Summary
Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem açıklanır
Abstract
Biz bütün Drosophila beyinleri ex vivo kültürlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu akut farmakolojik ve hücresel süreçlerin canlı görüntüleme izin vererek hücre biyolojisi ve merkezi beyin yapılarının gelişimini araştırmak için kronik genetik manipülasyonlar için bir kontrpuan olarak kullanılabilir. Tekniğinin bir örneği olarak, önce bizim laboratuar 1 ile çalışmak, daha önce tanınmayan Subselüler bölmesi Drosophila merkezi beynin akson aksonal ve somatodendritik bölmeler arasında yattığını göstermiştir. Aksonun ilk segmenti (AIS) 2 olarak adlandırılan bu bölmeye gelişimi, nöron spesifik siklin-bağımlı kinaz, Cdk5 bağlı genetik olarak gösterildi. Biz Cdk5-spesifik farmakolojik inhibitörleri roscovitine ve olomoucine 3 ile yabani tip Drosophila larva beyinleri ex vivo tedavi aktin örgütü akut değişikliklere neden olur, ve burada göstermekGenetik olarak Cdk5 aktivitesi eksikliği görülen mutantlarının değişiklikler taklit hücre yüzey proteini Fasciclin 2, lokalizasyonunu.
Ex vivo kültürü tekniği ikinci bir örneği, embriyonik mantar gövdesi (MB) larva yetişkine kadar metamorfoz sırasında gamma nöronların bağlantıların remodeling için sağlanmıştır. Mantar vücudu koku öğrenme ve sinek 4 bellek merkezidir ve bu gama nöronlar yetişkin innervasyon desen 5 kurmak için bir sonraki timepoint yeniden uzatması dalları daha sonra pupa gelişimi sırasında aksonal ve dendritik dalları budamak ve. MB Bu nöronların budama ecdysone reseptör B1 7 de hareket ederek, ecdysone, bir steroid hormon tarafından tetiklenen bir mekanizma ile, nörit dalları 6 lokal dejenerasyonu ile meydana gösterilmiştir ve bu aktivite bağımlı olmuştur ubikuitin-proteazom sistemi 6. Ex vivo kültür Bizim yöntemi b yapabilirsinize daha da gelişimsel yeniden mekanizmasını sorgulamak için kullanılır. Biz ex vivo kültür ortamında, MB gama nöronlar in vivo benzer bir zamanlaması ile gelişimsel budama işlemi değinmeyecek bulundu. Bu hücreler başkalaşım geri dönüşümsüz olarak işlemesi amacıyla doku explanting önce 1.5 saat puparium oluşumundan sonra beklemek, ancak, önemli idi; kültüründe çok az veya hiç metamorfoz yol pupariation başlangıcında hayvanların diseksiyonu. Böylece, uygun bir modifikasyonu ile ex vivo kültürü yaklaşımı ve merkezi beyin biyoloji açıdan kararlı şekilde dinamik incelemek için uygulanabilir.
Protocol
Ortam hazırlanışı
- Filtre-sterilizasyon Schneider'in Drosophila Medya% 10 Fetal Bovine Serum ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tarafından eksiksiz bir medya hazırlayın.
- Medya her zaman taze hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, önceden dondurulmuş ortam taze bir alikotu her kullanımdan önce çözülür edilebilir.
- Kültür öncesinde, 10 mikrogram / ml insülin ve medyaya 2 mcg / ml ecdysone ekleyin. Uyuşturucu konsantre stok olarak hazırlanır ve küçük hacimde de donduruldu. Çözülmüş alikotları tekrar dondurulmamalıdır değildi.
- Tüm çalışma çözeltileri 25 ° C'de muhafaza edilmelidir
Larva Brains kültürünün
1. Larva Brains Seçimi ve Diseksiyon
- 12 mm Millicell hücre kültürü yazısına medya 500 ul ekleyin. Disseke beyinler kolay immun kolaylaştırmak için bu ekler yerleştirilir.
- Diseksiyon bir saat camı ile hazırlanmış ortam küçük bir miktar ekleyin.
- U, küçük bir spatula şarkı dolaşıp Üçüncü dönem larva almak ve saat camı koyun. (Biz ex vivo kültür yöntemi ilk veya ikinci Larvalar için eşit derecede geçerli olacağını tahmin, ama biz bunu test edemedim.)
- , Forseps bir çift ile larva posterior ucundan tutarak dikkatle # 5 forseps ikinci bir çift ile ön sonuna kadar açın.
- Hızla ventral sinir kordonu korunarak, beynin incelemek.
Dissected Larva Brains 2. Ex vivo kültür
- Ön ıslak pipet uçları kullanarak, hücre kültürü ekler, medya ile önceden doldurulmuş dikkatle beyin aktarın.
- 25 küvözde medya Transfer beyinleri, ° C kadar zaman istenilen noktaya ulaşılır. Bu yöntem, kültürde 48 saat için verimli çalışır.
- 8 saat ortamı değiştirin. Bunun ötesinde, medya her 5-6 saatte yarısı değiştirin.
3. Farmakolojik ManipülasyonLarva Brains
Ex vivo kültürleme Bu yöntem, farmakolojik olarak daha önce laboratuar 1 'de gösterilmiştir genetik etkileşimler teyit etmek için kullanılabilir.
- 100 uM roscovitine ve hazırlanmış medya 100 uM olomoucine ekleyin.
- Bu medya disseke beyinleri aktarın.
- 25 de kültüre beyinleri ° C'de 24 saat boyunca.
- 8 saat ortamı değiştirin. Bunun ötesinde, medyanın yarısı (uyuşturucu ile) her 5-6 saat değiştirin.
Pupa Brains kültürünün
1. Diseksiyon için Pupalar Seçimi
- Şişe / şişe beyaz pupa işaretleyin.
- Sadece tamamen beyaz pupa seçin. Renklenme herhangi bir sıralama ile pupa dahil edilmemelidir.
- Bu aşama Puparium Formasyonu (APF) sonra 0 saattir.
- Bu pupa 1.5 saat işaretleme sonrası diseksiyon için hazır olacak. Bu adım, bu gelişimsel budama ex vivo meydana sağlamak için çok önemlidir
2. Pupa diseksiyonu
- 12 mm Millicell hücre kültürü yazısına medya 500 ul ekleyin. (Disseke beyinler kolay immun kolaylaştırmak için bu ekler yer alacak).
- İstenilen zaman noktaya ulaşıldığında, bir diseksiyon saat camı için hazırlanmış medya küçük bir miktar ekleyin.
- Küçük, ıslak spatula kullanarak, pupa önce diseksiyon için işaretlenmiş pick up ve saat camı koyun.
- Forseps bir çift ile pupa arka sonuna Holding, dikkatle # 5 forseps ikinci bir çift ile pupa halinde ön ucunu açmak.
- Hızla ventral sinir kordonu sağlam ve bağlı tutmak, beynin incelemek.
Dissected pupa Brains 3. Ex vivo Kültürleme
- Hücre kültürü ekler, medya ile önceden doldurulmuş dikkatle beyin aktarın.
- İstediğiniz zaman p kadar 25 inkübatör ° C ortam Transfer beyinleri,oint ulaşılır. Biz gösterilen deney için kültürde 10 saat için bu yöntemi kadar kullanılan, ancak gerekirse, gözlem ve tedavi daha uzun süre için uzatılabilir.
- 8 saat APF fazla zaman noktaları daha uzun süre, medya her 5-6 saat değiştirin.
Bu adımdan, protokol larva ve pupa hem de değişmeden kalır.
B. Dissected Brains Tespit
- İstediğiniz zaman noktaya ulaşıldığında, medya çıkarın ve 1x PBS içinde% 4 formaldehit 500 ul eklemek% 0.5 Triton 15 dakika sonra taze formaldehit ile değiştirerek 30 dakika boyunca X-100 (PBST).
- Sabitleştirici ile medya değiştirirken beyinleri kuruması için değil emin olun.
- % 0.5 TritonX-100 (PBST) ile 1x PBS dört adet 10 dakikalık yıkar ile formaldehit yıkayın.
C. Sabit Brains Boyama
- Formaldehit yıkanıp sonra,% 1 ile Normal 1x PBS bir bloke edici çözelti içinde 1 saat süreyle beyinleri blokeKeçi serum ve% 1 Bovine Serum Albumin.
- Çözümü engelleme kadar yapılan birincil antikor ekleyin.
- 4 gece boyunca inkübe beyinleri ° C
- Ertesi sabah, PBST dört 10 dakikalık yıkama primer antikorlar yıkayın.
- Çözümü engelleme kadar yapılan sekonder antikor ekleyin.
- 4 saat için oda sıcaklığında bırakın.
- PBST dört 10 dakikalık yıkar ile sekonder antikorlar yıkayın.
D. Mikroskopi Sabit ve Vitray Brains Montaj
- 1 saat Vectashield montaj medya beyinleri dengeye.
- Vectashield yarığına kullanılarak cam slaytlar üzerine kafa monte edin.
- Kapak kayma monte edilmeden önce beyinleri her iki tarafında da cam yongaları yerleştirin. Bir konfokal mikroskop ile tüm odak uçakları taramak için yeterli örnek ince tutarken, ezilmiş olmaktan beyinleri engeller. Brains ilgi özelliklerini inceleyen kolaylaştırmak için montaj üzerine kabaca odaklı idi. Gerektiğinde,beyin görüntüleri dokümantasyon ve ölçüm için optimal bir görünüm sağlamak için Imaris yazılımı ile döndürüldü.
- Net tırnak cilası ile kayar kapağı kapatın.
- Mağaza ışıktan uzak slaytlar.
E. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 (A) vahşi tip sineklerin üçüncü evre larva beyinleri bir panel gösterir ve (B) Cdk5 bir baskın-negatif türevi (Cdk5DN) (Connell-Crowley ve ark., 2000) ifade sinekler. MB gama nöronlarda hem ekspres aktin-GFP (yeşil). Daha önce açıklandığı gibi (Trunova ve ark., 2011), bu nedenle bir "açık bölgesi" (A, dirseği) olarak gösteren, ve, aktin-GFP birikmesine başarısız yaban-tip gamma nöronların proksimal akson bir bölgenin olduğu fasciclin 2 protein (kırmızı) sadece yukarı bu bölgenin ventral sınır (beyaz yatay çizgi) aksonlar birikir. Şekil 1 (A) üçüncü panelinde noktalı çizgi hareket öne, MB konumunu gösterir"açık bölge" ve ventral sınırında. Cdk5DN ifade sinekler ise, aktin temiz zon yoktur (B) ve Fasciclin 2 (FasII) immünreaktivite o bölge üzerinden dorsal yayılır. (Yatay MB arasında FasII pozitif aksonları değişken sayıda unutmayın; bu fenotipi ile ilgili değildir). Ölçek bar 20 mikron temsil eder.
Ex vivo kültürleme bizim yöntemi kullanarak, roscovitine ve olomoucine, Cdk5 aktivitesinin inhibitörleri farmakolojik bir kombinasyonu ile vahşi tip sinekler muamele. Şekil 2, bir kontrol üçüncü evre larva beyinleri (A) paneli ve (B ilaçla işleme tabi tutulmuş gösterir ) vahşi tip sinekler. 24 saat Cdk5 inhibitörleri ile tedavi beyinleri baskın bir olumsuz Cdk5 yapı ifade sinekler benzer karakteristik aktin açık alan kaybı ve FasII sınırında shift (köşeli parantez) göstermektedir. Beyaz çizgiler vahşi tip FasII sınır konumunu göstermektedir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.
Figuyeniden 3 mCD8-GFP (yeşil) membran hedefli etiketli 0-10 saat APF gelen Drosophila mantar organlarının temsilcisi dizi gösterir. Braketler kaliks, yani MB dendritik projeksiyonları göstermektedir. Önceden metamorfoz üzere, bir kalınlıkta demetler yanı sıra, yoğun dendritik mili (taşıyıcı) kaynaklanan flüoresan sinyalinin bir 'pus' in dorso-ventral akan MB aksonlardan görebiliriz. Zamanda parçalanmış panel A gösterir beyinleri göstermiştir. Bölgede dendritlerin budama (akson sinyali etkilenmemiş olsa da) 6-8 saat ile APF, dendritik sinyal pus gitti öyle ki, parantez ile gösterilir unutmayın. Panel B Brains iç ecdysone başak (Truman ve Riddiford, 2002) ve belirtildiği gibi kültürlü ex vivo önce, 0 saat APF de diseke edildi. Bu dendritler hiçbir gelişimsel budama göstermek; yerine dendritik sinyal 10 saat APF de devam etmektedir. Bunu aşmak için, pupa 0 saat APF işaretlenmiş, ancak 1,5 saat APF ve kültürlü olarak disseke edilir. Panel C 0-10 saat APF bu Drosophila mantar organlarının temsilcisi dizi gösterir. Non-kültüre örneklerde olduğu gibi, dendritik sinyali 8 saat YGø ile mümkün değildir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutasyonlar ve transgenlerin ifadesi de dahil olmak üzere doku yapısı ve fonksiyonları, kronik genetik manipülasyonlar, tipik olarak ayırmak çok zor olabilir ve ani etkilerini ve geç dolaylı sonuçları karışımından oluşur. Farmakoloji ile genetik yöntemler tamamlayan bir fenotip arkasında zaman tabii sorgulama kolaylaştırabilir. Örneğin, bu Drosophila 10 spermatogenezisin sırasında farklı sitoskeletal bileşenlerin katkılarını kesme için güçlü bir yaklaşım olmuştur. Mevcut örnekte, bize Drosophilia'daki AIS yapısını korumak için Cdk5 için kalıcı bir gereklilik olduğunu göstermek için izin verdi. Diğer deneylerde de uyuşturucu kullanan başarılı yaptıkları protein kinaz (imatinib), aktin polimerizasyonu (Sitokalazin, latrunculin ve jasplakinolide) ve mikrotübüllerin (vinblastin ve taksol) dahil olmak üzere hedef diğer hücre bileşenleri.
"> Ex vivo kültür yöntemleri de gelişimsel süreçlerinin dinamikleri yüksek çözünürlükte analiz sağlar. Önceki çalışmalar gibi gibi, beyin merkezinin 11 veya sinir sistemi diğer kısımlarının uzun vadeli görüntüleme kısa vadeli canlı görüntüleme tanımlamışlardır biz sabit malzeme İmmünoboyama doku analizi odaklanmış olurken torasik ganglion 12 ve retina / optik lob bağlantıları 13. Burada, biz tarif yöntemi beyin merkezinin uzun vadeli canlı görüntüleme için geçerli olmalıdır. Örneğin, uygun budama akson ve dendritler arasında Drosophila mantar vücut gelişimi sırasında santral sinir sisteminde doğru bağlantıları ve innervasyonu desenleri oluşturmak için gereklidir. Ayrıca, nöronal organizasyon ve yeniden anormallikleri Alzheimer, ALS ve Parkinson gibi birçok nörodejeneratif hastalıklar, altında yatan düşünülmektedir. Burada anlatılan tekniği bize taklit sağlar kültüründe Drosophila mantar gövdesi ex vivo olarak neurites remodeling in vivo,. Biz genetik değişimler karşısında geliştirme şimdi görüntü değişiklikleri, çevre farmakolojik tedaviler veya değişiklikleri. Olabilir
Şekil 1. Cdk5DN ve aşkın ifade aktin 'temiz bölge' kaybı ve Drosophila mantar vücut gama-nöronlarda FasII sınırında bir değişikliğe neden olur. Panel B beyinlerinin iki örnek Cdk5DN aşırı eksprese gösterirken Panel A, aktin-GFP (yeşil) ve FasII (kırmızı) için boyandı vahşi tip beyinler üç örnek gösterir. Aktin 'temiz bölge' (taşıyıcı) kaybına dikkat edin ve (B) FasII ventral sınır (yatay beyaz çizgi) büyüteceği. (A) 'in noktalı çizgi mantar gövdesinin konumunu gösterir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.
2 "/>
Şekil 2. Farmakolojik Cdk5 inhibitörleri roscovitine ve olomoucine ile tedavi Drosophila mantar vücutlarında aşırı ifadesi fenotip Cdk5DN taklit eder. Panel B 24 saat kültüre iki ilaçla işleme tabi tutulmuş beyinleri, gösterirken panel A iki kontrol vahşi tip beyinleri gösterir. Aktin 'temiz bölge' (taşıyıcı) ve (B) FasII sınır (yatay beyaz çizgi) vardiya kaybı unutmayın. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.
Şekil 3. Drosophila mantar vücut dendritlerin dendritlerin vivo remodeling olarak ex vivo değinmeyecek edilebilir. Panel A gösterilen ve zar bağlı GFP (yeşil) için boyanmış zaman noktalarında parçalanmış beyinleri gösterir. 8saat APF tarafından dendritik sinyal kaybolması (taşıyıcı tarafından vurgulanan diffüz, yeşil sinyal) unutmayın. Panel B 0 saat APF ve kültürlü ex vivo olarak disseke beyinleri gösterir ex vivo takiben, 1.5 saat APF de disseke beyinleri gösterir. Bunlar beyinleri vivo (A) görülen benzer dendrit budama göstermektedir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz el yazması üzerine tavsiye, yararlı tartışmalar ve yorumlar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de özellikle biz yeniden deneylerde yetiştiricilik için beyinlerini parçalayıp önce 1.5 saat APF kadar beklemeniz mükemmel bir öneri için Marta Koch ve Bassem Hassan teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların konfokal mikroskop kullanımı için NHGRI görüntüleme tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, Ulusal Sağlık Enstitüsü (Z01 NS003106) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
