Summary
Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.
Abstract
Dilate kardiyomiyopati (DKMP) genç yetişkinler 1 kalp yetmezliği için ana nedenlerinden biridir. Toksik maddelere genetik eğilim ve fuar hastaların yaklaşık üçte birinde bu hastalığın nedenleri bilinmesine rağmen, DCM kökeni büyük ölçüde belirsizdir. Bu hastaların önemli bir kısmında, kardiyak epitoplara otoantikorların tespit edilmiş ve hastalığın 2,3 başlangıcı ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından şüphe edilir. Kardiyak otoantikorların önemi immunoadsorbsiyon 3-5 ile otoantikorların ortadan kaldırıldıktan sonra DCM hastada hemodinamik iyileşme altı çizilir. Spesifik antijenlerin çeşitli zaten 2,3 tespit edilmiştir ve bu hedeflere karşı antikorlar immunoassay ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu ölçümlerin uyarıcı (ve bu nedenle de fonksiyonel olarak etkin) ile bloke edici antikorlar arasında ayırt edemez. Eviden vardır artmaktadırBu ayrım önemlidir 6,7 olduğunu ce. Aynı zamanda, cardiotropic antikorların bir dizi hedeflerin yine tanımlanamayan ve bu nedenle bağışıklık deneyleri ile tespit edilemez olduğu kabul edilebilir. Bu nedenle, kendi antijeninin bağımsız işlevsel olarak aktif cardiotropic antikor tespiti için bir metod kurulmamıştır. Yöntem için arka plan genellikle memeli 8,9 arasında kardiyak proteinlerin işlevsel bölgeleri için gözlenen yüksek bir homoloji olduğu. Bu insan antijenlerine karşı, kardiyak antikorlar erişkin sıçan kardiyomiyositler üzerine DCM hastaların IgG test veriyor insan olmayan hedef hücreleri, ile çapraz reaksiyona girer göstermektedir. Önerilen yöntem, 3 adımlardan oluşur: ilk olarak, IgG immunoadsorbsiyon sütunlar (PlasmaSelect, Teterow, Almanya) dan elde edilen Sepharose birleştirilmiş anti-IgG antikorları kullanılarak hasta plazmadan izole edilir. İkinci olarak, erişkin kardiyomiyositlerde ap kullanılarak bir Langendorff perfüzyon cihaz içinde kolajenaz perfüzyon yoluyla izole edilirotokol önceki eserlerinden 10,11 güncellenmiştir. Elde edilen kardiyomiyositlerde laminin kaplanmış odacıklı coverglasses eklenmiş ve Fura-2, kolaylıkla (Ca 2 +) içindekiler 12 hücre içi kalsiyum gözlemlemek için hücre içine getirilebilir bir kalsiyum-seçici floresan boya ile boyanır. Son aşamada, hücre katı ve Ca 2 hasta IgG etki + alan uyarılan kardiyomiyositlerde geçici bir standart ters floresan bağlı olan bir ticari miyosit kalsiyum ve kasılmasını kontrol sisteminin (IonOptix, Milton, MA, ABD) kullanılarak online olarak izlenir mikroskop.
Protocol
1. Hasta Örneklerden IgG İzolasyonu
- Boş Econo Pac sütuna 2 ml hastanın EDTA plazma başına 3 ml anti-IgG Sepharose doldurarak mini immunoadsorbsiyon sütunlar hazırlayın. IgG izolasyon hastanın plazma, en az 2 ml gerektirir.
- Anti-IgG Sepharose üstünde filtre yerleştirin, sütunun alt ucu açık kesilmiş ve yaklaşık olarak 1 damla / sn 'lik bir akış hızına ulaşmak için filtre düğmesine basın. Sütunun tükendi korunması çözümü olsun.
- 3 cilt plazma hacmi başına% 0.9 NaCl ile sütun yıkayın.
- Sütun üzerinde plazma pipet. Plazma tamamen anti-IgG Sepharose batırılır sonra, aynı hacimde% 0.9 NaCl ile yıkanır.
- Pipet bir plazma sütun üzerinde 0.2 M glisin HCl, pH 2.8 hacim ve Sepharose içine batırmayın edelim. Sütun üzerine glisin HCI hacmi başka ekleyin. Bir 15 ml tüp içinde ortaya çıkan akış toplayın ve 0.5 M Tris-HCI, pH 8.0 ile pH 7.3 'e ayarlayın.
- Sütun yenilemek için, 3 plazma hacimleri glisin HCl ile yıkayın. 2 hacim% 0.9 NaCl ile bir son yıkamadan sonra, sütun sonraki plazma örneği için kullanılabilir. ° C ila 4 hafta için 8 - Alternatif olarak, kolon koruma çözeltisi ile doldurulmuş ve 4 de muhafaza edilebilir.
- Kardiyomiyositlerde üzerinde kullanım için, toplanan IgG fraksiyonu deneme tamponu (EB) karşı diyaliz gerekmektedir. EB hazırlanması için, 117 mM NaCI, 2.8 mM KCI, 0.6 mM MgCl2, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde, 20 mM glikoz 1 L damıtılmış suya eklenir ve pH ayarlamak 7.3.
- 100 kDa kesilmiş olan bir molekül ağırlığına sahip olan bir selüloz ester diyaliz zarı tüp için IgG fraksiyonu doldurun. 1 L EB tüp koyun ve 4'e bir manyetik karıştırıcı ile yavaş yavaş karıştırılır ° C. 8 saat sonra, taze EB 3 L diyaliz tüpü içine aktarmak ve 4'de diğer bir 20 saat boyunca dialyze ° C.
- Inactivat için bir su banyosu içinde 30 dakika 57 ° C'de diyaliz için, ısı örnek takibene kompleman faktörleri. Total IgG konsantrasyonunu belirleyin ve 330 mikrogram IgG içeren her alikotları hazırlamak. Ölçümü (adım 4.3) için kardiyomiyositlerde için örnek eklerken, EB ile 1 ml alikotları kadar doldurun. Seyreltilmemiş alikotları daha fazla kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. Sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonu
- Ca2 +-serbest izolasyon tampon (IB) hazırlanması için, 110 mM NaCI, 2.6 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES ve bir manyetik kullanılarak 1 L damıtılmış su ile 11 mM glükoz eklemek karıştırıcı. Sterilizasyon için 0.2 mikron şişe üst filtre ile oda sıcaklığında ve filtre, 7.4 pH ayarlayın.
- Termostatlı bir Langendorff perfüzyon sisteminin üst rezervuar içinde IB 80 ml doldurun. 37 ° C arasında bir sıcaklık muhafaza tampon ve% 95 O2 /% 5 30 dakika için CO2 ile tampon havalandırmak için termostat ayar ayarlayın.
- Yaklaşık 10.000 tartılır - collag 12.000 Uenase tip II, 175 mg yağ asidi serbest BSA ve 100 mM CaCl2 stok solüsyonu 22.5 ul içeren 20 ml'lik IB içinde çözülür. Üst rezervuar içinde tecrit tampon pH kontrolü ve gerekirse ayarlanır.
- 375 mg / kg vücut ağırlığı tiyopental ile 200 gr - 175 bir Wistar sıçan Anesteziyoloji. Tiyopental çözümü 2500 IU Heparin ekleyin. Sağlam bir aort arkı ile dikkatlice torakotomi, tüketim kalp sonra ve buz gibi soğuk% 0.9 NaCl içine aktarın. Kan kalp ve çevresindeki doku ve taze% 0.9 NaCl transfer temizleyin. Aorta Açığa, 2-3/sec bir damla hızını elde etmek ve kanül için kalp eklemek Langendorff sistemin akışını düşürücü açın.
- Kadar kalan kan dışarı yıkamak 1 damla / sn debi ile 3 dakikaya kadar kalp serpmek. Langendorff sisteminde IB dolaşmaya başlayın. Üst rezervuar 20 ml tampon kaldır gibi 80 ml ulaşmak için gerekli çok tampon kollajenaz çözüm ve dolum doldurun. C sirküle Başka bir 27 dakika için çözelti ollagenase. Akış hızı Akış redüktör kullanarak 1 damla / sn aralıklarla kontrol ve muhafaza edilmelidir.
- Kulakçıklar ve aortadan temiz kanül gelen kalp, ayırın ve küçük parçalar halinde doğrayın. Kollajenaz çözüm alt rezervuar içine çalıştırmak için izin ver, 40 ml, maksimum hacmi azaltmak ve daha 10 için kıyılmış ventriküller sindirmek -% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli havalandırma altında 15 dk. Daha sonra, bir 50 ml tüp içinde bir 200 mikron elek gazlı bez ile hücre süspansiyonu filtre.
- 200 uM CaCl2 içeren 10 ml IB içinde oda sıcaklığı ve tekrar süspansiyon hücreler 2 dakika için 43 x g'da hücre süspansiyonu santrifüj: 3 adım hücrelerin Ca 2 + içerik yükler. Tekrar santrifüjlenir ve 500 uM CaCl2, 10 ml IB hücreleri tekrar süspansiyon. Son bir santrifüj 50.000 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa steril filtre edilmiş EB kardiyomiyositlerde (1.8 bakınız) tekrar süspansiyon sonra.
- Coat 10 mikrogram başına iyi laminin ve tamamen kurutulur beklemek bir 4 iyi odacıklıdır coverglass.
- Her iyi bir kesim uçlu bir mikropipet kullanarak içine kardiyomiyosit süspansiyonu 1 ml doldurun. Hücreler, oda sıcaklığında 1 saat boyunca uymak için izin verin.
- 10, 1 mg / ml 'lik ul Fura-2 5 ml EB stok çözelti AM. Seyreltilir Karanlıkta boyama çözüm tutun.
- Coverglass ve her kuyuya boyama çözeltisi pipetle 0.5 ml tampon ve bekâr hücreleri çıkarınız. Sarsıntı orta altında 10 dakika için hücreler inkübe edin. Daha sonra, boyama çözüm take off 1 ml EB ile bir kez hücreleri yıkayın ve nihayet her oyuğuna 0.5 ml EB doldurun. Boyama işlemi sırasında doğrudan ışıktan sakının ve her zaman karanlıkta boyanan hücreleri tutun.
4. Hücre kısaltılması ve Ca 2 + Geçişlerine kaydedilmesi
- Ters floresan m odacıklı coverglass yerleştirinicroscope bir miyosit kalsiyum ve kontraktilite kayıt sistemine bağlı. De ilk akını ve akış tüpü ile özel yapılmış elektrot yerleştirin. 1 ml / dak EB ve (20 V, 1 Hz, 5 ms süre), elektrik uyarımı ile başlamak Superfuse kardiyomiyositlerde. Hücrelerin yaklaşık 2 dakika stimülasyon uyum sağlayın.
- Net çizgili ve sürekli kasılma ile sağlam bir çubuk şekilli kardiyomiyosit seçin. Görüş alanının merkezinde hücre yerleştirin ve kamera kanal açılır. Hücre çerçeveleme adaptörü dönen ve mikroskop sahne hareket ettirerek videoyu alanı içinde yatay hücre yönlendirilmesi.
- Başlangıç hücre kısalma ve Ca 2 + geçici elde etmek için 15 kasılmalar - kenarı video alanı kontrol elemanları (Şekil 2) tespit ayarlayın, floresan kanal ve kayıt 10 açın.
- Floresans leke ağartma önlemek için mikroskop ışık kanalı kapatın. Örnek EB aracılığıyla akışını değiştirmeHastanın IgG 1 ml ile 3-yollu vana ve superfuse kardiyomiyositlerde ile bypass. Hava iyi ulaşmadan hemen önce pompayı durdur.
- Işık kanalı açın ve başka bir 10 kayıt - Akut hücre yanıtını elde etmek için 15 kasılmalar. Kayıt dondurularak ve tekrar ışık kanalı kapatın. 2'den sonra kayıt ve 5 dk tekrarlayın.
- Kuyunun elektrot çıkarın. EB ile iyice temizleyin ve tüpler odacıklı coverglass bir sonraki sıra ile devam edin.
- Sırasıyla Hücre kısalma ve Ca 2 + "Edge-Length/Length" kullanarak IonWizard yazılımı ile geçici ve "fura 2-Sayısal / Oranı çıkarılır" penceresinde, analiz edin. Başlangıç hücre kısalma ve Ca 2 + Akut için temel (bl% pik h) atıfta pik yüksekliği geçici, 2 dakika ve 5 dk yanıtı yüzde değişim hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alanda hücresel inotropiyi ölçümü için iki örnek aşağıda verilmektedir, bir miyosit Ca 2 + ve kasılma kayıt sistemi kullanılarak erişkin kardiyomiyositlerde (Şekil 2) ile alınabilir. Şekil 3, bir kontrol ölçümü arasında bir izlenimini vermektedir, Şekil 4 içinde iken cardiodepressive antikorların etkisi bir hastanın DCM gösterilmiştir.
Her iki örnek, başlangıç hücre kısalma ve Ca 2 + EB superfusion sırasında geçici analizi için bir önkoşul olan, net ve sabit bir tepe gösterirler. Bizim uygulama için en iyi% 14 takım, düşük veya yüksek başlangıç kontraksiyonla kardiyomiyositlerde genellikle hücre kısalma sebepsiz değişiklikler sergilemektedir eğiliminde iken - Biz 7 aralığında ilk bl% pik saat sergileyen hücreler tecrübelerimizden biliyoruz. Kontrol IgG uygulamasından sonra, yani IgG sağlıklı kontrol grubu ile izole kardiyomiyositlerde inotropiyi u kalırTüm ölçüm (Şekil 3A) boyunca nchanged. Buna karşılık, IgG antikorları ihtiva eden cardiodepressive ile superfusion indirgeme Ca2 ile birlikte hücre katı bir azalma (Şekil 4A) tarafından takip edilir + tipik olarak daha az belirgindir ve geçici (Şekil 4B). Biz genellikle yeni bir kararlı duruma 5 dakika sonra ölçüm sonuna kadar muhafaza edilir 2 dakika sonra, hücre kısalma ve Ca 2 + transientler, her ikisi için de kurulduğunu görüyoruz. Verilen örnek 5 dakika sonra% 31 + transientler% 54 ve Ca 2 hücre kısalma bir azalma ile çok net bir negatif inotropik etki gösterir. Ancak, değişiklikler genellikle daha az belirgindir. Bu nedenle, ortalama olarak negatif ve pozitif inotropiyi için bir alt ve üst sınır tanımlanan ± sağlıklı kontrol grubunun kontrolü IgG 2SD yanlış pozitif sonuçlardan kaçınmak için. Buna göre, hücreler sadece negatif veya pozitif inotropik w olarak kabul edilmektedirHücre kısalma tavuk değişiklikleri biz yaklaşık olarak belirlenen bu eşik, ±% 10'unu aşmamaktadır.
Şekil 1. Kardiyomiyosit kontraktilite ölçerek otoantikor algılama akış şeması. Birincisi, IgG anti-IgG Sepharose sütunlar (sarı ile vurgulanmış) kullanarak hasta numunelerinin elde edilir. İkincisi, kardiyomiyositlerde Fura-2 (mavi renkle vurgulanmıştır) ile enzimatik sindirim ve lekeli ile sıçan kalpleri izole edilmiştir. Son olarak, hücre kısalma ve Ca 2 + transientler bir miyosit Kalsiyum ve Kasılabilme Kayıt Sistemi (yeşil vurgulanır) kullanarak online olarak izlenmektedir.
Şekil 2. İzole sıçan kardiyomiyosit miyosit Kasılabilme Kayıt Sisteminin video alanında konumlandırılmış. hücrenin altındaki grafik kenar algılama için kullanılan hesaplanmış yoğunluğu izlerini gösterir. Oklar kenarını algıladıktan kontrol elemanları gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Bir kontrol ölçümü arasında temsili bir örneği. Hücre kısalması (A) ve Ca 2 + geçici (B), 2 dakika ve IgG ile superfusion 5 dakika sonra (akut), hemen, (ilk) daha önce çevrim takip edilmiştir. Kırmızı hatları ölçüm duraklatılmasıyla işaret etmektedir.
"Şekil 4" fo: content-width = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
Şekil 4. Cardiodepressive antikorların IgG ihtiva eden bir örnek Örnek ölçülmesi. Hücre kısalması (A) ve Ca 2 + geçici (B), daha önce online olarak ölçüldü (ilk), hemen (akut), IgG ile superfusion sonra 2 dakika ve 5 dak. Kırmızı hatları ölçüm duraklatılmasıyla işaret etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan yöntem belirsiz kökenli DCM hastalarda fonksiyonel olarak etkili kardiyak otoantikor saptamak için uygun bir yol sunar. Diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, cAMP seviyelerini 6 üzerindeki etkileri ile β1-adrenoseptör karşı işlevsel aktif antikorların saptanması, örneğin, bizim yöntem, belirli bir epitopa bağımsızdır. Tabii ki literatürde açıklanan diğer epitop bağımsız analizi yani yama klemp tekniği veya izole Purkinje lifleri 14 kontraktilite tarafından yetişkin kardiyomiyositlerde kalsiyum akımları ölçmek yenidoğan kardiyomiyositlerde, 13. yenerek oranı sayma vardır. Bu yöntemlerin avantaj olarak, burada sunulan tahlil daha az zaman alır ve standart bir protokol nedeniyle artmıştır nesnellik sağlar. Bundan başka, aynı zamanda kontraktilitesini ve hücre içi kalsiyum geçici üzerindeki etkisini tespit edilmesine imkan vermiştir.
Ot benzeronun in vitro tahlillerin, sunulan yöntem ile elde edilen sonuçlar hücrelere uygulanan yapay koşullar tarafından itiraz edilebilir. Kültürlü yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde düz yüzeylerde daha 30 mikron veya daha az bir mesafe ile micropillars arasındaki tercihen eklemek bildirildi. Ikincisi eklenmiş, hücreler aktin stres lif göstermek için yararlı ve myofibers 15 sırasız edildi. Bununla birlikte, kasılma tahlil içinde stres lif potansiyel etkisi yetişkin kardiyomiyositlerde ancak bu tür liflerin kısaltılması ve hücre oluşumu ve Ca 2 azaltabilir 6 saat için çok kısa bir süre için kültürlenmiştir beri önemsiz olabilir Burada açıklanan + geçici Hücreler arasında bireysel farklılıkları etkisini en aza indirmek için söz konusu hücrenin ilk kasılma adlandırılır. Başka bir sınırlama deney hayvanları ve zaman yüksek talep olduğunu. Bu nedenle yöntem pati yüksek verimli tarama teknikleri için uygun değildirEnt.
Daha uygulamaları için yöntem düşünülmelidir. Antijen-bağımsızlık nedeniyle, otoimmün bir etki kabul edilen diğer idiyopatik kardiyovasküler hastalıklar için uygulanabilir.
Ayrıca, kasılma ölçümler kolayca diğer maddelerin işlevsel etkilerini çalışmak için ayarlanabilir. Bu ilaç geliştirme ve test yararlı örneğin olabilir kalp üzerinde ilaçların potansiyel etkilerini analiz sağlar. Hücre katı ve Ca 2 + bazal değişimleri tarafından sağlanan temel parametreler yanı sıra, daha fazla bilgi gözlenen etkinin daha ayrıntılı bir tanım izin veren ölçümler elde edilebilir. Örneğin, dönüş ve dönüş hızı, belirli bir sistolik ve bir ilaç ya da antikor diastolik etki gösterebilir hücre katı olaylar hesaplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Kardiyovasküler Hastalıklarda Humoral Bağışıklık Yanıtları (- Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ve Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2), Ekonomi ve Teknoloji proje ZIM-KF 2727801MD0 Federal Bakanlığı ve İnovasyon Yetkinlik Merkezi tarafından desteklenen ZIK-Yürüyüş, Eğitim ve Araştırma, Almanya Federal Bakanlığı BMBF FKZ 03Z2CN12). Hayvanlarla Konut ve deneyler Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği (FELASA) Laboratuvarı Zootekni (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) ve Federasyon için Derneği'nin önerilerine göre yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
