Summary
Fremskridt inden massespektrometri har tilladt high throughput analyse af proteinekspression og ændringen i en lang række væv. Kombineret med subcellulær fraktionering og sygdomsmodeller, kvantitativ massespektrometri og bioinformatik kan afsløre nye egenskaber i biologiske systemer. Fremgangsmåden beskrevet heri analyseres chromatin-associerede proteiner i tilfælde af hjertesygdomme og let anvendes til andre
Abstract
I kernen bor de proteomes hvis funktioner er mest tæt knyttet til genregulering. Voksent pattedyr cardiomyocyte kerner er unik på grund af den høje procentdel af binucleated celler, 1 den overvejende heterochromatic tilstand af DNA'et, og den ikke-delende art cardiomyocyte som gør voksne kerner i en permanent tilstand af interfase. 2 Transkriptionel regulering under udvikling og sygdom er blevet godt undersøgt i dette organ, 3-5, men hvad forbliver relativt uudforsket, er den rolle, som de nukleare proteiner, der er ansvarlige for DNA emballage og udtryk, og hvordan disse proteiner styre ændringer i transkriptionelle programmer, der opstår under sygdom. 6 I den udviklede verden, hjertesygdom er den største årsag til dødelighed for både mænd og kvinder. 7 indsigt i, hvordan kerneproteiner samarbejder om at regulere udviklingen af denne sygdom er afgørende for at fremme den nuværende behandling oULIGHEDER.
Massespektrometri er det ideelle redskab til at løse disse spørgsmål, da det giver mulighed for en fordomsfri annotation af det nukleare proteomanalyse og relativ kvantificering for hvordan overflod af disse proteiner ændringer med sygdom. Mens der har været flere proteom undersøgelser for mammale nukleare proteinkomplekser, 8-13 indtil for nylig 14 har der kun været én undersøgelse undersøger hjertets nukleare proteom, og den fandt hele kerne, snarere end at udforske proteomet på niveau med nukleare sub rum . 15. I stor del, dette arbejdsmangel skyldes vanskeligheden ved at isolere hjerte kerner. Cardiac kerner forekommer inden for et stift og tæt actin-myosin apparatur, hvortil de er forbundet via flere udvidelser fra det endoplasmatiske reticulum, i det omfang, myocyt sammentrækning ændrer deres samlede form. Seksten Derudover kardiomyocytter er 40% mitokondrier vol. 17, som necessitaTES berigelse af kernen bortset fra de andre organeller. Her beskriver vi en protokol for hjerte-nukleare berigelse og yderligere fraktionering i biologisk relevante rum. Endvidere har vi detalje metoder til label-fri kvantitativ massespektrometrisk dissektion af disse fraktioner-teknikker modtagelige for in vivo eksperimenter i forskellige dyremodeller og organsystemer hvor metabolisk mærkning ikke er mulig.
Protocol
Den eksperimentelle workflow indeholder syv store trin (figur 1). For ethvert arbejde, der involverer prøver, der vil blive kørt på massespektrometer, bør eksperimentatoren bære en laboratoriekittel, handsker og hårnet og sørge for at undgå forurening fra støv og personlig udgydelse af keratin.
1. Heart Homogenisering og nuklear Isolation
Mus hjerter homogeniseres og et intakt kerner pelleten isoleret (fig. 2).
- Sacrifice voksne mus, udskære hjertet, skylles med iskold PBS, og homogeniseres på is i glas dounce (vi foretrækker Wheaton vævsmølle fra Fisher, # 08-414-13A, men andre fremgangsmåder kan arbejde lige så godt) indeholdende 2 ml lysisbuffer (en hypotonisk opløsning, der differentielt lyserer cellemembranen over organeller herunder nucleus) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl og 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] i deioniseret vand plus protease og phosphatase inhibitor blanding: 10 mM natriumbutyrat, 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM NaF og 1 Roche protease pellet/10 ml - lysisbuffer kan opbevares i op til en uge ved -20 ° C ). (Bemærk: Vi har ikke fundet det nødvendigt at perfundere hjerter med PBS, som vores massespektrometridata og GO analyse identificere proteiner som overvejende cardiomyocyte [p-værdi 3.8E-22] i oprindelse i modsætning til blodkontaminering [p-værdi 5,0 E-2].)
- Hæld lysat gennem 100 um si og indsamle gennemstrømningen i 1,5 ml centrifugerør. På dette tidspunkt, medmindre bør prøven opbevares på is.
- Der centrifugeres ved 4.000 rpm i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten. (Dette er i cytosolen, og skal opbevares ved -80 ° C. Den indeholder den lyserede mitokondrier.) Resuspender pellet i 200 ul lysepuffer ved triturering. (Dette er den rå kernepellet.)
- Fyld 1,5 ml centrifugerør med 1 ml saccharose buffare (24% saccharose vægt / rumfang, 10 mM Tris pH 7,5, og 15 mM NaCI i deioniseret vand med protease / phosphatase inhibitor blandingen - saccharose-puffer bør frisk på dagen for anvendelse). Forsigtigt layer den resuspenderede pellet oven på sucrose puden og der centrifugeres ved 5000 rpm i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern den tynde film på toppen såvel som saccharose pad (som indeholder membran). Skylle tilbageværende pellet med 200 pi iskold PBS / EDTA (1x PBS med 1 mM EDTA). (Dette er kernerne pelleten og kan opløseliggøres eller fastgjort til anvendelse i western-blotting eller elektronmikroskopi [Se trin 4.1 og 4.2] at kvantificere berigelse.)
2. Nucleoplasm og detergent-ekstraheret Kromatin Fraktionering
Det rå kerner pellet separeres i en nucleoplasm og detergent-ekstraheret chromatin fraktion, der indeholder proteiner, løst associeret med DNA'et.
- Tritureres pellet fra trin 1.6 i 200 pi detergent ekstraktionsbuffer (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCI, 1 M urinstof, 1% NP-40 i deioniseret vand med protease / phosphatase inhibitor blandingen - detergentekstraktion buffer kan opbevares i op til en uge ved -20 ° C).
- Vortex prøve 2 gange, 10 sek hver. Sted på is 10 min.
- Der centrifugeres ved 13.000 rpm i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten. (Dette er nucleoplasm og skal opbevares ved -80 ° C). Skyl pellet med iskold PBS / EDTA. (Dette er chromatin pellet.)
- Tritureres pellet i 300 ul Tris, SDS, EDTA-puffer (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS i deioniseret vand med protease / phosphatase inhibitor blandingen - Tris, SDS, EDTA buffer kan opbevares i op til én uge ved -20 ° C).
- Sonikeres 3-6 gange i 10 sekunder hver at nedbryde DNA. Hold prøve på is mellem sonications.
- Der centrifugeres ved 13.000 rpm i 5 min ved 4 ° C. Opbevares supernatanten. (Supernatant er detergent-ekstraheret chromatin protein fraktioneringsn og skal opbevares ved -80 ° C). Den tilbageværende pellet bør være lille og kan bortkastes.
- Hvis der anvendes isolerede myocytter i stedet for hele hjertet: Isoler nyfødte rotter ventrikulære myocytter fra rotteunger en dag efter fødslen ved hjælp af enzymatisk fordøjelse, efterfulgt af dyrkning i Dulbecco modificeret Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% insulin -transferrin-natriumselenit (ITS), og 1% penicillin. Efter 24 timer overføres til serumfrie medier (samme som ovenfor, men mangler FBS). Harvest celler i lysisbuffer (opført i 1,1), og begynde nukleare fraktionering ved trin 1,3.
3. Syre-udvinding Fraktionering - DNA-bundet protein Enrichment
Et særskilt fraktionering beriger for proteiner tæt bundet til DNA'et, herunder histoner.
- Gentage trin 1,1-2,4.
- Tritureres chromatin pellet i 400 pi af 0,4 N svovlsyre. Vortex for at fjerne klumper.
- Inkuber ved 4 ° C i 30 min eller overnøjre mens det roterer.
- Der centrifugeres ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C til fjernelse nukleart affald.
- Overfør supernatanten til et nyt rør.
- Tilsættes 132 pi af trichloreddikesyre dråbevis til supernatanten. Invert flere gange. Der inkuberes på is i 30 minutter.
- Centrifuger ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres. Forsigtigt skylle pellet med iskold acetone. (Dette er den histon pellet.)
- Centrifuger ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Gentag vask trin 3,8-3,9.
- Air-tør pellet.
- Pellet resuspenderes i 100 pi Tris, SDS, EDTA-puffer. Indstille pH-værdien til 8 ved tilsætning af 1 M Tris. (Brug en 1 M Tris bestand, der ikke er pH-justeret.)
- Sonikeres i vandbad i 15 minutter. Undgå overophedning ved tilsætning af is til vandbad. (Dette er det syreekstraherede fraktion og skal opbevares ved -80 ° C.)
4. Renhed Check
Western blots og elektronmikroskopibekræfte vellykket berigelse af kerner og nedbrydning af andre organeller. Hvis du vil se typiske resultater for alle følgende kvalitetskontrol assays, se vores tidligere publikation. 18
- Udføre Western blot-analyse. Probe membran indeholdende hver fraktion for histon H2A eller nucleoporin p62 (som nukleare markører at kontrollere berigelse), og for adeninnukleotid transportøren, BiP og tubulin (som mitochondrial markør, endoplasmatisk reticulum markør, og cytoskeletale markør henholdsvis at verificere renhed). At verificere subfraktionering af kernerne, probe for histon H3 eller fibrillarin (detergent og syreekstraherede chromatin og intakte kerner) og SNRP70 eller E2F (nucleoplasm). Probe til retinoblastoma eller hypoxi inducible factor-1 (beriget med detergent-ekstraheret chromatin forhold syreekstraherede fraktion). Yderligere kontrolprøver af HeLa cellelysat og hele hjertet lysat kan også køres i samme gel: Forbered HeLa cellelysat kontrol ved tilsætning af Tris, SDS, EDTA-puffer til dyrkningsskål og under anvendelse af en celleskraber for at indsamle prøven. Sonikeres og centrifuger prøve som i trin 2,6-2,7. Fremstille hele hjertet lysat-kontrol ved at homogenisere hjertet i 2 ml buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% triton X-100, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM glycerophosphat i deioniseret vand med protease og phosphataseinhibitor blanding). Sonikeres og centrifuger som i trin 2,6-2,7. Se trin 5 til fremstilling af proteinprøver for SDS-PAGE.
- Electron Microscopy: Resuspender kerner pellet fra trin 1,6 i lysepuffer indeholdende 2% glutaraldehyd og fastsætte prøve ved 4 ° C. Skyl prøver i osmic syre, tørrer, og integrere i epoxyharpiks. Skær 70 nm skiver under anvendelse af en Reichert Ultracut ultramikrotom. Farv prøverne i uranylacetat og derefter bly og billede ved hjælp af en JEOL 100CX Transmission Electron Microscope. Kvantificere berigelse ved måling af arealet af intakte kerner versus samlede areal af materiale afbildet. Vi finder 60-80% af kerner tilvære intakt. 14
Vigtige overvejelser for berigende kontra rensning kerner. Denne protokol blev udviklet for at muliggøre proteom analyser af hjerte-kromatin med det formål at studere globale genregulering processer under sygdom. En vigtig del af at designe hel-proteommønstrene massespektrometri eksperimenter, er spørgsmålet om dynamikområde og være i stand til at identificere og karakterisere lav overflod proteiner. Ud over det primære mål at tilvejebringe oplysninger om nuklear og chromatin-specifikke biologi, berigende for den nukleare proteom, øger sandsynligheden for at detektere disse lav-tæthed proteiner, som gør yderligere subfraktionering af kernerne. Som diskuteret, den voksne cardiomyocyte har en tæt cytoskeletal er tilsluttet til kernemembranen. Vi mener ikke, at vi helt har renset kernerne fra disse andre cellulære komponenter. Men ved berigelse kun for kerner, har vi opnåred en acceptabel grænse, således at de typer af analyser beskrevet.
Specifikt har vi anvendt EM at vurdere renheden af vores rå kerner pellet og fundet 60-80% af fraktionen at være intakte kerner, omkring 10% mitokondrier, og resten debris. Derudover ved vi fra vores tidligere undersøgelse af den intakte kerner befolkning, at mens mange myofilaments ikke er beriget med denne protokol (herunder tubulin og actin som målt ved Western) visse proteiner (calsarcin-1) er beriget, hvilket tyder på en sand biologisk population af disse proteiner i den kardiale kerner. 19
Desuden sammenlignede vi proteiner, vi fundet at være til stede i den syreekstraherede kromatin fraktion, at de forudsagte roller for disse proteiner ved gen ontologi. Vigtigere, er dette gen ontologi analyse ikke taget hensyn til den relative forekomst af de forskellige proteiner (ligesom vores Western blot data), men snarere tæller alle identificerede proteiner (berigeed eller ej), som lige når at identificere fælles veje og cellulære rum. Analyse af disse veje og cellulære rum kan findes i vores tidligere udgivelser. 18,20 Vigtigst af succes berigelse i syreekstraherede kromatin fraktion tilladt os at identificere tilstedeværelsen af 54 histon varianter i den voksne mus myocyt, 18 hvoraf mange har påberåbt sig en unik peptid til identifikation og således ville sandsynligvis ikke være blevet påvises uden denne berigelse protokol betragtning af den enorme kompleksitet af den samlede cardiomyocyte proteomet. Af de 1.048 proteiner, vi identificeret fra hjerte kerner, blev 56 af dem (5,3%) kommenteret af GO analyse til at være en del af den nukleosom (en bestanddel af kernen af interesse). En anden undersøgelse se på hele hjertet, identificeret 6180-proteiner, hvoraf kun 11 proteiner (0,18%) blev kommenteret som en del af den nukleosom 21. Denne yderligere illustrerer styrken i vores protokol til meaningfully berige for kerneproteiner.
5. Protein Gel og Enzymatisk Protein Digest
Proteiner adskilles ved endimensional SDS-PAGE og trypsin fordøjet til at blive kørt på massespektrometer.
- Tø prøverne på is og bestemme proteinkoncentrationen for hver prøve ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) protein-assay.
- Fortyndes prøver til en kendt koncentration med 5 x Laemmli-puffer, og der koges i 10 minutter og opbevares ved -20 ° C i en-dimensionel SDS-PAGE. Fortyndes prøver til en kendt koncentration ved hjælp af urea ekstraktionsbuffer og opbevares ved -20 ° C i to-dimensionelle geler.
- Køre gel af valg lastning samme mængde protein i hver bane. Protein kan overføres til en nitrocellulosemembran, der skal anvendes til Western blotting (som med kontrollen i trin 4.1) eller bånd kan skæres til massespektrometrianalyse, se følgende trin.
- Fjern gel fra apparatet ved hjælp af deioniseret vand for at overføre det til en ren beholder.Cover gel i Oriole pletten, og wrap beholder i aluminiumfolie for at blokere lys. Tillad gelen at inkubere ved stuetemperatur på en ryster i mindst 90 min.
- Billede Oriole-farvet gel (Figur 3) ved hjælp af UV-lys, og mærke hvor bands vil blive skåret på billedet. Vi skar hver bane i ca 25 2-mm bånd til undersøgelser, der måler den samlede proteomanalyse.
- Anbring gel på en ren overflade. Brug kun materialer, der er blevet holdt forseglet eller sprøjtes med ethanol for at forhindre keratin forurening. Skåret ud hvert bånd, og derefter yderligere skær den i 3 lige store stykker. Placer alle tre stykker af hver band sammen i sit eget mærket 1,5 ml rør. Gelstykker kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder.
- Forbered gel stik for enzymatisk fordøjelse. Fordøje gelstykker ved hjælp af trypsin ved 37 ° C natten over. For detaljeret gelprøve protokol se vores tidligere publikation. 22 Du kan fordøje lavmolekylære bands med chymotrypsin i stedet for trypsin,at fjerne trypsin omfattende spaltning af histon haler.
6. Massespektrometri og Dataanalyse
Prøver adskilt på en LC og analyseres ved MS / MS. Spektrene er søgt mod et protein database for protein identifikation.
- Kør 10 pi af hver prøve ved LC / MS / MS. Vi anvender en nano-flow Eskigent LC med en 75 um kolonne med omvendt fase. Anvende et LC run optimeret til en række proteiner og peptider. Anvende en lineær gradient fra mobil fase A (0,1% myresyre, 2% acetonitril [ACN] i vand) til mobil fase B (0,1% myresyre, 20% vand i ACN): 60 min fra 5% mobil fase B til 50 % B, derefter 15 min fra 50% B til 95% B og til sidst 10 minutter ved konstant 95% B. Brug en strømningshastighed på 200 nl / min. Erhverve massespektrometridata i en data-afhængig mode. Vi anvender en Thermo Orbitrap at fragmenter de top 6 hyppigst forekommende moderioner.
- Gentag løber i mindst tre biologisk og to tekniske gentagelser. (RANBEFALET)
- Brug software (kommercielt tilgængelige muligheder omfatter BioWorks og Xcalibur,! Offentligt tilgængelige indstillinger omfatter strejftog, X Tandem, SpectraST) for at søge spektre mod UniProt database over valg via en søgealgoritme (såsom SEQUEST eller MASCOT).
- Overveje at ændre søgeparametre at give mulighed for cystein carbamidomethylation og methionin oxidation, to almindelige modifikationer skabt i løbet af prøve behandling.
- Beregne en falsk positiv rate ved hjælp af reverse databasesøgning.
- Filter protein identifikationer til kun at acceptere kampe i en tærskel tillid. Vi anbefaler følgende parametre til at starte med: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4), deltaCN> 0,1, konsensus score ≥ 20, masse tolerance 2 Da for moderionen, masse tolerance på 0,5 Da for produkt ion, savnet mindst 2 unikke peptider pr protein og ikke mere end 3 kløfter.
7. Label-free Kvantificering
Determine den relative forekomst af proteiner under anvendelse label-free kvantificering (fig. 4).
- En række programmer er offentligt eller kommercielt tilgængelige for etiket-fri kvantificering af massespektrometridata herunder Census (Prof. Yates 'gruppe), 23 Elucidator (Microsoft), 24 SIEVE (Thermo Scientific), 25 Stilladsklasse (Proteome Software). 26 Disse programmer har til formål at korrelere massespektrometrisk signal af intakte peptider eller antallet af peptidsekventering arrangementer med relative protein mængder mellem to eller flere stater.
- Mens hvert program omfatter en tilsvarende analyse rørledning, er nogle programmer begrænset til de former for specifik analyse, der kan udføres på dataene. Indledningsvis data fra forskellige kørsler på linie, er signalintensitet normaliseres og peptidtoppe er udvalgt til analyse.
- De to mest almindelige metoder er kvantificering baseret på spektral tælling eller LC-MS topareal. Abundancenøgletal er beregnet til at bestemme ændringer i peptid overflod mellem forskellige grupper.
- Disse programmer kan være forbundet med proteom søgealgoritmer (Mascot, Sequest, X! Tandem) at korrelere kvantificering information til protein identifikation.
- For at sikre nøjagtigheden og reproducerbarheden af de data, er det afgørende at inkorporere både biologiske (forskellige eksperimentelle prøver) og tekniske (kører den samme prøve på massespektrometer flere gange) gentagelser af massespektroskopi data.
- Variation af peptid overflod i og mellem eksperimentelle betingelser kan vurderes ved ANOVA og afbildet via PCA (figur 5).
Vigtige overvejelser for etiket-fri kvantificering. Ved udførelse af etiket-fri kvantificering, skal blive lagt særlig vægt på at sikre konsekvent prøveforberedelse, fordøjelse tid og LC-MS/MS betingelser som hver prøve skal behandles og analyseres separat. I modsætning til metabolic mærkning tilgange, sammenligninger i etiket-frie eksperimenter er lavet på data fra særskilte massespektrometri kører (fordi den manglende mærkning forebygger muligheden for at køre dem sammen), hvilket nødvendiggør høj reproducerbarhed i alle aspekter af analysen (dvs. prøve prep, LC og MS trin) og anvendelse af høj masse nøjagtighed massespektrometre.
At tegne sig for små ændringer i prøveforberedelse og analyse af en kendt standard kan sættes til hver prøve for at hjælpe med normalisering af data. Derudover fleste programmer tillader normalisering af signalintensiteter (f.eks ved at justere til baggrundsstøj eller en kendt rigelige analyt) efter dataindsamling for at tage højde for forskelle i injektion, ionisering og fragmentering. Justeringsalgoritmer i de fleste af de ovenfor nævnte softwareprogrammer, der medvirker til at korrigere forskelle i peptid-elueringsprofiler. Brugen af biologiske og tekniske replikater er essentiale i denne type undersøgelse, da det giver mulighed for statistiske analyser for at bekræfte reproducerbarhed og konsistens af de observerede ændringer i protein overflod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 fremhæver nytten af denne form for relativ kvantificering. Vises i venstre panel er de enkelte monoisotopic peptidtoppe (overlejret fra forskellige mus), som er blevet udpeget som hørende til proteinet HMGB1 (identificeret via databasesøgning). Hver top, hovedsagelig en ekstraherede ion chromatograf for den givne peptid, kommer fra en anden mus. Grupperne repræsenterer tre forskellige fysiologiske tilstande: basal, hjertehypertrofi og hjertesvigt, med tre biologiske replikater for hver gruppe. Ved at integrere arealet under kurven, kan en relativ overflod beregnes. I det midterste panel gennemsnittet af disse mængderne er vist. Det fremgår klart af denne type analyse, at den overflod af HMGB1 proteinet ændrer i løbet af sygdommen. Derimod viser bundpanelerne eksemplet med histon H4, der ikke ændrer sig med sygdommen. I begge tilfælde kommer peptider fra dyr af samme phenotypic tilstand viser lignende elueringsprofiler og relativ overflod, hvilket viser reproducerbarheden af prøveforberedelse og LC / MS / MS.
Reproducerbarheden af denne teknik bekræftes yderligere ved hjælp af hovedkomponentanalyse (PCA). Som vist i figur 5, anvendelse af ANOVA til de samlede proteommønstrene resultater af hvert dyr afslører en tydelig klyngedannelse ved hjertepunktur fænotype (biologisk replikater) med den snævreste associering mellem teknisk gentagelser (forskellig massespektroskopi løber i den samme prøve) fra samme dyr . Dette tilvejebringer tillid til, at mængden observerede ændringer for de enkelte proteiner af interesse er faktisk skyldes forskellen i den fysiologiske tilstand.
Af lige så stor betydning som kvantificering og reproducerbarheden af resultaterne er den øgede dækning af den nukleare proteom aktiveret som nuklear subfraktionering. Figur 6 illustrerer, at analysen af hele kerne alene undlader at afdække selv et flertal af de nukleare proteiner identificeret, når man kombinerer individuelle analyser fra de separate rum (1.048 unikke proteiner identificeret i alt i hele fraktionerne versus 428 identificeret fra den intakte kerner). Endvidere er de moderate overlapning mellem de forskellige fraktioner viser den biologiske relevans overvejer disse rum individuelt for tilsat indsigt i nukleare funktion og genregulering. Endelig evnen til specifikt at fraktionere syre-ekstraheret eller detergent-ekstraheret chromatin beriger for de vigtigste chromatin strukturelle proteiner, såsom histoner, hvorved mere fokuserede massespektrometriske analyser (såsom dem, der retter posttranslationelle modifikationer) på en gruppe af proteiner uden kræver specifikke antistoffer for hver variant og isoform.
94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
Figur 1. Flowdiagram til karakterisering af proteiner i kardielle nukleare sub rum. Hele mus hjerter homogeniseres og lysatet beriget med kerner. Kerner er fraktioneret i nucleoplasm, vaskemiddel-ekstraheret kromatin, og syreekstraherede kromatin fraktioner. Proteiner fra hver isoleres og adskilt ved en-dimensionel SDS-PAGE, og båndene trypsin spaltede og køre ved LC / MS / MS. Efter databasesøgning, er label-free kvantificering anvendes til at identificere overflod tendenser for proteiner i de forskellige fraktioner.
Figur 2. Nuklear fraktionering skematisk. Kerner beriget fra hele hjertet homogenat via en saccharosegradient. Hver kerner prøve kan enten adskilles i nucleoplasm og detergent-ekstraherede fraktioner eller i en acid-ekstraheret fraktion som beriger for histoner.
Figur 3. Endimensional gel af de forskellige fraktioner. 20 ug hele hjertet lysat (WHL), intakte kerner (Nuc), nucleoplasm (nup), detergent-ekstraheret chromatin (DE), og syreekstraherede kromatin (AE) fraktion fra muse hjerte blev kørt på en endimensional SDS-PAGE gel (12% acrylamid) samt syreekstraherede kromatin fraktion fra HeLa-celler og farvet med Oriole. Den anden mønsterdannelse af overflod af totalt protein på de forskellige molekylvægte viser forekomsten af unikke proteomes for forskellige undergrupper rum, herunder berigelse for de lavere molekylvægt histoner i detergent-ekstraheret chromatin som er yderligere beriget med den syre-ekstraherede fraktioner . Også at bemærke er det væsentligt mindre kompleks karakter af AE fraktion fra HeLa celles i sammenligning med fra hjertet.
Figur 4. Relativ overflod kvantificering Mus fra tre forskellige hjerte lyder:. Basal (blå) hypertrofi (rød) og fiasko (grøn) blev opsamlet i tre eksemplarer og deres protein prøver kørte i to teknisk replikater ved LC / MS / MS. Vist til venstre er de monoisotopic toppe for et specifikt peptid (hvis spektre er vist til højre). Relativ overflod blev beregnet ved integration og gennemsnit mellem replikater af hver fænotypisk tilstand (midterste panel) til at sammenligne den relative forekomst af peptidet (og protein, hvorfra den kom) i de forskellige stater i hjertesvigt. Det øverste panel viser et peptid fra HMGB1, hvis tæthed ændres i sygdommen, medens bundpladen (histon H4) ikke ændrer. Klik her for at se større figur .
Figur 5. Principal komponent analyse afslører reproducerbarhed. ANOVA-analyse for hver mus (3 biologisk gentagelser / hjerte-state x 2 teknisk replikater) afbildet for peptid intensitet (akser) viser gruppering af sygdom tilstand (basal i blå, hypertrofi i rød, svigt i grønt), som indikerer en succesfuld reproducerbarhed af massespektroskopi data og vigtige fysiologiske forskelle mellem de forskellige sygdomstilstande.
Figur 6. Global karakterisering af forskellige nukleare sub rum. Vi identificerede 1.048 i alt unikke proteiner på tværs af alle 4 frhandlinger. 146 proteiner blev fælles for alle fire fraktioner, sammenlignet med 749-proteiner identificeret i nucleoplasm, 380 i detergent-ekstraheret kromatin fraktion, 426 i syreekstraherede chromatin fraktion og 428 i den intakte kerner. The Venn-diagram afbilder moderate overlapning identificerede proteiner mellem fraktionerne, som fremhæver tilstedeværelsen af særskilte regioner in vivo og evnen hos denne fraktionering for at isolere dem. Derudover markant ufuldstændige karakterisering af den samlede nukleare proteom kan opnås ved kun at analysere ufraktioneret kerner (orange) er grund til yderligere fraktionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To primære fremgangsmåder til nuklear isolation er gennemgået tidligere: 27 ene er den Behrens teknik homogenisering lyofiliseret væv i et ikke-vandigt opløsningsmiddel, og den anden, en modifikation, som vi bruger her, for at homogenisere vævet i en vandig saccharose / saltopløsning efterfulgt ved differentiel eller densitet-gradientcentrifugering.
Subfraktionering af kernerne ved syreekstraktion på vævsprøver er et vigtigt redskab til undersøgelse af kromatin, som har været anvendt siden 1960, 28 med det originale mål er at analysere histoner. Syre-udvinding protokoller blev udviklet til dette mål at rense centrale nucleosomal histoner komponenter 29 En begrænsning af disse tidligere undersøgelser er et fravær af oplysninger om de ikke-histon proteiner, der udgør, og ændre, chromatin. Har vi taget denne udfordring op med den nuværende protokol til karakterisering af forskellige biologiske subfractions af kernen og kromatin.Denne tilgang, som bruger detergentekstraktion eller sure ekstraktion af kromatin i parallel, afslører mangfoldigheden af chromatin regulatoriske molekyler og skelner mellem niveauer af endogent regulering, hvorved den tjener som en robust tilgang til hypotese generation.
Anvendelse af den etablerede syre-ekstraktion metode til den voksne myocyt rejser visse forhindringer, herunder den tætte cytoskelet og store mitokondrie befolkning. Mens versioner af syre-ekstraktion er blevet anvendt på hele hjertevæv 30 forsøgene er udført på en målrettet måde at studere kendte proteiner, den nuværende protokol er designet og er blevet udført for at muliggøre uvildig proteomanalyse. Desuden har vi fundet det gavnligt at undersøge detergent-ekstraheret og syreekstraherede kromatin separat (kun 37% overlap blev observeret mellem de proteomes af disse to fraktioner) til bedre at forstå den dynamik, hvorigennem disse populationer af kromatin proteiner interact med DNA. Andre protokoller anvender urinstof-baserede buffere er også blevet beskrevet, 31,32, som udføres før syreekstraktion, berige proteiner mindre tæt bundet til genomet. Ud over chromatin fraktioner, har andre subfractionated kernen for at isolere nucleolus, 33 men subfraktionering for massespektrometrianalyse af myocardial kerner isoleres fra hele hjerter er ikke blevet rapporteret.
Shotgun proteom undersøgelser af intakte kerner det vil sige, ufraktionerede organeller, er blevet udført på myocardievæv ved hjælp af en MudPIT tilgang. 15 Dette studie identificerede 1.044 nukleare hjerte proteiner, i samme omfang som vores protokol, men baserede sig på ved hjælp af en gennemsnitlig 8,5 replikater, med hver kørsel varede 20 timer til påvisning af lav overflod proteiner. I modsætning hertil er ansat vi subfraktionering, til både at forøge antallet af identificerbare proteiner (uden at behøve langvarig kromatografi-vore LC kører er 85 min), mens indførselntly også tilbyde yderligere biologiske oplysninger om den sub-nukleare lokalisering og relative rigelighed af proteinerne.
Fra en hel mus hjerte (ca. 0,14 g) vi komme cirka 1,2 mg (0,85% af totalen) af protein i intakte kerner. Fra den intakte kerner vi opnår følgende genopretning for hver af de subfractions (Bemærk: de samlede værdier overstige 100% som syre-ekstraktion og detergent-ekstraktion er færdig på separate hjerter, ikke i serie): Nucleoplasm (15%), detergent- ekstraheret chromatin (85%), og syreekstraherede kromatin (54%). Til sammenligning har Thermo Scientific et kit (NE-PER kerneregioner og cytoplasmiske reagenser), som deres datablad siger udbytter 1.6mg cytosoliske protein og 0,6 mg kerneprotein (1,5%) fra 40 mg muse hjerte med en 10% krydskontaminering mellem de to fraktioner. Sigma har en kit (NXTRACT, CellLytic Nuclear Extraction Kit), som de har testet på kaninmuskel, men ikke hjertet, og udvindes fra 100 mg væv 0,46 mg kerneprotein (0,46%) i det, de kalder deres "rå kernepellet" med en "få procent" af cytoplasmatisk forurening. Andre virksomheder, såsom Epigentek tilbyder også kits, men vi var ikke i stand til at finde specifikke oplysninger om berigelse og renhed på deres hjemmesider til sammenligning.
Vi har beskrevet en hidtil ukendt teknik til behandler det nuværende behov for en vellykket berigelse af hjertets kerner for proteomik-undersøgelser. Vi beskriver yderligere metoder til sub rum fraktionering, som både øger evnen til at detektere mindre forekommende proteiner og giver mulighed for højere opløsning, kvantificering og bestemmelse af protein lokalisering. Med henblik herpå giver protokollen for massespektrometrianalyse anbefalede retningslinjer, men sag-til-sag overvejelser vil sandsynligvis være nødvendig. For eksempel fandt vi, at det store antal hjerte-histon variant isoformer med sekvenslighed kræves manuel inspektion af spektre til at tildele maJOR tinder og bekræfte moderionen masse, før de kan trygt tildele spektrene. 14 Søgeparametre kan også tilpasses til post-translationel modifikation (PTM) identifikation og fremragende anmeldelser findes beskriver metoder og bekymringer ved at fortolke data for PTM-analyse (herunder PTM berigelse , 34 software til PTMS 35 analyse af kombinatoriske PTMS 36 alternative fragmentering strategier 37 og alternative fordøjelse og forarbejdning 38,39).
Berigelse og fraktionering beskrevne er fra hele hjertet (som er 50-70% cardiomyocyte efter masse). Mens denne ofre aspekter af cellespecificitet som kan være særligt vigtigt for visse arter kerneproteiner, giver det mulighed for en langt hurtigere suspension af proteinerne i passende buffere, hvilket ikke er muligt med voksne myocytter celleisolering protokoller. På denne måde bedre denne metode bevarer integriteten of prøven mod nedbrydning. Men også beskrevet er instruktioner for anvendelsen af denne protokol til isolerede nyfødte rotter ventrikulære myocytter, da begge isolerede-celle og hel organisme modeller er nødvendige værktøjer til at studere hjertesvigt. I princippet denne fremgangsmåde også kan anvendes til voksne myocytter ekstraheret ved enzymfordøjelse fra isolerede hjerter-med det forbehold, at ændringer i protein-binding, som opstår under isoleringen (som kan vare over en time) vil forvirre fortolkning af proteom observationer.
Vi har udviklet denne metode til at forstå de ændringer i den nukleare proteom og chromatin makeup, der bidrager til sygdom. 14 Men andre anvendelser omfatter studere stimulus-specifikke ændringer i proteom komposition i normal fysiologi. Desuden sub-fraktionering giver mulighed for et nyt niveau af karakterisering af hvordan proteinerne fungerer og lokalisere tværs af forskellige funktionelle regioner i kernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den Vondriska lab er støttet af tilskud fra National Heart, Lung og Blood Institute of NIH og Laubisch Endowment på UCLA. EM er modtager af Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi ved UCLA, HC er modtageren af en American Heart Association Pre-ph.d Fellowship, MP er modtageren af en NIH Ruth Kirschstein Post-ph.d. stipendium, og SF er modtageren af en NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
