Summary
Krystallstruktur av protein-DNA komplekser kan gi innsikt i protein funksjon, mekanisme, samt, arten av den spesifikke interaksjon. Her rapporterer vi hvordan du kan optimalisere lengden, rekkefølge og ender dupleks DNA for co-krystallisering med
Abstract
Escherichia coli SeqA er en negativ regulator av DNA replikasjon som hindrer for tidlig reinitiation hendelser etter avsondringsmidler hemimethylated GATC klynger innenfor replikasjonsorigo en. Utover opprinnelse, er SeqA funnet på replikering gafler, hvor den organiserer nylig kopiert DNA i høyere beordret strukturer to. SeqA knytter bare svakt med enkle GATC sekvenser, men den danner høy affinitet komplekser med DNA duplexes inneholder flere GATC nettsteder. Minimal funksjonell og strukturell enhet av SeqA er en dimer, og dermed forklarer kravet om minst to GATC sekvenser for å danne en høyaffinitets-kompleks med hemimethylated DNA 3. I tillegg tillater SeqA arkitekturen med oligomerisering og DNA-bindende domener som er atskilt med en fleksibel linker, binding til GATC gjentar atskilt av opptil tre skrueformede omdreininger. Derfor å forstå funksjonen av SeqA på et molekylært nivå krever strukturelle analysis av SeqA bundet til flere GATC sekvenser. I protein-DNA krystallisering, kan DNA ha ingen til en eksepsjonell effekt på pakking interaksjoner avhengig av den relative størrelse og arkitektur av proteinet og DNA. Hvis proteinet er større enn DNA eller overføringene fleste av DNA, blir krystall pakking hovedsak mediert av protein-protein interaksjoner. Omvendt, når proteinet er av samme størrelse eller mindre enn DNA eller den bare dekker en brøkdel av de DNA, DNA-DNA og DNA-protein interaksjoner dominerer krystall pakking. Derfor krever krystallisering av protein-DNA komplekser systematisk screening av DNA lengde 4 og DNA ender (sløv eller overheng) 5-7. I denne rapporten beskriver vi hvordan å designe, optimalisere, rense og krystallisere hemimethylated DNA duplexes inneholder tandem GATC gjentar i komplekset med en dimerglycerol variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) for å få krystaller egnet for strukturbestemmelse.
Protocol
1. Proteinrensing
Den fleksible linker kobler N-(oligomerisering) og C-terminale (DNA-binding) domener av SeqA hjelpemidler anerkjennelse av hemimethylated GATC gjentar separert med 1-3 omdreininger på DNA. For denne studien brukte vi en dimerglycerol variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) med en punktmutasjon i det N-terminale domenet som forhindrer ytterligere oligomerisering og en forkortet linker som begrenser DNA-binding til tandem GATC gjentar separert eksklusivt av en omdreining på DNA (figur 1) 2,8.
- Transform BL21 (DE3) celler med plasmidet koding SeqA under kontroll av T7 promoteren,
- Plate transformasjonen reaksjonen i LB-agarplater inkludert 100 ug / ml ampicillin,
- Pick blandede kolonier for å inokulere en småskala overnatter kultur (LB-medium med 100 ug / ml ampicillin),
- Neste morgen inokulere en 1 L av medier med en 1:100 fortynning av overnight kultur,
- Dyrke cellene til en OD 600 av ~ 0,7 og indusere proteinproduksjon ved tilsetning av isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 1 mM,
- Fortsette inkubering i 3 timer ved 37 ° C med orbital risting og deretter høste cellene ved sentrifugering (10 min ved 3300 g),
- Resuspender cellepelleten i rensing buffer A og Lyse ved sonikering,
- Slett lysatet ved sentrifugering (40 min ved 39000 g) og laste supernatanten på en heparin kolonne ekvilibrert med rensing buffer,
- Eluer SeqA anvendelse av en lineær gradient til 1 M NaCl (SeqA elueres ved ~ 0,7 M NaCl),
- Pool de SeqA-holdige fraksjoner sammen, fortynn til senke ionestyrken av prøven og lasten i en kation-utveksling kromatografikolonne ekvilibrert med rensing buffer,
- Ved hjelp av en lineær salt gradient, eluerer ren SeqA på ~ 0,4 M NaCl,
- Pool de SeqA-holdige fraksjoner sammen, konsentrerte (3 mg / ml) og lagre i lagringsbuffer.
2. DNA Rensing
- Bestill komplementære unmethylated og rødsprit oligonukleotider fra din favoritt selskap,
- Løs opp 1 mikromol av hver frysetørret enkelt strand DNA i 800 ul autoklaverte DDH 2 O, vortex og la den sitte i 10-20 min,
- Legg 800 ul forvarmet 2X lasting buffer til hver oligonukleotid,
- I 20-30 nukleotider lange oligonukleotider, forberede en stor 10% denaturering gel (160 x 250 x 1 mm):
* Bland godt 80 ml 10% PAGE mix, 80 pl TEMED og 800 pl ammoniumpersulfat per gel og helle,
* Når polymerisert, fjern kammen og skyll brønner med DDH 2 O grundig,
* Monter gels på gel cast inkludert kjøling plate og deretter fylle den øverste og nederste reservoarer med rennende buffer (1X TBE),
* Pre-run gel på 700-750 V å varme gel opp til 55 ° C,
* Stopp kjøre og skyll brønnene Thoroughly med rennende buffer. - Varm oligonukleotider til 90 ° C i 2 min,
- Vortex og spinne prøvene og umiddelbart før du legger i gel,
- Kjør gelen ved ~ 700 V og stoppe det når din oligonukleotid har migrert halvveis. (Merk at på en 10% polyakrylamidgel bromophenol blå co-migrerer med oligonukleotider ~ 20 baser lang og xylen cyanol FF med ~ 60 baser lang),
- Stopp gel, demontere den fra gel boksen og fjerne avstandsstykker,
- På et flatt underlag, fjerner du en glassplate og dekke gel med plastfolie,
- Snu gel rundt, fjern den andre glassplate og dekke den med plastfolie,
- Markere band med UV-lys og et fluorescerende plate bak gel for å se DNA skygge,
- Skjær bandet med et barberblad i små biter og overføre dem til en steril 15 ml tube,
- Legg 9 ml elueringsbuffer og eluere natten ved 37 ° C med omrøring,
- Nøye overføre løsningentil en autoklavert sentrifugerør hjelp av en gel-lasting pipettespiss å unngå å overføre akrylamidenheter stykk og tilsett 1 ml 3 M natrium-acetat ved pH 7 (1:10 fortynning) pluss 25 ml kjølt 100% etanol (2,5 volumer),
- Inkuber ved -20 ° C i minst 3 timer,
- Spinne ned og overfør supernatanten til en separat rør,
- Tørk pellet på speed-vac på middels varme,
- Resuspender pellet i 400 ul autoklaverte DDH 2 O og overføre til en frisk tube,
- Tilsett 40 pl av 3 M natriumacetat ved pH 7 og 1 ml av 100% etanol, bland godt (vortex) og inkuber 30 minutter ved romtemperatur etterfulgt av 30 minutter ved -20 ° C,
- Spin i 15 minutter ved 18 000 g og kast supernatanten,
- Skyll pellet med 100 ul av 70% kald etanol for å fjerne gjenværende salt fra pelleten og sentrifugering for 6 minutter ved 18 000 g.. Kast etanol og tørk pellet på speed-vac,
- Resuspender pellet i totalt 100 pl autoklaverte DDH
- Å anneal de hemimethylated DNA duplexes, bland ekvimolare konsentrasjoner av komplementære enkelt tråder og varme blandingene til 95 ° C i et vannbad i 5 min og deretter la dem avkjøles langsomt til romtemperatur inne i vannbadet.
3. Protein-DNA Complex Dannelse og analyse
- Bland like volumer av renset SeqAΔ (41-59)-A25 (81 uM) og hemimethylated DNA (81 uM),
- Inkuber ved romtemperatur i 15 min og oppbevar ved 4 ° C før du er klar til å bruke det,
- Screen for krystallisering forhold og med kommersielle sparsom-matrise skjermer,
- Når de første krystallisering fører har blitt identifisert, optimalisere forholdene for å dyrke diffraksjon kvalitet krystaller,
- Cryoprotect de resulterende SeqA-DNA krystaller ved enten å øke mengden av PEG 400 tilstede i krystallisering løsning til en sluttkonsentrasjon på 25% (v / v) eller legge 20% glycerol (volum / volum) til krystallisasjon løsning,
- Øse individuelle krystaller med en nylon løkke og flash-fryse dem i flytende nitrogen,
- Test diffraksjon grensen for hver krystall ved 100 K.
4. Representant Resultater
For å oppnå krystallstrukturen av SeqAΔ (41-59)-A25R bundet til hemimethylated DNA, vi fortløpende optimalisert tre parametere på DNA: (i) separering mellom hemimethylated GATC sekvenser, (ii) lengde av dupleks, og (iii) fravær / nærvær av 5 'overheng.
Electro-mobilitet skift analyser tyder på at SeqAΔ (41-59)-A25R fortrinnsvis binder GATC gjentar atskilt med 9-10 basepar (figur 1). Derfor har vi i utgangspunktet vist duplexes 23-24 basepar (bp) lang med to hemimethylated GATC sekvenser atskilt med enten 9 eller 10 bps. Tre duplexes ga pent formede krystaller (figur 2). Alom ingen av krystallene diffracted til høy oppløsning, bps den 23 lange dupleks med de to GATC nettsted atskilt med 9 bps diffracted røntgenstrålene bedre enn resten, noe som indikerer at en GATC separasjon av 9 bps ble foretrukket for krystallisering. Derfor fikset vi inter-GATC avstand til 9 bps for alle påfølgende skjermbildene.
Vanligvis blir DNA krystallisering favorisert for duplex lengder tilsvarende nøyaktige skrueformede svinger fordi flere DNA-molekyler kan stable hode-til-hale for å danne en kontinuerlig B-DNA inne i krystallen 9. Derfor, forkortet vi den samlede lengden på duplexes til 21 bps (dvs. to spiralformede omdreininger). Mens en 21 bps dupleks med butte ender ikke ga diffraksjon kvalitet krystaller (data ikke vist), en 21 bps duplex med en enkelt 5 'overheng nukleotid på hver ende gjorde gi krystaller som diffracted til 5 Å i vårt hjem kilde. Forbedringen på diffraksjon grensen antydet at ende-til-ende dupleks Foreningen ble faktisk favorisereing krystall pakking.
Siden SeqA samhandler med GATC-sekvenser som er på den samme flate av DNA, bør den motsatte flate av DNA dupleks utsettes for løsningsmidlet. For ytterligere å forbedre de krystaller av komplekset, vi deretter modifisert sekvensen av dupleks for å inkludere en CG dinukleotid mellom de to GATC for å markedsføre sporlignende ryggraden interaksjoner med tilstøtende DNA-molekyler i krystallen gjennom den motsatte flate av dupleks, en fremgangsmåte som har blitt brukt til å forbedre DNA krystallisering i fortiden 10. Var imidlertid diffraksjon grensen av krystallene vokst med CG-inneholdende dupleks identisk til de som var dyrket med en lignende DNA dupleks som ikke inneholdt CG dinukleotid (Figur 3). Dette resultatet indikerte at sporlignende ryggraden interaksjoner var ikke viktig i dette tilfellet. Vi senere optimalisert lengden på overheng ved å sammenligne krystallene vokst med en DNA dupleks som hadde to ytterligere nukleotider ved hver5 'enden. Denne endringen hadde en drastisk effekt på krystall morfologi, samt, diffraksjon grense indikerer at ytterligere nukleotid dramatisk endret de molekylære kontakter og forbedret krystall organisering (Figur 3).
Krystallstrukturen av SeqAΔ (41-59)-A25R bundet til denne siste DNA dupleks bekreftet at den frie flate av DNA dupleks driver ikke krystall kontakter, som forventet fra den begrensede effekt av å innføre en CG-dinukleotid. Tross for den relative størrelse av protein og DNA, er de fleste interaksjoner mellom symmetri mates mediert av protein-protein og protein-DNA interaksjoner (figur 4). Interessant, i dette spesielle tilfellet, er den virkelige virkning av en 5 'dinukleotid overheng ikke skyldes dannelsen av en pseudo-kontinuerlig DNA. Stedet samhandler 5 'enden av de metylerte strengbrudd prosjektene unna DNA akser og med den proksimale SeqA molekylet av komplekset, som forklarer hvorfor to nukleotider w ere strengt nødvendig å endre krystall pakking 8,11.
Figur 1. Binding av SeqAΔ (41-59)-A25R til hemimethylated DNA. (A) Skjematisk diagram av domenene til SeqA som formidler protein oligomerisering og DNA bindende. (B) Elektroforetisk mobilitet shift analyse av SeqAΔ (41-59)-A25R med DNA'er inneholder to hemimethylated GATC sekvenser atskilt med et økende antall basepar ( X). Lengst til venstre lane (merket Blank) inneholder en ekvimolar blanding av DNA-molekyler med 5, 7, 12, 21, 25 og 34 basepar mellom de to sekvenser GATC i fravær av SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) Diagram som viser de tre variablene optimalisert for DNA duplexes å få diffraksjon kvalitet krystaller.
upload/4266/4266fig2.jpg "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Effekt av varierende inter-GATC avstand. Oppsummering av oligonucleotides brukt og krystaller oppnådd med 23-24 bp lange duplexes inneholder to hemimethylated GATC områder atskilt med 9 eller 10 basepar. Alle bildene av krystaller ble tatt på samme forstørrelse og skalaen indikerer 100 um. Oppløsningen grense for hver SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA krystall er basert på diffraksjon bilder samlet på et Rigaku RU-300 X-ray generator system. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Effekt av varierende DNA ender. Oppsummering av than oligonukleotider brukt og krystaller oppnådd med 21 bps lange duplexes inneholder to hemimethylated GATC områder atskilt med 9 basepar og med 0, 1 eller 2 nukleotid 5 'end overheng. Alle bildene av krystaller ble tatt på samme forstørrelse og skalaen indikerer 100 um. Oppløsningen grense for hver SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA krystall er basert på diffraksjon bilder fanget på beamlines X12C og X29 (NSLS, BNL). Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Krystall pakking av SeqAΔ (41-59)-A25R bundet til DNA med dinukleotid overheng: Sett fra (A) topp og den side (B). Asymmetrisk enhet inneholder to SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA komplekser hvor proteinet er vist i grått mens DNA er vist i oransje. Symmetry related SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA molekyler er vist i hvitt for proteinet og gul for DNA. Dette tallet ble utarbeidet ved hjelp PyMOL 12. Dette tallet er relatert til Movie 1. Klikk her for å se større figur .
Movie 1. Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de største utfordringene i macromolecular røntgenkrystallografi er å skaffe diffraksjon kvalitet krystaller. I tilfelle av protein eller protein-DNA komplekser, er denne utfordringen forverret på grunn av de ytterligere variabler som må optimaliseres. Det er antatt at lengden av DNA og tilstedeværelsen av klebrige overheng for å forbedre sammenslutning av nabo DNA molekyler i en lengre pseudo-dupleks er de viktigste parametre for å optimalisere. Imidlertid, har vi vist at naturen og lengden av disse overheng kan ha flere effekter på krystall pakking av et protein-DNA kompleks. Selv om denne protokollen ble utviklet for å krystallisere det SeqA-DNA kompleks, optimalisering av DNA lengde, sekvens og ender gir en generell ramme for rasjonell utforming av oligonukleotider for krystallisering av enhver DNA-protein kompleks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke PXRR ansatte ved NSLS (Brookhaven National Laboratory) for å få hjelp i løpet av datainnsamling og Monica Pillon for hjelp med DNA rensing. Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (MOP 67189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
|||
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
