Summary
Denna metod ger ett sätt att upptäcka funktionella effektiva cardiotropic autoantikroppar i plasma hos patienter med dilaterad kardiomyopati, oavsett specifikt antigen, genom att analysera effekterna av isolerade patienter immunglobulin på cellulär förkortning och intracellulära transienter kalcium i isolerade råttkardiomyocyter.
Abstract
Dilaterad kardiomyopati (DCM) är en av de främsta orsakerna till hjärtsvikt hos yngre vuxna 1. Även genetisk disposition och exponering för giftiga ämnen är kända orsaker till denna sjukdom i ungefär en tredjedel av patienterna förblir ursprunget DCM stort oklart. I ett stort antal av dessa patienter har autoantikroppar mot hjärt epitoper upptäckts och misstänks spela en central roll i uppkomsten och utvecklingen av sjukdomen 2,3. Vikten av hjärt autoantikroppar understryks av en hemodynamisk förbättring i DCM patienter efter eliminering av autoantikroppar från immunoadsorption 3-5. En mängd av specifika antigener har redan identifierats 2,3 och antikroppar mot dessa mål kan detekteras genom immunanalyser. Dock kan dessa analyser inte diskriminera mellan att stimulera (och därför funktionellt effektiv) och blockera autoantikroppar. Det ökar evidence att denna skillnad är avgörande 6,7. Det kan också antas att målen för ett antal cardiotropic antikroppar är fortfarande oidentifierade och därför inte kan upptäckas av immunanalyser. Därför har vi etablerat en metod för detektion av funktionellt aktiva cardiotropic antikroppar, oberoende av deras respektive antigen. Bakgrunden för metoden är den höga homologi vanligen observeras för funktionella regioner av hjärt proteiner i däggdjur mellan 8,9. Detta tyder på att hjärt antikroppar riktade mot humana antigener kommer korsreagera med icke-humana målceller, vilket möjliggör testning av IgG från DCM patienter på vuxna råttkardiomyocyter. Vår metod består av 3 steg: först, IgG isolerad från patientplasma med Sepharose kopplade anti-IgG-antikroppar som erhållits från immunoadsorption kolonner (PlasmaSelect, Teterow, Tyskland). Det andra vuxna hjärtmuskelceller isoleras genom kollagenas perfusion i en Langendorff perfusionsapparat med AProtocol modifieras från tidigare verk 10,11. De erhållna kardiomyocyter är fästa till laminin-belagda kammare täckglas och färgades med Fura-2, en kalcium-selektiv fluorescerande färgämne som lätt kan föras in i cellen för att observera intracellulärt kalcium (Ca 2 +) innehåll 12. I det sista steget, effekten av patientens IgG på cellens förkortning och Ca 2 + transienter i fält stimulerade kardiomyocyter övervakas online med en kommersiell myocyt kalcium och kontraktilitet övervakningssystem (IonOptix, Milton, MA, USA) är ansluten till en vanlig invers fluorescerande mikroskop.
Protocol
1. IgG-Isolering från patientprover
- Förbered mini-immunoadsorption kolonner genom att fylla 3 ml anti-IgG sefaros per 2 ml patienten EDTA-plasma i en tom Econo Pac kolumn. IgG isolering kräver minst 2 ml av patientens plasma.
- Placera ett filter ovanpå anti-IgG-sefaros, skära upp den nedre spetsen av kolonnen och tryck filtret att nå en flödeshastighet av ungefär 1 droppe / sekund. Låt preservationslösningen rinna ut ur kolonnen.
- Tvätta kolonnen med 3 volymer 0,9% NaCl per volym plasma.
- Pipettera plasman på kolonnen. När plasman har helt nedsänkt i anti-IgG-Sepharose, tvätta med samma volym 0,9% NaCl.
- Pipettera en plasmavolym av 0,2 M glycin-HCl, pH 2,8 på kolonnen och låt doppa i Sepharose. Lägga till ytterligare volym av glycin-HCl på kolonnen. Samla flödet genom i ett 15 ml rör och justera pH till 7,3 med 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
- Att regenerera kolonnen, Tvätta med 3 plasma volymer glycin HCl. Efter en slutlig tvätt med 2 volymer 0,9% NaCl, kan kolonnen användas för nästa plasmaprovet. Alternativt kan kolonnen vara fylld med konserveringslösning och förvarades vid 4 - 8 ° C i upp till 4 veckor.
- För användning på kardiomyocyter, har den uppsamlade IgG-fraktionen som skall dialyseras mot experimentell buffert (EB). För framställning av EB, tillsätt 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgClj 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES och 20 mM glukos till 1 L destillerat vatten på en magnetisk omrörare och justera pH till 7,3.
- Fyll IgG-fraktionen till en cellulosaester dialysmembran rör med en molekylvikt avskuren av 100 kDa. Sätt röret i 1 L EB och rör långsamt med en magnetisk omrörare vid 4 ° C. Efter 8 timmar, överför dialysröret i 3 liter färsk EB och dialysera under ytterligare 20 h vid 4 ° C.
- Efter dialys, värme provet under 30 min vid 57 ° C i ett vattenbad för att inactivate komplementfaktorer. Bestäm den totala IgG-koncentrationen och förbereda portioner som innehåller 330 ug IgG vardera. När du lägger provet till hjärtmuskelceller för mätning (steg 4,3), fyll upp portioner till 1 ml med EB. Outspädda alikvoter kan lagras vid -20 ° C tills vidare användning.
2. Isolering av råttkardiomyocyter
- För framställning av Ca 2 +-fri isolering buffert (IB), tillsätt 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES och 11 mM glukos till 1 L destillerat vatten med användning av en magnetisk omrörare. Justera pH till 7,4 vid rumstemperatur och filtrera genom ett 0,2 pm flasktopp filter för sterilisering.
- Fyll 80 ml IB i den övre reservoaren av en termostat Langendorff perfusionssystem. Justera termostatinställningarna att upprätthålla en buffert temperatur av 37 ° C och luftas buffert med 95% O 2/5% CO 2 i 30 min.
- Väg upp ca 10.000 - 12.000 U collagenase typ II, 175 mg fettsyrafri BSA och lös i 20 ml IB innehållande 22,5 | il av en 100 mM CaClj 2 förrådslösning. Kontrollera pH av isoleringen buffert i den övre reservoaren och justera om det behövs.
- Bedöva en Wistar-råtta av 175 - 200 g med 375 pg / kg kroppsvikt tiopental. Lägg 2500 lU heparin till tiopental lösning. Efter torakotomi, punktskatt hjärtat försiktigt med en intakt aortabågen och överföra den till iskall 0,9% NaCl. Rengör hjärtat från blod och omgivande vävnad och överföring till färskt 0,9% NaCl. Exponera aortan, öppnar flödet reducering av Langendorff-systemet för att erhålla en dropp hastighet 2-3/sec och fäst hjärtat till kanylen.
- Perfundera hjärtat för upp till 3 min med en flödeshastighet av 1 droppe / sekund för att tvätta ut kvarvarande blod. Börja med att cirkulera IB i Langendorff-systemet. Ta 20 ml buffert från det övre magasinet, fyll i kollagenaslösning och fyll så mycket buffert som krävs för att nå 80 ml. Cirkulera c ollagenase lösning under ytterligare 27 minuter. Flöde bör kontrolleras regelbundet och underhållas på 1 droppe / sekund med hjälp av flödet reducering.
- Lossa hjärtat från kanylen, ren från förmak och aorta och hacka i små bitar. Låt kollagenaslösning att köra in i den nedre behållaren, minska volymen till max 40 ml och ytterligare smälta de hackade ventriklarna för 10 till 15 minuter under kontinuerlig luftning med 95% O 2/5% CO 2. Efteråt, filtrera cellsuspensionen genom en 200 | im maskstorlek gasväv i en 50 ml tub.
- Återställ Ca 2 + innehållet i cellerna i 3 steg: centrifugera cellsuspensionen vid 43 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och återsuspendera celler i 10 ml IB innehållande 200 pM CaClj 2. Centrifugera igen och återsuspendera cellerna i 10 ml IB med 500 pM CaCl 2. Efter en slutlig centrifugering återsuspendera kardiomyocyter i sterilfiltrerad EB (se 1,8) till en densitet av 50.000 celler / ml.
- Coat en 4 väl chambered täckglas med 10 mikrogram laminin per brunn och vänta tills den är helt torkat.
- Fyll 1 ml av cardiomyocyte suspensionen i varje brunn med användning av en mikropipett med en skuren spets. Tillåta cellerna att vidhäfta under 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd 10 | il av 1 mg / ml Fura-2:00 stamlösning i 5 ml EB. Förvara färgningslösningen i mörker.
- Ta bort buffert och icke fastsatta celler från täckglas och pipetten 0,5 ml av färglösningen i varje brunn. Inkubera cellerna i 10 minuter under måttlig skakning. Därefter tar bort färgningslösningen, tvätta cellerna en gång med 1 ml EB och slutligen fylla 0,5 ml EB i varje brunn. Undvik direkt ljus under färgningen processen och alltid hålla de färgade cellerna i mörker.
4. Inspelning av Cell Förkortning och Ca 2 + transienter
- Placera kammarförsedda täckglas på en invers fluorescens microscope ansluten till en myocyt kalcium och kontraktilitet registreringssystem. Placera en skräddarsydd elektrod med ett inflöde och utflöde rör i den första brunnen. Superfuse kardiomyocyter med 1 ml / min EB och starta den elektriska stimuleringen (20 V, 1 Hz, 5 msek varaktighet). Låt cellerna att anpassa sig till stimulering för ca 2 minuter.
- Välj en intakt stav formad cardiomyocyte med tydlig ränder och konstant kontraktion. Placera cellen i centrum av synfältet och öppna kamerans kanalen. Orientera cellen horisontellt inom videoområdet genom att vrida adaptern cellen utformningen och flytta mikroskopet scenen.
- Justera kanten upptäcka kontrollelement i videoområdet (Figur 2), öppna fluorescerande kanalen och spela 10 till 15 sammandragningar att få den initiala cellen kortare och Ca 2 + övergående.
- Stäng kanal mikroskop ljus för att undvika att blekning av fluorescens fläcken. Växla flödet genom från EB till provetbypass med en 3-vägsventil och kardiomyocyter superfuse med 1 ml patientens IgG. Stoppa pumpen strax innan luft når brunnen.
- Öppna ljuset kanalen och spela in ett annat 10 till 15 sammandragningar för att erhålla akut cellsvaret. Pausa inspelningen och stänga ljuset kanalen igen. Upprepa inspelning efter 2 och 5 minuter.
- Ta ut elektroden av brunnen. Rengör rören noggrant med EB och fortsätta med nästa brunn i kammarförsedda täckglas.
- Analysera cellen kortare och Ca 2 + övergående med IonWizard programvaran med "Edge-Length/Length" och "fura 2-Numeriskt subtraheras / Ratio" fönster, respektive. Beräkna den procentuella förändringen från den ursprungliga cellen förkortningen och Ca 2 + övergående av topphöjden hänvisade till baslinjen (bl% topp h) för akuta, 2 minuter och 5 minuter responsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två exempel för mätning av cellulära inotropi i fält stimulerade vuxna hjärtmuskelceller (figur 2) med en myocyt Ca 2 + och system kontraktilitet registrering anges nedan. Figur 3 ger ett intryck av en kontrollmätning, medan i figur 4 effekten av cardiodepressive antikroppar av en patient med DCM visas.
I båda exemplen, initial cell matfett och Ca 2 + övergående under superfusion med EB uppvisar tydliga och ständiga toppar, vilket är en förutsättning för analysen. Vi vet av erfarenhet att celler som uppvisar en initial bl% topp H i intervallet 7 till 14% passar bäst för vår ansökan, medan hjärtmuskelceller med lägre eller högre initial kontraktilitet ofta tenderar att uppvisa oprovocerade förändringar av cellens förkortning. Efter applicering av kontroll-IgG, isolerat dvs IgG från friska kontrollpersoner förblir inotropi av hjärtmuskelceller unchanged hela mätningen (Figur 3A). I motsats, är superfusion med IgG innehållande cardiodepressive antikroppar följt av en minskning av cell matfett (figur 4A), åtföljt av reduktion Ca 2 + transienter som är typiskt mindre uttalad (figur 4B). Vi observerar vanligen att ett nytt stabilt tillstånd etableras för både cell-matfett och Ca 2 + transienter, efter 2 min som är konserverad till slutet av mätningen efter 5 min. Det givna exemplet visar en mycket tydlig negativ inotrop effekt med en minskning av cell förkortning med 54% och Ca 2 + transienter med 31% efter 5 min. Men förändringar är ofta mindre uttalade. Därför, definierade vi en övre och nedre gräns för negativ och positiv inotropi som medelvärde ± 2SD för kontroll-IgG av en frisk kontrollgrupp för att undvika falska positiva resultat. Därför celler endast betraktas som negativt eller positivt inotropa whöna förändringar av cellens förkortning överskrider denna tröskel, som vi fast beslutna att vara ungefär ± 10%.
Figur 1. Flödesschema över autoantikropp upptäckt genom att mäta cardiomyocyte kontraktilitet. Först IgG ur patientprover med anti-IgG Sepharose kolonner (gulmarkerad). Andra är hjärtmuskelceller isolerade från råtthjärtan genom enzymatisk spjälkning och färgas med Fura-2 (markerad i blått). Slutligen, cell förkortning och Ca 2 + transienter övervakas online med en myocyt Kalcium och kontraktilitet Recording System (markerad i grönt).
Figur 2. Isolerad råtta cardiomyocyte placerad i videon området för myocyt kontraktilitet Recording System. Diagrammet nedan cellen visar beräknade intensitet spår som används för kantavkänning. Pilar indikerar kantdetekteringskretsen kontrollelement. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Representativt exempel på en kontrollmätning. Cell förkortning (A) och Ca 2 + övergående (B) övervakades nätet innan (ursprunglig), omedelbart (akut), 2 min och 5 min efter superfusion med IgG. Röda linjerna indikerar paus av mätningen.
"Figur 4" fo: content-width = "4.5IN" FO: src = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
Figur 4. Exempel mätning av en IgG-prov innehållande cardiodepressive antikroppar. Cell förkortning (A) och Ca 2 + övergående (B) mättes på nätet innan (ursprunglig), omedelbart (akut), 2 min och 5 min efter superfusion med IgG. Röda linjerna indikerar paus av mätningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod ger ett lämpligt sätt att upptäcka funktionellt effektiva hjärt autoantikroppar hos patienter med DCM av oklart ursprung. I jämförelse med andra metoder, t.ex. detektion av funktionella aktiva antikroppar mot β1-adrenoceptor av deras inverkan på cAMP-nivåer 6, är vår metod oberoende av en specifik epitop. Naturligtvis finns det andra epitop oberoende analyser beskrivna i litteraturen, dvs räkna slå andelen neonatala hjärtmuskelceller 13, mätning kalcium strömmar i vuxen hjärtmuskelceller genom patch clamp teknik eller kontraktiliteten av isolerade purkinjefibrer 14. I fördel med dessa metoder, är analysen presenteras här mindre tidskrävande och ger ökad objektivitet på grund av den standardiserade protokollet. Vidare tillåter det att detektera påverkan på kontraktilitet och intracellulära transienter kalcium samtidigt.
Liknar othenne in vitro-analyser, kan resultaten erhållna med den presenterade metoden utmanas av de konstgjorda villkor som gäller för cellerna. Odlade neonatala råttkardiomyocyter rapporterades att fästa företrädesvis mellan micropillars med ett avstånd av 30 pm eller mindre än på plana substrat. När ansluten till senare cellerna fann att visa fibrer aktin stress och oordnade myofibers 15. Men beskrivs de potentiella effekterna av stress fibrer i kontraktiliteten analysen här kan vara försumbar eftersom vuxna hjärtmuskelceller endast odlas under en mycket kort tidsperiod på upp till sex timmar, vilket kan minska bildningen av sådana fibrer och cell förkorta och Ca 2 + övergående hänvisas till den inledande kontraktiliteten hos respektive cell för att minimera inverkan av individuella skillnader mellan celler. En annan begränsning är den stora efterfrågan av försöksdjur och tid. Därför metoden är inte lämplig för high-throughput screening av Patimedelsingredienser.
Ytterligare implementeringar är tänkbara för metoden. På grund av antigen-oberoende den kan tillämpas på andra idiopatisk kardiovaskulära sjukdomar, där en autoimmun påverkan förutsätts.
Dessutom kan kontraktilitet mätningar enkelt justeras för att studera funktionella effekterna av andra substanser. Detta gör att analysera en potentiell inverkan av läkemedel på hjärtat, vilket kan vara till nytta, t.ex. inom läkemedelsutveckling och testning. Förutom de grundläggande parametrarna som tillhandahålls av förändringar av cellens förkortning och Ca 2 + från baseline, kan ytterligare information fås från mätningar som tillåter en mer detaljerad definition av den observerade effekten. Till exempel kan avresa och återkomst hastighet beräknas från de händelser cell kortare vilket skulle kunna tyda på en viss systoliskt och diastoliskt effekten av ett läkemedel eller antikropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), det federala ministeriet för ekonomi och teknik projekt ZIM-KF 2727801MD0 och Centrum för Innovation Kompetens - humorala immunsvar i kardiovaskulära sjukdomar ( ZIK-vandring, BMBF FKZ 03Z2CN12) av den federala ministeriet för utbildning och forskning, Tyskland. Bostäder och experiment med djur utfördes i enlighet med rekommendationerna från Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) och Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
