Reparasjon av en kritisk størrelse Calvarial Defect Model Bruke adipose-avledet stromale cellene høstet fra Lipoaspirate

Summary

Denne protokollen beskriver isolering av adipose-avledet stromale celler fra lipoaspirate og etablering av en 4 mm kritisk størrelse calvarial defekt å vurdere skjelett gjenfødelse.

Abstract

Kraniofaciale skjelettet reparasjon og regenerering gir løfte om de novo vev dannelse gjennom en celle-basert tilnærming utnytte stamceller. Adipose-avledet stromale celler (ASCs) har vist seg å være en rik kilde til multipotent stamceller i stand til å gjennomgå osteogen, chondrogenic, adipogenic, og myogenic differensiering. Mange studier har utforsket osteogenisk potensialet av disse cellene in vivo med bruk av ulike stillas biomaterialer for cellulær produksjonstid. Det har blitt vist at ved å benytte en osteoconductive, hydroksyapatitt-belagt poly (melkesyre-ko-glykolsyre) (HA-PLGA) stillaset seeded med ASCs, en kritisk størrelse calvarial defekt, en defekt som er definert av dens manglende evne til å gjennomgå spontane healing over levetiden til dyret, kan være effektivt vise robust osseous gjenfødelse. Dette in vivo modellen demonstrerer grunnlag av translasjonelle tilnærminger mål å regenerere benvevet - cellulærekomponent og biologisk matrise. Denne metoden tjener som en modell for den ultimate klinisk anvendelse av en stamceller mot reparasjon av et bestemt vev defekt.

Protocol

1. Celleisolasjon & Ekspansjon

1. Alle pasientens samtykke og eksperimentelle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 og # 9999).
2. Skaffe menneskelig subkutan adipose tissue fra elektive lipoaspiration prosedyrer under lokal / narkose.
3. Det vil være to lag i lipoaspirate (figur 1A). Supernatanten inneholder det store flertallet av prosessert cellemateriale. Bunnlaget er hovedsakelig injisert saltvann. Adipose-avledet stromale celler kan høstes fra enten lag, men utbyttet er mye større fra supernatanten.
4. Å isolere stromal vaskulær fraksjon (SVF), vaske lipoaspirate mye med like volumer av 1X fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 2,5% Betadine (x2), etterfulgt av likt volum 1X PBS (x1) uten Betadine. Tillate vask å utfelles.
5. Vær forsiktig med å opprettholde sterile technique gjennom hele prosessen som forurensning med bearbeidet menneskelig vev kan skje.
6. Aspirer bunnlaget og kast etter hver vask.
7. Aliquot 15 ml fettvev i 50 ml BD Falcon koniske rør.
8. Fordøye fettvev med et likt volum (15 ml) av filtrert 0,075% Type II kollagenase i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ved 37 ° C i et vannbad i 60 minutter under konstant omrøring (ca. 180 vibrering / min) - ventilere hvert rør hver 15 min.
9. Nøytraliser enzymaktivitet med 15 ml PBS inneholdende 10% (fetalt bovint serum) FBS og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min ved 4 ° C for å oppnå en høy tetthet SVF pellet. Pelleten blir en blanding av adipose-avledet stromaceller og erytrocytter.
10. Kast supernatanten uten å forstyrre pelleten.
11. Resuspender pelleten i 10 ml av tradisjonelle vekstmedier (Dulbeccos modifiserte Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin-løsning).
12. Filter suspensjon Sion gjennom en 100 mikrometer nylon celle sil for å fjerne mobilnettet rusk.
13. Kombiner 3 rør i ett rent 50 ml konisk. Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min ved 4 ° C.
14. Kast supernatanten uten å forstyrre pelleten.
15. Resuspender pelleten i 5 ml av tradisjonelle vekstmedier
16. Kombiner to 50 ml conicals per en 10 cm plate eller fem 50 ml conicals for en 15 cm plate.
17. Etablere primærkulturer natten ved 37 ° C/21% ₂ O, 5% CO _2.
18. Etter inkubering over natten, vask platene omfattende med PBS for å fjerne gjenværende ikke-adherente røde blodlegemer. De resulterende celle populasjoner er adipose-avledet stromale celler.
19. Opprettholde cellene ved sub-confluent nivåer for å hindre spontan differensiering ved 37 ° C/21% ₂ O, 5% CO ₂ i vekstmedier. Cellene generelt må splittes hver tre til fire dager i vanlige vekstmedier når belagt med 50% samløpet.

ve_title "> 2. Stillas Forberedelse

1. Stillaser ble gjort av Dr. Min Lee ved University of California, Los Angeles - School of Dentistry.
2. PLGA stillasene ble fabrikkert fra 85/15 poly (melkesyre-ko-glykolsyre) (iboende viskositet = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) etter oppløsningsmiddel støping og en partikkelformig renseprosess.
3. PLGA / kloroform-løsninger ble blandet med 200-300 um diameter sukrose å skaffe 92% porøsitet (volumfraksjon), og komprimert i tynne ark i en Teflon mold.
4. Etter frysetørking over natten ble stillasene nedsenket i tre endringer av dobbel-destillert (dd) H ₂ O å oppløse sukrose, og forsiktig fjernet fra Teflon plate med en fin-tip spatel.
5. Etter partikkelformet utvasking, ble alle stillasene desinfiseres ved nedsenkning i 50%, 60% og 70% etanol i 30 min hver, etterfulgt av tre skyllinger med DDH ₂ O.
6. Alle stillasene ble tørket under en laminær strømningshette.
7. Etter stillas fabrikasjon, scaffolds ble belagt med apatitt.
   1. SBF (simulert kroppsvæske) oppløsning ble fremstilt med ionekonsentrasjoner som var 5 ganger større enn humant blodplasma. Alle løsninger ble sterilfiltrert gjennom et 0,22 um PES membran (Nalgene). Umiddelbart før belegningsprosessen, tørket PLGA stillasene ble underkastet glødeutladning, argon-plasma etsing (Harrick Scientific) å forbedre fukting og belegg ensartethet.
   2. Etset PLGA stillasene ble deretter inkubert i SBF ved 37 ° C inne i en vann-kappe inkubator i 12 timer, etterfulgt av Mg ^{2 +} og HCO ₃ ^- gratis SBF 2 for en annen 12 timer ved 37 ° C under forsiktig omrøring.
   3. Belagte PLGA stillasene ble skyllet forsiktig med sterilt DDH ₂ O å vaske bort overskytende natriumkloridløsning, tørket i en laminær strømningshette og desinfisert med 70% etanol.
   4. Integritet apatitt belegg ble analysert med en scanning elektronmikroskop (SEM). Apatitt-belagt scaffolds ble montert på SEM stubber (Ted Pella) og belagt med karbon for å bedre ledningsevne. Den sekundære elektron-modus ble brukt under SEM (FEI / Phillips XL-30) observasjon. Spredning av energien røntgenspektrum ble erholdt for å bekrefte elementsammensetning av apatitt strukturer.

3. Cell Seeding

1. Ved å nå sub-Confluence nivåer, vaske cellene med PBS (x2) og trypsinize.
2. Telle celler å kvantifisere for seeding
3. Seed på pre-cut 4,0 mm diameter stillasene med 1,5 x 10 ⁵ celler.
   1. Plass individuell stillaset i en brønn av en 96-brønns plate
   2. Resuspendere cellene i regelmessige vekstmedier med en konsentrasjon på omtrent 1,5 x 10 ⁵ celler per 20 pl av media
   3. Pipet 20 ul direkte på stillaset og fyll i cellekultur inkubator for 30 min.
   4. Etter 30 min tilsettes 200 ul media og tillate celler å inkuberepå stillaset overnatter før operasjonen
   5. Det er ikke nødvendig for å sikre adhesjon av cellene bort på stillaset som kimdannelse et tilstrekkelig antall celler vil sikre at et flertall vil feste på stillaset. Dette har blitt validert i vår lab in vivo med Bioluminescens og histologisk analyse.

4. Opprettelse av Calvarial Defekter og in vivo Implantasjon

1. Anesthetize voksen (60 dager gammel) CD-en nakne mus med bedøvelse cocktail. (Ketamin / xylazin / acepromazin) ved 50% konsentrasjon (1:1 fortynning med 0,9% NaCl) eller per anbefalte anestesiregimet per institusjon protokoller. Disse musene er atymiske så hASCs ikke vil føre til en immunreaksjon.
   1. Dosering: Ketamin hydroklorid (80 mg / kg), xylazin (2,5 mg / kg) acepromazin (2,5 mg / kg)
   2. Varighet av effekt: ca 30 min
2. Kirurgisk drapere dyret og sterilisere den kirurgiskeområde med Betadine og alkohol (x3) og dekke mus øynene med salve før du foretar en midtlinjen sagittal snitt i hodebunnen av dyret for å avdekke høyre parietal benet. Fjerne pericranium fra høyre parietal bein med stump skraping (figur 1B).
3. Lag en ensidig 4-mm full tykkelse feil i at ikke-sutur tilhørende issebeinet ved hjelp av en steril diamantbelagt trephine borekronen. Ekstrem forsiktighet må tas for ikke å forstyrre den underliggende dura mater (figur 1B) som mus calvarial tykkelse er <0,3 mm.
4. Før implantasjon, skyll stillas med sterilt PBS for å hindre overføring av middels deriverte vekstfaktorer.
5. Plasser stillaset inn defekten.
6. Endelig, sutur huden lukket og overvåke dyr per etablerte postoperative protokoller.
7. Bruk etablert analgesi med forskrifter fra dyr omsorg protokoller som trengs postoperativt-eg. buprenorfin 0,1 mg / kg.

5. Kvantifisering av osteoid Formation

1. Etter MicroCT ble utført på mus, var den tredimensjonalt bilde rekonstruert ved hjelp MicroView programvare som tidligere beskrevet ^1.
2. Ved hjelp av Adobe Photoshop, var bildene størrelse med en standard høyde.
3. Bruke Magic Wand funksjonen er pikslane målt av calvarial feil.
4. Prosentvis helbredelse av feilen ble bestemt av etterfølgende CT måle calvarial defekte området og bestemme antall piksler og dele det på den opprinnelige feilen er antall piksler
5. Derfor, hvis MicroCT er utilgjengelig, er et alternativ å bruke Adobe Photoshop og høsting calvaria på bestemte tidspunkter for histologi.
6. Bruke histologiske flekker som Aniline Blue og Pentachrome som betegner osteoid formasjon, bør flere seksjoner langs span av mangelen være farget
7. Ved hjelp av Adobe Photoshop, beskjære ut alle områder som ikke eri calvarial feil
8. Bruk tryllestav funksjonen og bestemme pixel antall de novo beindannelse i området av mangelen og i forhold til kontroller eller andre variabler.

6. Representant Resultater

Fettvev har potensial til å tjene en viktig rolle i generering av stamceller for klinisk anvendelse. Fettvev har en unik fordel ved at det er en lett tilgjengelig tilførsel som kan høstes i en relativt enkel prosedyre som innebærer minimal sykelighet og dødelighet. Når vevet er høstet og oppsamlet, er vårt protokoll skissert i figur 2. Adipose-avledet stromale celler isoleres gjennom en serie av vasketrinnene, kollagenase fordøyelsen og sentrifugering. Når cellene er belagt i kultur, kan de bli utvidet, som er lagt inn i ulike differensiering protokoller in vitro, eller plassert direkte in vivo.

Creation av 4 mm kritisk størrelse calvarial defekt gir en lett tilgjengelig og reproduserbar in vivo modell for å teste osteogenisk differensiering evne av våre adipose-avledet stromale celler. Gjennom bruk av MicroCT, er vi i stand til å følge dannelsen av skjelettet vev in vivo og spore fremdriften i vårt arbeide (figur 3). Den kritiske størrelse calvarial defekten ikke gro innenfor levetiden av dyret og vi ser omtrent 90% av feilen forblir patent rundt 8 uker. Stillaset selv (se omtale) har osteogene induktive egenskaper og har vist evne til å indusere noen benete regenerering. De typiske resultater av stillaset emisjon uten celler viser at omkring en tredjedel av defekten ha de novo beindannelse ved 8 uker. Med styrking av adipose-derivert stromaceller, fullt to tredjedeler eller mer av defekten vise osseous regenerering på rundt 8 uker selv om det er variability mellom hvert dyr og kirurgi. Dannelsen av skjelettet vev kan kvantifiseres gjennom histologi og typiske resultater viser økt osteoid formasjonen i prøver med ASCs gjennom Aniline Blue og Pentachrome flekker (figur 3C). I tillegg, viser vi at de implanterte menneskeceller bidra til underliggende de novo osseous formasjon gjennom bruk av GFP-merket hASCs som viser farging in vivo ved 2 uker i nærheten av området for de novo bendannelse i calvarial defekten (Figur 3D) . I tillegg bruker vi immunohistokjemi med humant spesifikt antistoff for å vise menneskelig celleoverlevelse og bidrag i området av defekten (figur 3E).

Figur 1 A -. Den lipoaspirate har to lag. Det øverste laget inneholder adipocytter og flertallet av processes cellemateriale mens bunnlaget inneholder saltvann brukt under lipoaspiration prosedyren. B - etableringen av calvarial feil gjennom en midtlinjesnitt over pericranium å isolere høyre parietal bein, påfølgende etablering av en 4 mm kritisk størrelse calvarial mangel uten avbrudd av den underliggende dura mater.

Figur 2. Oversikt høsting og anvendelse av lipoaspirate fra isolering av adipose-avledet stromale celler til deres ekspansjon, differensiering og bruk in vitro og in vivo.

Figur 3. A-MicroCT viser in vivo helbredelse av kritisk størrelse calvarial feil med anvendelsen av ASCs gjennom en hydroxyapatitie stillas (nederste rad). Kontroller inkluderer ingen stillas og defekt (Øverste rad) og defekt med plassering av stillaset uten celler (Middle Row) B - Kvantifisering av osseous healing fra MicroCT viser betydelig økt helbredelse i ASC-gruppen. C - Histologi viser økt osteoid dannelsen av ASC-gruppen (nederste rad) gjennom Aniline Blue og Pentachrome flekker. For Aniline Blue, de osteoide flekker mørk blå og for Pentachrome, de osteoide flekker gul. D - hASCS merket med GFP ble utsådd på et stillas og plassert i en calvarial defekt og avlivet etter 2 uker. Fargingen ble gjort med en GFP merket antistoff for å vise de humane celler som bidrar til regenerering i området av defekten. E -. Menneskelig kjernefysisk antigen immunhistokjemi viser utbredelsen av humane celler i området av defekt på 2 uker for å vise større figur .

Discussion

Siden isoleringen av adipose-avledet stromaceller ² fra lipoaspirate, har disse cellene blitt differensiert i et bredt utvalg av cellulære linjene. Fettvev er fra mesodermal opprinnelse, og derfor vil multipotent adipose-derived stromaceller trolig være mest effektive med søknaden mot en mesodermal avstamning. Evnen til å generere skjelett vev er spesielt kritisk gitt mangel på donorflater for en autograft og de ​​iboende begrensningene ved syntetisk materiale, inkludert infeksjon, avvisning, og sammenbrudd over tid ^tre. Adipose-avledede stromaceller tilby en potensiell autogent multipotent cellelinje med et relativt stort utbytte ⁴ per kirurgisk innhøsting.

Under behandlingen av stromale vaskulær fraksjonen og adipocyttdifferensiering vev, er det viktig å opprettholde utmerket steril teknikk. Det er en stor risiko for forurensning av den primære kultur gitt hoveddelen natur lipoaspirate kombinert med flere trinn i vask, fordøyelsen, og sentrifugering med skritt utenfor det sterile cellekultur hette. Når pelleten er belagt på fatet, vil de fleste av de synlige celler være eyrthrocytes. Disse kan vaskes av med steril PBS når adipose-avledet stromaceller har levd opp til platen eller røde blodceller lyseringsbuffer kan legges til. Det er viktig at cellene er forholdsvis konfluent på innledende plating trinnet for å sikre riktig vekst og differensiering.

Det er ingen enighet om hvordan du nøyaktig definere adipose-derived stromale celler. Mens det har vært studier prøver å definere disse populasjon av celler basert på celleoverflaten markører gjennom flowcytometri, har finne et definert sett eller markører vært vanskelig. Dette skyldes sannsynligvis variasjon i pasientgruppen og den fenotypiske drift at disse cellene erfaring in vitro under forskjellige cellekulturer miljøer og variasjon i passalvie tall. International Society for Cellular Therapy opplyst at han på minimum, må en mesenchymale stamceller har visse egenskaper, inkludert uttrykk for CD105, CD90, CD73, mens mangler CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, og HLA-DR ^5. Den opprinnelige definisjonen av multi-potente natur av disse cellene kom fra deres evne til å differensiere i celler mesodermal linjene i vitro og disse protokollene er lett tilgjengelig.

Den kritiske størrelse calvarial defekt modellen har blitt validert som modell for å studere skjelettet regenerering bruke både murine adipose-derived stromaceller ⁶ og human-avledet adipose-derived stromale celler ^en. Opprettelsen av en 4 mm feil i høyre parietal calvaria av en mus ikke vil gro i livet av dyret. Derfor er noen helbredende sett skyldes behandling plasseres innenfor calvarial defekten. Under den kirurgiske prosessen, er det spesielt viktig å ikke injure den underliggende dura mater. Dura mater seg selv kan stimulere Osteogenesis og eventuelle skader i betydelig grad kan hemme helbredelsesprosessen til calvarial feil ^7.

Bruken f stillaset som en levering mekanisme for stamceller er spesielt viktig i en verden av skjelettet engineering. Funksjonen av skjelettmateriale vev er unikt knyttet til den tredimensjonale strukturen av makro-miljøet. Riktig stillaset kan ikke bare hjelpe til stamcelleforskningen produksjonstid in vivo, men også øke Osteogenesis gjennom de forbedrede osteogene egenskapene stillaset selv. Vårt laboratorium inkorporerer hydroksyapatitt, en kalsium-derivat, på PLGA ryggraden grunnet osteoinduktiv og osteoconductive egenskapene til dette materialet. Men det er mange andre alternativer for stillaset etableringen som kan ha sterke osteoinduktivt og osteoconductive egenskaper ^{8, 9.} I tillegg, kan stillaset også brukes til å levere kraftige adjuvanser slikesom små molekyler ^{10, 11} og vektorer for å slå ned eller upregulate genet mål ^{12, 13.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipoaspirate Harvest
PBS	Gibco	10010-023
Hank's Balanced Salt Solution	Cellgro	21-023-CV
Collagenase	Sigma	C6885-500MG
Cell Strainer 100 μm	BD Falcon	352360
Steri-top 500 ml .22 μm filter	Millipore	SCGPT05RE
Calvarial Defect
Z500 Brushless MicromotorsUM50C	NSK	NSKZ500
Circular Knife 4.0 mm	Xemax Surgical	CK40