et au moins une fois avec NSB, plus de tampon (spin down tubes dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) à 700 xg pendant 10 min. Rejeter le surnageant et dissoudre le culot des noyaux dans 1 ml de NSB, plus de tampon).
- Ajouter anticorps anti-lapin secondaire fluorescent (FITC ou APC) à un contrôle négatif et le tube échantillon dans une dilution de 1:1000.
- Incuber témoin négatif et le tube d'échantillon à 4 ° C pendant 1 h.
- Laver l'échantillon témoin négatif et au moins une fois avec NSB, plus de tampon (spin down tubes dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) à 700 xg pendant 10 min. Rejeter le surnageant et dissoudre le culot des noyaux dans 1 ml de NSB, plus de tampon).
- Procéder à l'analyse par cytométrie en flux et tri.
3. Cytométrie en flux
- Tubes Coat noyaux de collecte (Falcon 15 ml) avec 1% de BSA / PBS solution avant de commencer le tri par cytométrie en flux, comme décrit dans l'étape 1.1.
- Filtrer l'échantillon et le témoin négatif à travers un tamis de cellules um 30 et charger la première témoin négatif à l'cytomètre de flux (Afflux BD). Définir la grille des premier et second à définir les noyaux et les maillots (noyaux unique), sur la base de diffusion vers l'avant (FSC), avant de largeur d'impulsion de dispersion (FS largeur d'impulsion) et dispersion latérale (SSC) (fig. 2a et b). Ajout d'un ADN tache (DRAQ5 (1:500)) à l'échantillon peut aider à identifier la population des noyaux initialement.
- Chargez l'échantillon immunomarquées et de définir la troisième porte d'isoler les noyaux des cardiomyocytes (PCM-1-positve) de non-cardiomyocytes noyaux (PCM-1-négative). Démarrez le tri(Fig. 2c et d).
Facultatif: Dans le but d'analyser la teneur en ADN nucléaire (ploïdie) et d'effectuer une analyse du cycle cellulaire ajouter un ADN approprié tache pour les noyaux (par exemple Hoechst 33342 ou DRAQ5) (Fig. 2e).
- Après le tri par cytométrie en flux, placer les noyaux sur la glace et ré-analyser pour déterminer la pureté de tri (Fig. 3a et b).
- Isoler les noyaux triés dans les tubes de prélèvement à 1500 xg dans une centrifugeuse réfrigérée pendant 15 min.
- Dissoudre l'extrait noyaux dans un tampon compatible avec l'application en aval.
4. Les résultats représentatifs
La morphologie des noyaux et l'intégrité peut être évaluée par des taches d'ADN et visualisés par microscopie (Fig. 1). Succès PCM-1 étiquetage peut être évaluée par microscopie à épifluorescence et par cytométrie en flux (Fig. 1 et Fig. 2c et d). PCM-1-positive et les populations négatives devraient être bien séparés les uns des autres (Fig. 2c et d). Dans ventricule gauche murin environ 30% de tous les noyaux doit être noyaux cardiomyocytes (figure 2d). Tri pureté peut être évaluée par une nouvelle analyse des noyaux triés (Fig. 3a et b). Les deux populations des noyaux doit avoir une pureté supérieure à 95% de tri.
Figure 1. PCM-1 identifie les noyaux des cardiomyocytes. Noyaux cardiaque (a) sont colorées avec des anticorps à PCM-1 (b) et à Nkx2.5 (c) dans un coeur de souris adultes. (D) PCM-1-étiquetés noyaux sont entourés par le cytoplasme des cardiomyocytes (chaîne lourde de myosine (MHC)) et d'exprimer le facteur de transcription Nkx2.5, documenter l'identification exacte des noyaux des cardiomyocytes par PCM-1 coloration (barres d'échelle de 20 um et 10 um (d, en médaillon)). (E) des isolats noyaux cardiaques visualisés avec le colorant ADN DRAQ5. (F et g) Cardiomyocnoyaux YTE sont étiquetés avec des anticorps contre MIC-1 (échelle de barre de 10 um). Remarque, le schéma de coloration epinuclear de PCM-1 dans les noyaux des myocytes dans la section des tissus et dans les noyaux isolés (flèches).
Figure 2. Tri par cytométrie en flux des noyaux des cardiomyocytes. (A) des noyaux cardiaque sont identifiés par diffusion vers l'avant (FSC) et sur le côté de dispersion (SSC). (B) Un deuxième porte identifie noyaux unique par le FSC et FS de largeur d'impulsion 5. (C, d) de déclenchement fluorescent permet la séparation des noyaux des cardiomyocytes (PCM-1-positif) et non-cardiomyocytes (PCM-1-négative) des noyaux de tissu cardiaque. (E) des cardiomyocytes de souris sont pour la plupart (> 80%) diploïde (2n), seul un petit sous-ensemble est tétraploïde (4n) 6. Remarque, les cardiomyocytes humains contiennent une fréquence plus élevée de noyaux polyploïdie (> 2n) 7,8.
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Discussion
L'identification précise des noyaux des cardiomyocytes est crucial pour l'analyse des processus de régénération dans le myocarde 2,3. Les techniques conventionnelles pour isoler les cardiomyocytes des tissus frais sont principalement basées sur la digestion enzymatique des protéines de la matrice extracellulaire et la purification ultérieure à partir de cellules interstitielles par centrifugation à faible vitesse. Une purification supplémentaire des cardiomyocytes vivant à partir de cellules souches embryonnaires (ESC) peut être réalisée par immunomarquage avec des marqueurs de surface tels que SIRPA 9 ou colorants mitochondriales 10, cardiomyocytes fixes peuvent être identifiées par des marqueurs cytoplasmiques tels que chaîne lourde de myosine (MHC) ou des protéines nucléaires telles que GATA4 ou Nkx2.5. Toutefois, l'expression de Nkx2.5 et GATA4 ne se limite pas à cardiomyocytes matures, mais peut aussi être détecté dans les cellules progénitrices au cours du développement et après infarctus du myocarde 11,12. Stratégies génétiques pour identifier les cardiomyocytes montrent la plus grande spécificité, mais cAnnot être appliquée dans les modèles animaux de grande taille ou des êtres humains 1. Les limites des stratégies existantes ont conduit à des conclusions controversées en s'appuyant sur la quantification des événements rares tels que la prolifération, l'apoptose et chimérisme 1,13. Ainsi, il est nécessaire d'établir une stratégie précise pour identifier et purifier maturité noyaux cardiomyocytes différenciés.
Ici, nous décrivons une technique de purification à base de matériau péricentriolaire 1 (PCM-1). Auparavant, nous avons renforcé la validité de notre isolement des noyaux en montrant que trois marqueurs indépendants nucléaires, PCM-1, la troponine T et I, d'identifier de la même population des cardiomyocytes. 2,3 La population purifiée a montré un enrichissement élevé de cardiomyocytes produits géniques spécifiques tels que troponines cardiaques, des protéines chaîne lourde de myosine et le facteur de transcription Nkx2.5 et GATA4 2,3.
Le protocole actuel, basé sur PCM-1, a été appliquée avec succès fou l'analyse du chiffre d'affaires des cardiomyocytes humains et de souris 2,4 ainsi que pour l'analyse du profil transcriptionnel des cardiomyocytes 2. Nous prévoyons que la stratégie présentée peut également être adapté à l'isolement des cardiomyocytes provenant d'autres espèces. PCM-1, une protéine centrosome, ré-localise à la membrane nucléaire où elle s'accumule et forme une matrice insoluble dans des myocytes que dissociés 2,14 (fig. 1). La cytométrie en flux permet l'analyse rapide impartiale d'un nombre élevé de cellules, ce qui est nécessaire pour quantifier les événements rares dans les cardiomyocytes comme l'apoptose et le cycle cellulaire de rentrée 15. En outre, les analogues de nucléotides (par exemple BrdU) à base de tests de prolifération peut être facilement appliquée à l'aide de notre technique présentée 4. Notre technique a l'avantage que le contenu en ADN des noyaux des cardiomyocytes unique (nucléaire ploïdie) peuvent être analysés dans les cardiomyocytes multinucléaires 16,17, ce qui fournit d'importantes informationsfaire la distinction entre les doubles emplois et des cardiomyocytes polyploïdisation 6-8. Toutefois, en raison de la nature de notre stratégie, une caractérisation de multinucléation cardiomyocytes n'est pas possible.
D'autres applications de la méthode présentée sont des études axées sur les changements épigénétiques de la chromatine, nucléoprotéines, les interactions protein-DNA/RNA et sur le nucléaire transcriptome 18,19.
En raison de la stabilité des noyaux dans le gel décongelé les tissus, la stratégie de noyaux présenté isolement peut également être appliquée à des tissus congelés, ce qui rend possible d'utiliser le matériel archivé de biobanques.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Marcelo Toro pour l'aide à la cytométrie en flux. Cette étude a été soutenue par le Suédois coeur et du poumon Fondation, la Commission européenne FP7 "CardioCell", Conseil de recherche suédois, AFA assurances et ALF. OB a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
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