Summary
De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.
Abstract
Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) is een van de belangrijkste oorzaken van hartfalen bij jongere volwassenen 1. Hoewel genetische aanleg en blootstelling aan toxische stoffen bekende oorzaken van deze ziekte bij ongeveer eenderde van de patiënten, de oorsprong van DCM grotendeels onduidelijk. In een groot aantal van deze patiënten hebben autoantilichamen tegen cardiale epitopen gedetecteerd en wordt vermoed een centrale rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van de ziekte 2,3. Het belang van cardiale autoantilichamen wordt onderstreept door een hemodynamische verbetering waargenomen met DCM patiënten na verwijdering van auto-antistoffen door immunoadsorptie 3-5. Een verscheidenheid van specifieke antigenen zijn reeds geïdentificeerd 2,3 en antilichamen tegen deze targets worden gedetecteerd door immunoassays. Maar deze assays geen onderscheid maken tussen stimuleren (en dus functioneel effectief) en blokkeren autoantilichamen. Er steeds evidence dat dit onderscheid is cruciaal 6,7. Ook kan worden uitgegaan dat de targets voor een aantal cardiotropic antilichamen nog niet geïdentificeerd zijn en dus niet worden gedetecteerd door immunoassays. Daarom hebben we een methode voor de detectie van antilichamen functioneel actief cardiotropic, onafhankelijk van hun antigen. De achtergrond van de werkwijze is de hoge homologie meestal waargenomen voor functionele regio van cardiale eiwitten in zoogdieren tussen 8,9. Dit suggereert dat cardiale antilichamen gericht tegen humane antigenen zullen kruisreageren met niet-menselijke doelwitcellen die testen van IgG kunnen uit DCM patiënten volwassen cardiomyocyten van de rat. De methode bestaat uit drie stappen: eerst IgG geïsoleerd uit patiënten met plasma sepharose gekoppelde anti-IgG antilichamen verkregen uit immunoadsorptie kolom (PlasmaSelect, Teterow, Duitsland). Tweede volwassen hartspiercellen worden geïsoleerd door collagenase perfusie in een Langendorff perfusie inrichting met apROTOCOL gewijzigd ten opzichte van eerdere werken 10,11. De verkregen hartspiercellen zijn aan laminine beklede chambered coverglasses en gekleurd met Fura-2, een calcium-selectieve fluorescerende kleurstof die gemakkelijk kunnen worden gebracht in de cel om intracellulaire calcium nemen (Ca 2 +) inhoud 12. In de laatste stap, het effect van IgG patiënt op de cel verkorten en Ca 2 + transiënten van gebied gestimuleerde cardiomyocyten wordt online gevolgd met een commerciële myocyte calcium en contractiliteit controlesysteem (IonOptix, Milton, MA, USA) aan een standaard inverse fluorescent microscoop.
Protocol
1. IgG Isolatie uit monsters van patiënten
- Bereid mini-immunoadsorptie kolommen door het invullen van 3 ml anti-IgG sepharose per 2 ml patiënt EDTA plasma in een lege Econo Pac kolom. IgG isolatie vereist ten minste 2 ml van de patiënt plasma.
- Plaats een filter bovenop de anti-IgG sepharose, opengesneden het laagste punt van de kolom en druk het een debiet van ongeveer 1 druppel / sec bereiken. Laat de preservatievloeistof opraken van de kolom.
- Was de kolom met 3 volumes 0,9% NaCl per volume plasma.
- Pipetteer de plasma op de kolom. Wanneer het plasma volledig is ondergedompeld in de anti-IgG sepharose, wassen met hetzelfde volume 0.9% NaCl.
- Pipetteer een plasmavolume van 0,2 M glycine HCl, pH 2,8 op de kolom en laat onderdompelen in de sepharose. Voeg een volume van glycine HCl op de kolom. Verzamel de stroming door in een 15 ml buis en breng de pH op 7,3 met 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
- Om de kolom te regenereren, Wassen met 3 plasma volumes glycine HCl. Na een laatste wassing met 2 volumes 0,9% NaCl, kan de kolom worden gebruikt voor de volgende plasmamonster. Als alternatief kan de kolom worden gevuld met preservatievloeistof en bij 4 - 8 ° C tot 4 weken.
- Voor gebruik op cardiomyocyten, de verzameld IgG fractie wordt gedialyseerd tegen experimentele buffer (EB). Voor de bereiding van EB, voeg 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM KH 2PO 4, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES en 20 mM glucose tot 1 L gedistilleerd water op een magnetische roerder en de pH tot 7.3.
- Vul de IgG fractie naar een cellulose ester dialysemembraan buis met een molecuulgewicht cut off van 100 kDa. Plaats de buis in 1 L EB en roer langzaam met een magnetische roerder bij 4 ° C. Na 8 uur en spoel de dialysebuis in 3 L verse EB en dialyseer nog 20 uur bij 4 ° C.
- Na dialyse Verwarm het monster gedurende 30 minuten bij 57 ° C in een waterbad tot inactivate aanvulling factoren. Bepaal totale IgG-concentratie en de voorbereiding van monsters met 330 mg IgG per stuk. Bij het toevoegen van het monster voor de meting cardiomyocyten (stap 4.3), vul de aliquots van 1 ml met EB. Onverdunde aliquots kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.
2. Isolatie van cardiomyocyten van de rat
- Voor de bereiding van Ca2 +-vrije buffer isolatie (IB), voeg 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 20 mM HEPES en 11 mM glucose tot 1 L gedestilleerd water met een magnetische roerder. Breng de pH op 7,4 op kamertemperatuur en filtreer door een 0,2 um flesje bovenste filter voor sterilisatie.
- Vul 80 ml IB in het bovenste reservoir van een thermostaat Langendorff perfusiesysteem. Pas thermostaatinstellingen een buffer van 37 ° C behouden en beluchten buffer met 95% O2 / 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Weeg ongeveer 10.000 - 12.000 U van collagenase type II, 175 mg BSA vrije vetzuren en opgelost in 20 ml IB bevattende 22,5 ul van een 100 mM CaCl2 voorraadoplossing. Controleer de pH van de isolatie buffer in het bovenste reservoir en pas indien nodig.
- Verdoven een Wistar rat van 175 - 200 g met 375 ug / kg lichaamsgewicht thiopental. Voeg 2500 IU heparine thiopental oplossing. Na thoracotomie, accijnzen het hart voorzichtig met een intacte aortaboog en breng deze over in ijskoud 0,9% NaCl. Reinig het hart van bloed en het omringende weefsel en overdracht naar vers 0,9% NaCl. Bloot de aorta, opent de stroming van het verloopstuk Langendorff systeem een dalende snelheid 2-3/sec verkrijgen en het hart hechten aan de canule.
- Perfuseren het hart tot 3 minuten met een stroomsnelheid van 1 druppel / sec te wassen resterende bloed. Start om het IB in het Langendorff systeem circuleren. Verwijder 20 ml buffer van de bovenste reservoir, vul de collagenase oplossing en vul zo veel buffer als nodig is om 80 ml te bereiken. Circulate de c ollagenase oplossing voor 27 min. Debiet moet periodiek worden gecontroleerd en gehandhaafd op 1 druppel / sec met behulp van de flow reducer.
- Maak het hart van de canule, vrij van atria en de aorta en hak ze in kleine stukjes. Laat de collagenase oplossing te lopen in het onderste reservoir, het volume maximaal 40 ml en na de gehakte ventrikels verteren gedurende 10 - 15 min onder continue beluchting met 95% O2 / 5% CO 2. Daarna filter de celsuspensie door een 200 pm maaswijdte gaas in een 50 ml buis.
- Herstel de Ca 2 + inhoud van de cellen in 3 stappen: centrifugeer de celsuspensie bij 43 x g 2 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer cellen in 10 ml IB met 200 pM CaCl2. Centrifugeer opnieuw cellen en resuspendeer in 10 ml IB met 500 pM CaCl2. Na een laatste centrifugatie cardiomyocyten in steriel gefiltreerd EB (zie 1.8) mengen tot een dichtheid van 50.000 cellen / ml.
- Coat een 4 goed chambered dekglaasje met 10 ug laminine per putje en wacht tot deze volledig is gedroogd.
- Vul 1 ml van de cardiomyocyt suspensie in elk putje met behulp van een micropipet met een cut tip. Laat de cellen hechten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun 10 ul van 1 mg / ml Fura-2 AM voorraadoplossing in 5 ml EB. Houd de kleuroplossing in het donker.
- Opstijgen buffer en ongebonden cellen van het dekglaasje en pipet 0,5 ml van de kleuroplossing in elk putje. Incubeer de cellen gedurende 10 min onder matig schudden. Vervolgens neemt u de kleuroplossing, een keer wassen cellen met 1 ml EB en uiteindelijk 0,5 ml EB te vullen in elk putje. Vermijd direct licht tijdens het beitsen en altijd de gekleurde cellen te houden in het donker.
4. Opname van Cell Verkorting en Ca 2 + Transients
- Plaats de chambered dekglaasje op een inverse fluorescentie microscope verbonden met een myocyte calcium en contractiliteit opnamesysteem. Plaats een op maat gemaakte elektrode met een-en uitstroom buis in het eerste putje. Superfuse cardiomyocyten met 1 ml / min EB en start de elektrische stimulatie (20 V, 1 Hz, 5 msec duur). Laat de cellen zich aanpassen aan de stimulering ongeveer 2 minuten.
- Kies een intacte staafvormige cardiomyocyten met duidelijke strepen en constante contractie. Plaats de cel in het midden van het gezichtsveld van de camera en open kanaal. Horizontaal Oriënteer de cel binnen het video-oppervlak door het draaien van de cel framing adapter en het verplaatsen van de microscoop podium.
- Stel de randen te detecteren bedieningselementen van de video gebied (figuur 2), opent u de fluorescerende kanaal en opnemen 10 tot 15 contracties om de eerste cel verkorten en Ca 2 + van voorbijgaande aard te verkrijgen.
- Sluit de microscoop licht kanaal om te voorkomen dat het bleken van de fluorescentie vlek. Schakel de stroom door van EB tot het monsterbypass met een 3-weg klep en superfuse cardiomyocyten met 1 ml van de patiënt IgG. Stop de pomp net voor lucht de put bereikt.
- Open het licht kanaal en opnemen van een 10 tot 15 contracties om de acute cel respons te verkrijgen. De opname te pauzeren en weer te sluiten het licht kanaal. Herhaal de opname na 2 en 5 minuten.
- Neem de elektrode van de put. Reinig de buizen met EB en ga verder met de volgende put van de chambered dekglaasje.
- Analyseer de cel verkorten en Ca 2 + voorbijgaande aard, met de IonWizard software met behulp van de "Edge-Length/Length" en de "fura 2-Numeriek afgetrokken / Ratio" venster, respectievelijk. De procentuele verandering van de initiële cel bakvet en Ca 2 + transient van de piekhoogte verwezen naar de basislijn (bl% piek h) voor de acute, de 2 min 5 min en de reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twee voorbeelden voor het meten van cellulaire inotropie in veld gestimuleerde volwassen hartspiercellen (figuur 2) met een myocyte Ca 2 + en contractiliteit registratiesysteem worden hieronder gegeven. Figuur 3 geeft een indruk van een controlemeting, terwijl in figuur 4 de invloed van antilichamen cardiodepressieve van een patiënt met DCM getoond.
In beide voorbeelden initiële cel bakvet en Ca 2 + transient tijdens superfusie met EB vertonen duidelijke pieken constant, hetgeen een voorwaarde is voor de analyse. We weten uit ervaring dat cellen vertonen een eerste bl% piek h in het bereik van 7 - 14% passen het beste voor onze toepassing, terwijl vaak cardiomyocyten met een lagere of hogere initiële contractiliteit hebben de neiging om niet-uitgelokte veranderingen van cel verkorting vertonen. Na het aanbrengen van de controle IgG, dwz IgG geïsoleerd uit gezonde controlepersonen, inotropie van hartspiercellen blijft ungewijzigd de gehele meting (Figuur 3A). In tegenstelling superfusie met IgG-antilichamen die cardiodepressieve wordt gevolgd door een afname van cel verkorting (Figuur 4A), met vermindering Ca 2 + transiënten die typisch minder uitgesproken (Fig. 4B). We merken op dat meestal een nieuwe evenwichtssituatie wordt vastgesteld voor zowel cel bakvet en Ca 2 + transiënten, na 2 min die behouden tot het einde van de meting na 5 min. Het gegeven voorbeeld wordt een duidelijk negatief inotroop effect en een vermindering van cel verkorting 54% en van Ca2 + transiënten met 31% na 5 min. Echter, veranderingen zijn vaak minder uitgesproken. Daarom hebben we bepaald een boven-en ondergrens voor negatieve en positieve inotropie als gemiddelde ± 2SD voor controle IgG van een gezonde controlegroep vals-positieve resultaten te vermijden. Dienovereenkomstig worden de cellen slechts als negatief of positief inotroop when veranderingen van cel verkorting deze drempel overschrijden, die we bepaald op ongeveer ± 10%.
Figuur 1. Stroomschema van autoantibody detectie door het meten cardiomyocyte contractiliteit. Eerst wordt IgG uit patiënt monsters met anti-IgG sepharose kolommen (geel gemarkeerd). Ten tweede zijn hartspiercellen geïsoleerd uit rattenharten door enzymatische digestie en gekleurd met Fura-2 (blauw gemarkeerd). Tot slot, cel bakvet en Ca 2 + transiënten worden online gecontroleerd met behulp van een myocyten Calcium en contractiliteit Recording System (groen gemarkeerd).
Figuur 2. Geïsoleerde rat cardiomyocyten gepositioneerd in het videogebied van de myocyte contractiliteit Recording System. Onderstaande grafiek de cel geeft de berekende intensiteit sporen gebruikt voor edge detectie. Pijlen geven om randen te detecteren controle-elementen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Representatief voorbeeld van een controlemeting. Cell shortening (A) en Ca2 + transient (B) werd gemeten voor online (initiële) onmiddellijk (acute), 2 min en 5 min na superfusie met IgG. Rode lijnen geven pauzeren van de meting.
"Figuur 4" fo: inhoud-width = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
Figuur 4. Voorbeeld meting van een monster met IgG antilichamen cardiodepressieve. Cell shortening (A) en Ca2 + transient (B) werd gemeten voor online (initiële) onmiddellijk (acute), 2 min en 5 min na superfusie met IgG. Rode lijnen geven pauzeren van de meting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode biedt een geschikte manier om functioneel effectieve cardiale autoantilichamen te sporen bij patiënten met DCM van onduidelijke herkomst. In vergelijking met andere methoden, de detectie van functionele actieve antilichamen tegen de β1-adrenoceptor bijvoorbeeld door het effect op cAMP niveaus 6, onze methode is onafhankelijk van een specifiek epitoop. Natuurlijk zijn er andere epitoop onafhankelijke proeven in de literatuur beschreven, namelijk het tellen van de gewonnen prijs van neonatale cardiomyocyten 13 meten calciumstromen in volwassen hartspiercellen door patch clamp techniek of de contractiliteit van geïsoleerde Purkinje vezels 14. In voordeel van deze werkwijzen is de test hier gepresenteerd is minder tijdrovend, verbeterde objectiviteit door het standaardprotocol. Bovendien laat het detecteren van het effect op de contractiliteit en intracellulair calcium transiënten tegelijkertijd.
Vergelijkbaar met othaar in vitro assays, kunnen de resultaten verkregen met de onderhavige methode worden uitgedaagd door de kunstmatige omstandigheden bij de cellen. Gekweekte neonatale cardiomyocyten van de rat werden gerapporteerd voorkeur hechten tussen micropillars een afstand van 30 urn of minder op vlakke oppervlakken. Wanneer aan deze laatste werden de cellen gevonden actine stress fibers geven en ongeordende myovezels 15. De mogelijke invloed van stress vezels in de samentrekbaarheid assay beschreven verwaarloosbaar kunnen zijn omdat volwassen hartspiercellen alleen gekweekt voor een zeer korte periode van maximaal 6 uur die de vorming van dergelijke vezels en cellen verkorten en Ca2 + kan verminderen transient wordt verwezen naar het eerste contractiliteit van de betreffende cel naar de invloed van individuele verschillen tussen cellen minimaliseren. Een andere beperking is de grote vraag van proefdieren en tijd. Daarom is de werkwijze niet geschikt voor high-throughput screening van patiouders.
Verdere uitvoeringen zijn denkbaar voor de werkwijze. Door de antigen-onafhankelijkheid kan worden toegepast op andere idiopathische cardiovasculaire ziekten, waarbij een auto-effect wordt verondersteld.
Bovendien kan contractiliteit metingen eenvoudig worden aangepast aan functionele effecten van andere stoffen te bestuderen. Dit maakt het analyseren van een potentiële impact van drugs op het hart, dat kan gunstig bijvoorbeeld in de ontwikkeling van geneesmiddelen en testen. Naast de basisparameters die door de veranderingen van cel bakvet en Ca 2 + ten opzichte van baseline, kan nadere informatie worden verkregen van de metingen die een meer gedetailleerde definitie van het waargenomen effect mogelijk maakt. Bijvoorbeeld kan de vertrek snelheid berekend worden uit de cel bakvet gebeurtenissen die een specifieke systolische en diastolische effect van een geneesmiddel of antilichaam kunnen aangeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Sonderforschungsbereich TransRegio 19 (SFB/TR19, C2) van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), het federale ministerie van Economie en Technologie project ZIM-KF 2727801MD0 en het Centrum voor Innovatie Competence - humorale immuunresponsen in Hart-en vaatziekten ( ZIK-HIKE, BMBF FKZ 03Z2CN12) van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Duitsland. Huisvesting en experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Vereniging voor Proefdierkunde (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) en de Federatie van Europese Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
