Summary
Kristallstruktur av protein-DNA-komplex kan ge insikt i proteinfunktion, mekanism, liksom, arten av den specifika interaktionen. Här rapporterar vi hur du optimerar längden, sekvens och ändarna av duplex-DNA för samarbete kristallisation med
Abstract
Escherichia coli SeqA är en negativ regulator av DNA-replikation som förhindrar för tidig förnyad initiering händelser genom att binda hemimetylerat GATC kluster inom replikationsursprung 1. Bortom ursprung, SeqA finns vid replikationsgafflar, där det anordnar nyligen replikerade DNA i högre beställda strukturer 2. SeqA associerar endast svagt med enstaka GATC-sekvenser, men den bildar hög affinitet komplex med DNA-duplexar som innehåller flera GATC platser. Den minimala funktionella och strukturella enheten av SeqA är en dimer, vilket förklarar kravet av minst två GATC-sekvenser för att bilda en hög affinitet komplex med hemimetylerat DNA 3. Dessutom tillåter SeqA arkitektur, med oligomerisering och DNA-bindande domänerna separerade av en flexibel linker, bindning till GATC upprepningar separerade med upp till tre spiralformade varv. Därför att förstå funktionen av SeqA på molekylär nivå kräver strukturella analys av SeqA bundet till flera GATC-sekvenser. I protein-DNA-kristallisering kan DNA har ingen en exceptionell effekt på förpackning interaktioner beroende på de relativa storlek och arkitektur av proteinet och DNA. Om proteinet är större än DNA eller fotavtryck flesta av DNA, är kristallen packningen primärt medieras av protein-protein-interaktioner. Omvänt, när proteinet är av samma storlek eller mindre än DNA eller det bara täcker en bråkdel av DNA, DNA-DNA och DNA-protein-interaktioner dominerar kristall packning. Därför kräver kristallisation av protein-DNA-komplex systematisk screening av DNA-längd 4 och slutar DNA (trubbig eller överhäng) 5-7. I denna rapport beskriver vi hur man designar, optimera, rena och kristallisera hemimetylerat DNA-duplex innehållande tandem GATC upprepningar i komplex med en dimer variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) för att erhålla kristaller lämpliga för strukturbestämning.
Protocol
1. Proteinrening
Den flexibla linker ansluter N-(oligomerisering) och C-terminal (DNA-bindande) domäner SeqA hjälpmedel erkännande av hemimetylerat GATC upprepningar åtskilda av 1-3 varv på DNA. För denna studie använde vi ett dimert variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) med en punktmutation i den N-terminala domänen som förhindrar ytterligare oligomerisering och en förkortad linker som begränsar DNA-bindning till tandem upprepar GATC separerade enbart av ett varv på DNA (figur 1) 2,8.
- Transform BL21 (DE3)-celler med den plasmid som kodar SeqA under kontroll av T7-promotorn,
- Platta omvandlingen reaktionen i LB-agarplattor innefattande 100 pg / ml ampicillin,
- Pick blandade kolonier för att ympa en småskalig odling över natten (LB-medium med 100 pg / ml ampicillin),
- Nästa morgon inokulera en 1 L av media med en 1:100 spädning av overniGHT kultur,
- Odla cellerna till en OD 600 av ~ 0,7 och inducera proteinproduktion genom tillsats av isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 1 mM,
- Fortsätt inkubation under 3 h vid 37 ° C med orbital skakning och sedan skörda cellerna genom centrifugering (10 minuter vid 3.300 g),
- Resuspendera cellpelleten i rening buffert A och lysera genom sonikering,
- Rensa lysat genom centrifugering (40 minuter vid 39.000 g) och ladda supernatanten på en heparinkolonn jämvikt med rening buffert,
- Eluera SeqA använda en linjär gradient till 1 M NaCl (SeqA eluerar vid ~ 0,7 M NaCl),
- Pool de SeqA fraktionerna tillsammans, späd att sänka jonstyrkan i provet och lasten i en katjonbyteskromatografi kolonn jämviktad med rening buffert,
- Med hjälp av en linjär saltgradient, eluerar rent SeqA vid ~ 0,4 M NaCl,
- Pool på SeqA fraktionerna tillsammans, koncentrerate (3 mg / ml) och förvara i lagringsbuffert.
2. DNA-rening
- Beställ kompletterande ometylerade och metylerade oligonukleotider från din favorit företag,
- Lös 1 pmol av varje frystorkat enda DNA i 800 pl autoklaverat DDH 2 O, virvel och låt det sitta i 10-20 minuter,
- Tillsätt 800 | il förvärmd 2X laddningsbuffert till varje oligonukleotid,
- Under 20-30 nukleotider långa oligonukleotider, förbereda en stor 10% denaturerande gel (160 x 250 x 1 mm):
* Blanda väl 80 ml 10% PAGE blandning, 80 pl TEMED och 800 ul ammoniumpersulfat per gel och häll,
* När polymeriserade, ta bort kammen och skölj brunnarna med DDH 2 O ordentligt,
* Montera geler på gel rösterna, inklusive kylning plattan och sedan fylla den övre och nedre reservoarer med rinnande buffert (1X TBE),
* Pre-köra gelén vid 700-750 V att värma gelén upp till 55 ° C,
* Stoppa körningen och skölj brunnarna THOROughly med rinnande buffert. - Värm oligonukleotiderna till 90 ° C under 2 minuter,
- Vortex och snurra proverna och omedelbart före lastning gelen,
- Kör gelen vid ~ 700 V och stoppa den när ditt oligonukleotid har flyttat halvvägs. (Observera att på en 10% polyakrylamidgel bromfenolblått sammigrerar med oligonukleotider ~ 20 baser långa och xylencyanol FF med ~ 60 baser lång),
- Stoppa gelen, demontera den från gelboxen och ta bort distanserna,
- På en plan yta, ta bort en glasplatta och täcka gelen med plastfolie,
- Vänd gelen runt, ta bort den andra glasskivan och täck den med plastfolie,
- Markera banden med UV-ljus och en fluorescerande platta bakom gelen att se DNA skugga,
- Skär bandet med ett rakblad i små bitar och överföra dem i ett sterilt 15 ml rör,
- Lägg 9 ml elueringsbuffert och eluera natten vid 37 ° C med omrörning,
- Försiktigt över lösningentill en autoklaverad centrifugrör med användning av en gel-laddning pipettspets att undvika att överföra akrylamid bitar och tillsätt 1 ml av 3 M natriumacetat vid pH 7 (01:10 spädning) plus 25 ml kyld 100% etanol (2,5 volymer),
- Inkubera vid -20 ° C under minst 3 timmar,
- Centrifugera ner och överför supernatanten till ett separat rör,
- Torka pelleten på speed-vac på medelvärme,
- Återsuspendera pelleten i 400 | il autoklaverat DDH 2 O och överföra till ett nytt rör,
- Tillsätt 40 | il 3 M natriumacetat vid pH 7 och 1 ml 100% etanol, blanda väl (virvel) och inkubera 30 minuter vid rumstemperatur, följt av 30 min vid -20 ° C,
- Snurra under 15 minuter vid 18.000 g och kassera supernatanten,
- Skölj pelleten med 100 pl 70% kall etanol för avlägsnande av kvarvarande salt från pelleten och centrifugering under 6 minuter vid 18.000 g.. Kasta etanol och torka pelleten på fart-vac,
- Resuspendera pelleten i totalt 100 pl autoklaverad DDH
- Att glödga hemimetylerat DNA-duplex, blanda ekvimolära koncentrationer av de komplementära enkelsträngar och värma blandningarna till 95 ° C i ett vattenbad under 5 min och sedan låta dem svalna långsamt till rumstemperatur inuti vattenbadet.
3. Protein-DNA-komplex bildning och analys
- Blanda lika delar av renat SeqAΔ (41-59)-A25 (81 M) och hemimetylerat DNA (81 M),
- Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter och förvara vid 4 ° C tills du är redo att använda den,
- Screen för kristallisationsbetingelser användning av kommersiella gles matris skärmar,
- När första kristallisation leder har identifierats, optimera förutsättningarna att odla kristaller diffraktion kvalitet,
- Cryoprotect de resulterande SeqA-DNA kristaller genom att antingen öka mängden PEG 400 närvarande i kristallisation lösningen till en slutlig koncentration av 25% (v / v) eller tillsats 20% glycerol (volym / volym) till kristallisation lösningen,
- Scoop enskilda kristaller med en nylon ögla och flash-frysa dem i flytande kväve,
- Testa diffraktionsgränsen varje kristall vid 100 K.
4. Representativa resultat
För att erhålla den kristallstruktur SeqAΔ (41-59)-A25R bundet till hemimetylerat DNA optimerat vi följd tre parametrar på DNA: (i) separation mellan hemimetylerat GATC-sekvenser, (ii) längden av duplexen, och (iii) frånvaro / närvaro av 5 'överhäng.
Electro-mobilitetsförskjutningsanalyser analyser indikerar att SeqAΔ (41-59)-A25R företrädesvis binder GATC upprepningar separerade med 9-10 baspar (figur 1). Därför skärmad vi inledningsvis duplex 23-24 baspar (bps) lång med två hemimetylerat GATC-sekvenser åtskilda av antingen 9 eller 10 bps. Tre duplexar gav snyggt formade kristaller (Figur 2). Alom ingen av kristallerna diffrakterade till hög upplösning, bps den 23 långa duplex med de två GATC platser åtskilda av 9 bps diffrakterade röntgen bättre än resten, vilket indikerar att en GATC separation av 9 bps föredrogs för kristallisation. Därför fast vi inter-GATC avstånd till 9 bps för alla efterföljande skärmar.
Generellt är DNA kristallisation gynnas för duplexa längder motsvarande exakta spiralformade varv eftersom flera DNA-molekyler kan stapla huvud-till-svans för att bilda en kontinuerlig B-DNA inom kristallen 9. Därför förkortas vi den totala längden av de duplexar till 21 bps (dvs. två spiralformade varv). Medan en 21 bps duplex med trubbiga ändar inte gav kristaller diffraktionsdata kvalitet (data ej visade), en 21 bps duplex med en enda 5-överhäng nukleotiden på varje ände har gav kristaller som diffrakterade till 5 Å i våra hem källa. Förbättringen på diffraktionsgränsen föreslog att end-to-end duplex föreningen verkligen var gynnaning kristall packning.
Eftersom SeqA interagerar med GATC-sekvenser som finns på samma sida av DNA, bör den motsatta sidan av DNA-duplexen exponeras för lösningsmedlet. För att ytterligare förbättra kristallerna av komplexet, modifierade vi sedan sekvensen av duplexen att inkludera en CG-dinukleotid mellan de två GATC platser för att främja spår-ryggrad interaktioner med intilliggande DNA-molekyler i kristallen genom den motsatta ytan av duplexen, en metod som har använts för att förstärka DNA-kristallisation i det förflutna 10. Emellertid var diffraktionsgränsen av kristallerna odlas med CG-innehållande duplex identiska med dem som odlats med en liknande DNA-duplex som inte innehöll CG-dinukleotid (figur 3). Detta resultat visade att spår-backbone interaktioner var inte viktigt i detta fall. Vi optimerade därefter längd överhängen genom att jämföra kristallerna odlas med en DNA-duplex som hade två ytterligare nukleotider vid varje5 'änden. Denna förändring hade en dramatisk effekt på kristallmorfologi, liksom, diffraktionsgränsen indikerar att ytterligare nukleotid dramatiskt förändrat de molekylära kontakter och ökad kristall organisation (Figur 3).
Kristallstrukturen av SeqAΔ (41-59)-A25R bundet till denna sista DNA-duplex bekräftade att den fria ytan av DNA duplex inte bedriver kristall kontakter, som förväntat från den begränsade effekten av att införa en CG-dinukleotid. Trots den relativa storleken på protein och DNA, är de flesta interaktioner mellan symmetri kompisar förmedlas av protein-protein och protein-DNA interaktioner (Figur 4). Intressant, i detta fall, är den gynnsamma effekten av en 5 "-dinukleotid överhäng inte beror på bildandet av en pseudo-kontinuerlig DNA. Istället, interagerar 5-änden av de metylerade strängen projekt bort från DNA axlarna och med den proximala SeqA molekylen av komplexet, förklarar varför två nukleotider w ere krävs strikt att ändra kristallen packning 8,11.
Figur 1. Bindning av SeqAΔ (41-59)-A25R till hemimetylerat DNA. (A) Schematisk beskrivning av domäner SeqA som förmedlar protein oligomerisering och DNA-bindande. (B) Elektroforetisk rörlighet skift analys av SeqAΔ (41-59)-A25R med DNA innehållande två hemimetylerat GATC-sekvenser separerade av ett ökande antal baspar ( X). Längst till vänster körfält (märkt Blank) innehåller en ekvimolär blandning av DNA med 5, 7, 12, 21, 25 och 34 baspar mellan de två GATC-sekvenser i frånvaro av SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) Diagram som visar de tre variablerna optimerade på DNA-duplexen för att erhålla kristaller diffraktions kvalitet.
upload/4266/4266fig2.jpg "FO: content-width =" 6in "FO: src =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Effekt av att variera mellan GATC avstånd. Sammanfattning av de använda oligonukleotiderna och kristaller erhållna med 23-24 bp långa duplexar innehållande två hemimetylerat GATC platser separerade med 9 eller 10 baspar. Alla bilder av kristaller togs vid samma förstoring och skalan stapeln visar 100 nm. Upplösningen gränsen varje SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-kristall är baserad på diffraktion bilder som samlats in på en Rigaku RU-300 X-ray generatorsystem. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Effekt av att variera DNA-ändar. Sammanfattning av than oligonukleotider används och erhållna kristallerna med 21 bps långa duplexar innehållande två hemimetylerat GATC platser separerade med 9 baspar och med 0, 1 eller 2 nukleotid 5 'överhäng end. Alla bilder av kristaller togs vid samma förstoring och skalan stapeln visar 100 nm. Upplösningen gränsen varje SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA kristall bygger på diffraktion bilder som samlats in vid strålrör X12C och X29 (NSLS, BNL). Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Kristall packning av SeqAΔ (41-59)-A25R bundet till DNA med dinukleotid överhäng: Sett från (A) upptill och på sidan (B). Den asymmetriska enhet innehåller två SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-komplex där proteinet visas i grått när DNA visas i orange. Symmetrisktry relaterade SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-molekyler visas i vitt för proteinet och gult för DNA. Denna siffra framställdes genom användning PyMOL 12. Denna siffra är relaterad till film 1. Klicka här för att se större bild .
Film 1. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de största utmaningarna i makromolekylär röntgenkristallografi är att få kristaller diffraktion kvalitet. I fallet med protein eller protein-DNA-komplex, är denna utmaning förvärras på grund av de ytterligare variabler som måste optimeras. Det anses allmänt att längden av DNA och närvaron av klibbiga överhäng för att öka associationen av angränsande DNA-molekyler i en längre pseudo-duplex är de viktigaste parametrarna för att optimera. Emellertid, har vi visat att naturen och längden på dessa överhäng kan ha ytterligare effekter på kristallen packning av ett protein-DNA-komplex. Även om denna protokoll utformades för att kristallisera SeqA-DNA-komplexet, optimering av DNA-längd, sekvens och slutar ger en allmän ram för rationell utformning av oligonukleotider för kristallisering av vilken som helst DNA-protein-komplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka PXRR personalen på NSLS (Brookhaven National Laboratory) för hjälp vid insamling av data och Monica Pillon för hjälp med DNA-rening. Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (MOP 67.189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
|||
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
