Summary
질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수 있습니다
Abstract
핵에서 누구 기능을 가장 밀접한 유전자 조절과 연결되어 proteomes을 거주. 성인 포유류의 cardiomyocyte의 핵은 binucleated 세포의 높은 비율 1 DNA의 주로 heterochromatic 상태에 따라 고유하며, 개발 중에 계면의 영구적 인 상태에 성인 핵을 렌더링 cardiomyocyte의 비 분리 자연 2. 전사 규제와 병은 잘이 단백질이 질병 중에 발생하는 전사 프로그램에 변경 사항을 관리하는 방법이 오르간, 3-5에서 공부하지만 상대적으로 미개척 남아는 DNA 포장과 표현에 대한 책임 핵 단백질에 의해 연주 역할이며,되었습니다. 6 개발에 세계 심장 질환은 남성과 여성 모두에 대한 사망률의 최고의 원인입니다. 핵 단백질이 질병의 진행을 조절하는 협력 방법에 대한 일곱 통계는 현재 치료 O를 발전을위한 중요합니다습니.
질량 분석법은 병 어떻게 이러한 단백질의 풍부한 변경을위한 핵 프로테옴와 상대 정량화의 편견 주석을 허용 이러한 문제에 대응을위한 이상적인 도구입니다. 최근까지 포유류의 핵 단백질 단지, 8-13 여러 proteomic 연구가되어있는 동안 14 심장 핵 프로테옴을 검토 한 연구가있다, 그것은 오히려 핵 하위 구획의 수준에서 프로테옴을 둘러보다, 전체 핵을 고려 . 많은 부분에서 15 일이 부족 심장 핵을 분리의 어려움 때문입니다. 심장 핵은 myocyte 수축 변하는 자신의 전반적인 모양. 16 또한, cardiomyocytes 볼륨 17으로 40% 미토콘드리아이라는 범위, 그들이 endoplasmic 소포체에서 여러 확장을 통해 연결되어 할 수있는 강성과 고밀도 고를 - 마이 오신 장치에서 발생하는 necessita다른 세포 소기관에서 떨어져 핵의 농축 tes. 여기 생물학적 관련성이 높은 구획에 심장 핵 농축 및 추가 분류를위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 신진 대사 라벨이 적합하지 않을 다양한 동물 모델 및 장기 시스템의 생체 실험의 의무 분수는 - 기술의 라벨이없는 정량 대량 spectrometric 해부에 대한 세부 방법.
Protocol
실험 워크 플로우 일곱 주요 단계 (그림 1)가 포함되어 있습니다. 질량 분석계에서 실행됩니다 샘플을 포함한 모든 작업은 실험은 실험실 코트, 장갑, 헤어 넷을 착용, 먼지, 각질의 개인 흘림의 오염을 방지하기 위해주의를 기울여야한다.
1. 심장 균질화 및 핵 절연
마우스 마음이 균질하고 그대로 핵 펠릿은 (그림 2) 절연되어 있습니다.
- 성인 마우스를 희생 소비세 심장, 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어, 2 ML을 포함하는 (우리가 피셔의 휘튼의 조직 그라인더, # 08-414 - 13A을 선호하지만, 다른 방법 동등하게 잘 작동 할 수 있습니다) 유리 다운스 호 모지 얼음 속에서 균질화 용해 버퍼 (10 MM 트리스 산도 7.5, 15 MM NaCl, 그리고 0.15 % V / V Nonidet P-40 [NP-40] 탈 이온수의 플러스 (differentially 핵을 포함한 세포 소기관으로 세포 멤브레인을 lyses hypotonic 솔루션)의 단백 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 전nhibitor 혼합 : 10 MM 나트륨 부티르산, 0.1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 플루오르 화 [PMSF], 0.2 MM 3 VO 4, 0.1 MM NaF 1 로슈 단백 분해 효소 pellet/10 ML 오세영 - 용해 버퍼는 -20 ° C에서 일주일에 저장할 수 있습니다 ). (참고 : 우리는 우리의 질량 분광법 데이터로, PBS로 마음을 perfuse 할 필요 찾아 분석 주로 cardiomyocyte 혈액 오염과 반대로 원점에서 [P-값은 3.8E-22] [P 값은 5.0으로 단백질을 식별하지 마 E-2].)
- 100 μm의 스트레이너를 통해 lysate를 넣어 및 1.5 ML의 원심 분리기 관을 통해 흐름을 수집합니다. 명시하지 않는 한이 시점에서, 샘플은 얼음에 보관해야합니다.
- 4 ° C.에서 5 분 4,000 rpm으로 원심 분리기
- 표면에 뜨는 제거합니다. (이것은 세포 기질이며, -80에 저장해야합니다 ° C.이 lysed 미토콘드리아가 포함되어 있습니다.) Resuspend 펠릿은 triturating로 200 μl 용해 버퍼 인치 (이것은 원유 핵 펠렛입니다.)
- 자당 광 1 ML과 1.5 ML의 원심 분리기 튜브 채우기어 (24 % 자당 중량 / 부피, 10 MM 트리스 산도 7.5, 및 단백 분해 효소 / 인산 가수 분해 효소 억제제의 혼합과 탈 이온수에 NaCl 15 MM - 자당 버퍼는 사용의 일에 신선한하여야한다). 4 ° C.에서 10 분 5,000 RPM에서 자당 패드와 원심 분리기 상단에 부드럽게 층 resuspended 펠릿을
- 상단에 박막뿐만 아니라 자당 패드를 (막을 포함)을 제거합니다. 200 μl 얼음처럼 차가운 PBS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 1X PBS)에 남아있는 펠릿을 씻어. (이것은 핵 펠릿이며, blotting 서쪽이나 전자 현미경에 사용하기 위해 solubilized 또는 고정 할 수 있습니다 [단계 4.1 및 4.2보기] 농축을 수량화 할 수 있습니다.)
2. Nucleoplasm와 세제 - 추출 염색질 분획
원유 핵 펠릿은 느슨하게 DNA와 연관된 단백질을 포함 nucleoplasm 및 세제 - 추출 염색질 분수로 구분됩니다.
- 200 μl 세제 추출 버퍼 (2 단계 1.6에서 펠릿을 씹다0 MM HEPES 산도 7.6, 7.5 MM MgCl 2. 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 30 MM NaCl, 1 M 우레아, 1 % 프로테아제 / 인산 가수 분해 효소 억제제의 혼합과 탈 이온수의 NP-40 - 세제 추출 버퍼)는 -20 ° C에서 일주일에 저장할 수 있습니다.
- 와류 샘플 2 회, 10 초마다. 얼음 10 분에 장소.
- 4 ° C.에 5 분에 13,000 rpm으로 원심 분리기
- 표면에 뜨는 제거합니다. (이 nucleoplasm이며, -80 ° C에서 보관해야합니다.) 얼음처럼 차가운 PBS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 펠릿을 씻어. (이것은 염색질 펠렛입니다.)
- 트리스, SDS, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 버퍼에 일주일에 유지 될 수 - 300 μl 트리스, SDS, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 (50 MM 트리스 산도 7.4, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 프로테아제 / 인산 가수 분해 효소 억제제의 혼합과 탈 이온수에 1퍼센트 SDS에 펠릿을 씹다 -20 ° C).
- 10 초마다 DNA를 깨까지 3-6 시간을 Sonicate. sonications 사이의 얼음에 샘플을 보관.
- 4 ° C.에 5 분에 13,000 rpm으로 원심 분리기 표면에 뜨는세요. (표면에 뜨는는 세제 - 압축을 푼 염색질 단백질 fractio입니다N과는 -80 ° C)에서 보관해야합니다. 나머지 펠렛 작은 있어야하고 폐기 할 수 있습니다.
- 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Dulbecco 수정 독수리 중간 (DMEM), 1 %의 인슐린의 문화 다음 효소 소화을 사용하여 출산 후 쥐의 새끼 일일부터 신생아 쥐의 심실 근세포를 분리 : 대신 전체 심장의 절연 근세포를 사용하는 경우 - 트랜스페린 - 나트륨 selenite (ITS) 및 1% 페니실린. 24 시간 후 혈청이없는 미디어 (위와 동일하지만, FBS이 부족한)로 전송할 수 있습니다. 수확 용해 버퍼의 셀 (1.1에 나와있는), 그리고 단계 1.3에서 핵 분획을 시작합니다.
3. 산 추출 분획 - DNA 바인딩 단백질 농축
histones 포함 단단히 DNA에 바인딩 단백질에 대한 별도의 분획 확장합니다.
- 단계 1.1-2.4를 반복합니다.
- 0.4 N의 황산 산 400 μl에 염색질 펠릿을 씹다. clumps을 제거 할 와동.
- 30 분이나 overn에 대해 4 ° C에서 알을 품다항공 회전하는 동안.
- 4에 10 분에 16,000 XG에서 원심 분리기 ° C 핵 오염 물질을 제거 할 수 있습니다.
- 새로운 튜브로 표면에 뜨는 전송합니다.
- trichloroacetic 산의 132 μl 표면에 뜨는에 드롭 현명를 추가합니다. 여러 번 반전. 30 분에 얼음에 품다.
- 4 ° C.에 10 분에 16,000 XG에 원심 분리기
- 표면에 뜨는 폐기하십시오. 부드럽게 얼음처럼 차가운 아세톤으로 펠릿을 씻어. (이 히스톤 펠렛입니다.)
- 4 ° C.에 10 분에 16,000 XG에 원심 분리기
- 세탁을 반복, 3.8-3.9이 단계를 반복합니다.
- 공기 건조 펠릿.
- 트리스, SDS, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 100 μl의 펠렛을 Resuspend. 1 M 트리스을 추가하여 8 pH를 설정합니다. (산도 - 조정되지 않는 1 M 트리스 주식을 사용합니다.)
- 15 분에 물을 욕조에 Sonicate. 물 목욕에 얼음을 추가하여 과열 방지합니다. (이 산 추출 분획이며, -80 ° C.에 저장해야합니다)
4. 순도 확인
서양 blots 및 전자 현미경핵 및 다른 세포 소기관의 고갈을 성공적으로 농축를 확인합니다. 다음과 같은 품질 관리 assays의 모든 전형적인 결과를 확인하려면 이전 게시를 참조하십시오. 18
- 서양 얼룩 분석을 수행합니다. 히스톤 H2A 또는 nucleoporin p62 (농축을 확인하기 위해 핵 마커 등),와 아데닌 뉴클레오티드 전송, bip (빨리) 및 tubulin (mitochondrial 마커, endoplasmic 소포체 마커, 각각 순결을 확인 cytoskeletal 마커 등) 각 일부를 포함하는 프로브 막. 히스톤 H3 또는 fibrillarin (세제와 산성 - 압축을 푼 염색질과 그대로 핵) 및 SNRP70 또는 E2F (nucleoplasm)에 대한 핵, 프로브의 성공적인 subfractionation를 확인합니다. retinoblastoma 또는 hypoxia inducible 인자-1 (산 추출 분획을 통해 세제 - 추출 염색질에 풍부)를 프로브. HELA 세포 lysate와 전체 심장 lysate의 추가 제어 샘플은 동일한 젤에서 실행 할 수 있습니다 트리스, SDS, ED를 추가하여 HELA 세포 lysate 제어 준비배양 접시 및 샘플을 수집 할 셀 스크레이퍼를 사용하여 TA 버퍼. Sonicate 및 단계 2.6-2.7에서와 같이 샘플을 원심 분리기. 2 ML 버퍼 (20 MM 트리스 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM EGTA, 1 % 트라이 튼 X-100, 2.5 MM 나트륨 피로 인산, 탈 이온수 1 밀리미터 glycerophosphate에 마음을 homogenizing하여 전체 심장 lysate 제어 준비 단백 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제 혼합물 포함)를 입력합니다. Sonicate 및 단계 2.6-2.7에서와 같이 원심 분리기. SDS-PAGE에 대한 단백질 샘플을 준비하기위한 5 단계를 참조하십시오.
- 전자 현미경 : 2 % 글루 테르 알데히드를 포함하는 용해 버퍼에 단계 1.6에서 핵 펠렛을 Resuspend와 4에서 샘플을 해결 ° C. osmic 산에서 샘플을 씻어, 탈수 및 에폭시 수지에 삽입 할 수 있습니다. 라이 Ultracut ultramicrotome를 사용하여 70 nm의 슬라이스를 잘라. JEOL 100CX 전송 전자 현미경을 사용하여 uranyl 아세테이트하고 납과 이미지 샘플을 청바지. 이미징 재료의 총 면적 대 그대로 핵의 영역을 측정하여 농축을 수량화. 우리가 핵의 60~80%를 찾을 수그대로합니다. 14
핵을 풍요롭게 대 정화에 중요한 고려 사항은.이 프로토콜은 질병 기간 동안 글로벌 유전자 조절 과정을 공부하기위한 목적으로 심장 염색질의 proteomic 분석을 가능하게하기 위해 개발되었습니다. 전체 - 프로테옴 질량 분광법 실험을 디자인의 주요 구성 요소는 동적 범위와 낮은 풍부한 단백질을 식별하고 특성화 할 수있는의 문제입니다. 핵의 추가 subfractionation이 그렇듯 핵 프로테옴에 대한 풍부, 원자력 및 염색질 특정 생물에 대한 정보를 제공하는 기본 목적뿐만 아니라, 이러한 낮은 풍부한 단백질을 검출 likeliness을 증가시킵니다. 논의 그러나, 성인 cardiomyocyte은 핵 막에 연결된 조밀 cytoskeletal 구성 요소가 있습니다. 우리는 완전히 다른 세포 구성 요소의 핵을 정화 한 믿을 수 없어. 그러나, 핵 만 풍부하여, 우리는 얻을 수 있습니다에드는 분석의 유형을 활성화 할 수있는 허용 기준 액은 설명했다.
특히, 우리는 우리의 원유 핵 펠릿의 순수성을 평가하기 위해 EM을 사용하고 그대로 약 10% 미토콘드리아 핵, 그리고 나머지 쓰레기로 분수의 60-80%을 발견했습니다. 또한, 우리는 그대로 핵 인구에 우리의 이전 연구에서 알고 많은 근육 섬 유지는이 프로토콜 특정 단백질 (calsarcin-1) 풍부한 아르 (서양에 의해 측정으로 tubulin과 고를 포함)의 진정한 생물 인구를 제안하여 풍부하지 않고도 심장 핵에서 이러한 단백질. 19
또한, 우리는 유전자 온톨로지의 이러한 단백질의 예측 역할, 산 - 압축을 푼 염색질 분획에 존재하는 것으로 단백질을 비교했다. 중요한 것은,이 유전자 온톨로지 분석 계정을 다른 단백질의 상대적 풍부한 (우리의 서양 얼룩 데이터를 수행 한 경우)는 고려하지 않습니다 오히려 판단되는 모든 단백질을 (풍부 계산동등하게 에드 여부) 일반적인 경로와 세포 구획을 식별. 이러한 경로 및 세포 구획의 분석은 우리의 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다. 18,20가 가장 중요한 산 - 압축을 푼 염색질 분획의 농축의 성공은 우리가 성인 마우스 myocyte 54 히스톤 변형의 존재, 18을 식별 할 수 그 중 많은 사람들이 식별 하나의 고유 한 펩타이드에 의존,이 농축 프로토콜 총 cardiomyocyte의 프로테옴의 엄청난 복잡성을 부여하지 않고 따라서 가능성이 감지되지 않았을 것입니다. 우리가 심장 핵에서 확인 된 1,048 단백질의, 그들 중 56 (5.3 %) nucleosome의 일부 (관심의 핵심 중 하나의 구성 요소)으로 분석을 GO로 주석했다. 온 마음을보고 또 다른 연구는 만 11 단백질 (0.18 %)은 nucleosome 21의 일부가 될 수 주석이 있었다 중, 6180 단백질을 확인했습니다. 이 더는 meaningfu 우리의 프로토콜의 힘을 보여줍니다베드로 핵 단백질에 대해 더욱 돋보이게합니다.
5. 단백질 젤 및 효소 단백질 다이제스트
단백질은 질량 분석기에서 실행되는 소화 1 차원 SDS-PAGE와 트립신에 의해 구분됩니다.
- 얼음에 샘플을 해동하고 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석을 사용하여 각 샘플에 대한 단백질 농도를 결정한다.
- 한 차원 SDS-PAGE에 -20 ° C에서 10 분, 가게에 5 배 Laemmli 버퍼, 종기를 사용하여 알려진 농도에 샘플을 희석. 2 차원 젤에 -20 ° C에서 우레아 추출 버퍼와 스토어를 사용하여 알려진 농도에 샘플을 희석.
- 각 차선 단백질의 동등한 양을로드 선택의 젤을 실행합니다. 단백질은 서양이 blotting합니다 (단계 4.1 컨트롤) 또는 밴드가 대량 분광 분석에 절단 할 수 있습니다에 사용되는 니트로 셀룰로스 막으로 전달 될 수있다; 다음 단계를 참조하십시오.
- 깨끗한 용기에 전송하는 탈 이온수를 사용하여 장치에서 젤을 제거합니다.아오리에서 젤 착색하고, 빛을 차단하는 알루미늄 호일에 포장 컨테이너를 다룹니다. 젤은 적어도 90 분에 쉐이커에 실온에서 배양 할 수 있습니다.
- UV 빛, 그리고 밴드는 이미지를 잘라내 될 것 상표를 사용하는 이미지 아오리 - 스테인드 젤 (그림 3). 우리는 전체 프로테옴을 측정하는 연구를위한 약 25 2 mm 밴드로 각 차선을 잘라.
- 깨끗한 표면에 젤을 삽입합니다. 밀봉 보관 된 또는 각질 오염을 방지하기 위해 에탄올을 분무 만 자료를 사용합니다. 각 밴드를 잘라 후 추가로 3 동등한 조각으로 갈라. 자신의 표시 1.5 ML 튜브에 함께 각 밴드의 세 조각을 놓으십시오. 젤 조각은 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 효소 소화에 젤 플러그를 준비합니다. 다이제스트 겔 조각 37 ° C 하룻밤에 트립신을 사용합니다. 자세한 겔 샘플 프로토콜의 이전 게시를 참조하십시오. 22 당신 트립신 대신에 키모 트립신과 낮은 분자량 대역을 소화 할 수히스톤 꼬리의 트립신의 광범위한 절단을 제거 할 수 있습니다.
6. 질량 분석법 및 데이터 분석
샘플은 LC에서 분리되어 MS / MS에 의해 분석됩니다. 스펙트럼은 단백질 식별을위한 단백질 데이터베이스에 대해 검색됩니다.
- LC / MS / MS를 통해 각 샘플의 10 μl를 실행합니다. 우리는 75 μm 역 위상 열을 나노 흐름 Eskigent LC를 사용합니다. 단백질과 펩티드의 범위에 최적화 된 LC 실행을 사용합니다. 모바일 단계에서 선형 그라디언트를 고용 A (0.1 % 개미의 산, 2 % 아세토 니트릴 물에 [ACN]) 모바일 상 B (0.1 % 개미의 산, ACN 20 %의 물)에 : 5 % 모바일 상 B 50-60 분 %의 B 한 다음 50 % B에서 95 % B 15 분, 지속적인 95% B.의 마지막 10 분은 200 NL / 분의 유량을 사용합니다. 데이터에 의존 모드에서 질량 분광법 데이터를 수집. 우리는 최고 6 가장 풍부한 부모 이온을 조각 온도 Orbitrap을 사용합니다.
- 반복 적어도 세 생물에 대한 실행과 두 기술은 복제합니다. (Recommended)
- 검색 알고리즘 (예 : SEQUEST 또는 마스코트 등)를 통해 선택의 Uniprot 데이터베이스에 대해 스펙트럼을 검색 할, (공개적으로 사용할 수있는 옵션이 배회을 포함, X 직렬, SpectraST! 상업적으로 이용 가능한 옵션은 BioWorks과 Xcalibur 포함) 소프트웨어를 사용합니다.
- 시스테인 carbamidomethylation과 메티오닌 산화, 샘플 처리하는 동안 생성 된 두 가지 일반적인 수정을 할 수 있도록 검색 매개 변수를 수정 해보십시오.
- 역 데이터베이스 검색을 사용하여 거짓 긍정적 인 속도를 계산합니다.
- 임계 신뢰 일치 만 허용하는 단백질 식별을 필터링 할 수 있습니다. 우리는 시작하려면 다음 매개 변수를 권장합니다 Xcorr> 3 (+2)> 4 (+3)> 5 (+4), deltaCN> 0.1, 합의 점수 ≥ 20, 부모 이온에 대한 질량 허용이 다, 대량 허용 제품 이온 0.5 다의, 적어도 2 개의 고유 단백질 당 펩티드와 더 이상보다 3 cleavages을받지 못했습니다.
7. 라벨이없는 Quantitation
Dete레이블 무료 quantitation (그림 4)를 사용하여 단백질의 상대적 풍요 로움을 rmine.
- 소프트웨어 프로그램의 수는 인구 조사 (교수 예이츠 '그룹), 23 Elucidator (마이크로 소프트), 24 체 (열 과학), 25 비계 (프로테옴 소프트웨어)를 포함하여 대량 분광 데이터의 레이블 무료 quantitation에 공개적으로 또는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 26 이 프로그램은 그대로 펩티드 또는 둘 이상의 국가 사이의 상대적 단백질 수량과 펩타이드 시퀀싱 이벤트의 수의 질량 spectrometric 신호를 상관 관계하는 것을 목표로하고 있습니다.
- 각 프로그램은 유사한 분석 파이프 라인을 포함하지만, 일부 프로그램은 데이터에 수행 할 수 있습니다 특정 분석의 유형으로 제한됩니다. 처음에는 서로 다른 실행에서 데이터가 정렬되어, 신호 강도가 표준화되어 있으며 펩타이드 봉우리는 분석을 위해 선택됩니다.
- 가장 일반적인 두 가지 방법은 스펙트럼 계산 또는 LC-MS 피크 지역에 따라 정량화 있습니다. 풍부비율이 다른 그룹 간의 펩타이드 풍부한의 변화를 결정하기 위해 계산됩니다.
- 이 프로그램은 단백질 식별을 정량화 정보를 상관 관계를 규정하는 proteomic 검색 알고리즘 (마스코트, Sequest, X! 직렬)와 인터페이스 할 수 있습니다.
- 이 두 생물 (다른 실험 샘플) 기술을 (질량 분석기 여러 번에 동일한 샘플을 실행) 포함 할 중요 데이터의 정확성과 재현성을 보장하려면 질량 분석기 데이터를 복제합니다.
- 와 실험 조건 사이의 펩타이드 풍요의 변화는 ANOVA에 의해 평가 및 PCA (그림 5)를 통해 꾸몄다 할 수 있습니다.
라벨 무료 quantitation에 대한 중요한 고려 사항이 있습니다. 라벨 무료 quantitation를 수행 할 때 특정주의는 각 샘플이 처리 별도로 분석해야 일관성 샘플 준비, 소화 시간 및 LC-MS/MS 조건을 보장하기 위해 부여해야합니다. 메트로폴리스 대조적으로(라벨의 부족이 함께이를 실행의 가능성을받지 않으려면 때문에) abolic 분류 방법, 라벨이없는 실험의 비교는이를 (샘플 시험을 치루의 예, 샘플 분석의 모든면에서 높은 재현성을 necessitating, 고유 질량 분광법 실행의 데이터에 이루어집니다 LC 및 MS 단계)과 높은 질량 정확도 질량 분석기의 사용.
샘플 준비 및 분석 알려진 표준에 약간의 변화를 설명하기 위해 데이터의 정상화에 도움을 각 샘플에 추가 할 수 있습니다. 또한 대부분의 소프트웨어 프로그램은 사출, 이온화 및 조각의 차이에 대한 계정 데이터 수집 후 신호 강도의 정상화 (배경 소음이나 알려진 풍부한 analyte를 조정하여 등) 할 수 있습니다. 정렬 알고리즘은 펩타이드 용출 프로파일의 차이를 해결하는 데 도움 위에 참조 된 소프트웨어 프로그램의 대부분에 존재합니다. 생물 및 기술 복제의 사용은 에센 (Essen)입니다이 통계 분석은 단백질 풍부한에서 관찰 된 변화의 재현성과 일관성을 확인 할 수 있으므로, 학습이 유형의 tial.
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Representative Results
그림 4는 상대적으로 정량화이 양식의 유틸리티를 강조 표시합니다. 왼쪽 패널에 표시되는 단백질 HMGB1 (데이터베이스 검색을 통해 확인)에 속하는 것으로 지정되어 개별 monoisotopic 펩타이드 피크는 (다른 마우스에서 중첩)입니다. 각 피크는 기본적으로 주어진 펩타이드에 대한 추출 이온 크로마토 그래프는 다른 마우스에서 제공합니다. 세 생물 각 그룹에 대한 복제와 함께 기초, 심장 비대 및 심장 마비 :이 그룹은 세 가지 생리 상태를 나타냅니다. 곡선 아래 영역을 통합함으로써, 상대적으로 풍부한가 계산 될 수있다. 중앙 패널에서 이러한 abundances의 평균이 표시됩니다. 이 HMGB1 단백질의 풍부한이 질병의 과정 중에 변경되는 분석이 유형에서 분명하다. 대조적으로, 하단 패널은 질병으로 변경되지 않습니다 히스톤 H4의 예를 보여줍니다. 두 경우 모두, 펩티드 같은 phenot의 동물에서 오는ypic 상태의 샘플 준비 및 LC / MS / MS의 재현성을 보여 유사한 용출 프로파일과 상대적 풍요 로움을 보여줍니다.
이 기법의 재현성은 또한 주요 구성 요소 분석 (PCA)를 사용하여 확인합니다. 그림 5에 도시 된 바와 같이, 분석 각 동물의 총 프로테옴 결과 ANOVA의 응용 프로그램은 동일한 동물의 복제 기술 사이의 소감 협회 (서로 다른 질량 분석기가 동일한 샘플의 실행)와 심장 표현형 (생물은 복제)에 의해 고유 한 클러스터링을 나타 . 이 관심의 개별 단백질에 대한 관찰 풍부한 변경이 실제로 생리적 상태의 차이에 기인 있다는 자신감을 제공합니다.
결과의 정량화 및 재현성 등의 동등한 중요성을 핵 subfractionation으로 활성화 핵 프로테옴의 증가 범위입니다. 그림 6의 분석을 보여줍니다 혼자 온 핵는 별도의 격실 (그대로 핵에서 확인 428 대 분수에 걸쳐 총에서 확인 1,048 독특한 단백질)에서 개별 분석을 결합 할 때 식별 핵 단백질의 대부분을 발견하지 못합니다. 또한, 다른 분수 사이의 중간 오버랩 개별적으로 핵 기능 및 유전자 조절에 추가 통찰력에 대한 이러한 구획을 고려의 생물학적 관련성을 보여줍니다. 마지막으로, 능력 구체적으로 분류하다 산 추출 또는 histones 같은 주요 염색질 구조 단백질에 대한 염색질 확장합니다을 세제 - 추출,이를 통해 단백질의 그룹에 더 많은 초점을 대량 spectrometric 분석 (예 : 사람 만이 대상이 포스트 병진 수정 등) 활성화하지 않고 각 변형 및 이소 형에 대한 특정 항체를 요구.
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1 그림. 심장 핵 하위 구획에서 단백질의 특성에 대한 플로우 차트. 전체 마우스 마음은 균질하고 lysate는 핵에 대한 풍부합니다. 핵은 nucleoplasm, 세제 - 압축을 푼 염색질 및 산 - 압축을 푼 염색질의 분수에 fractionated입니다. 각의 단백질은 격리 한 차원 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 트립신은 LC / MS / MS에 의해 소화하고 실행 밴드 않고 있습니다. 데이터베이스 검색 후, 라벨 - 무료 정량화가 다른 분수의 단백질에 대한 풍부한 동향을 파악하는 데 사용됩니다.
그림 2. 핵 분획 설계도. 핵은 자당 기울기를 통해 전체 심장 homogenate에서 풍부하게 있습니다. 각 핵 샘플 중 nucleoplasm 및 세제 - 압축을 푼 분수로 또는 AC로 분리 할 수이드 - 압축을 푼 비율이 histones에 대한 확장합니다.
그림 3. 다른 분수의 한 차원 젤. 전체 심장 lysate 20 μg (WHL), 손상 핵 (Nuc), nucleoplasm은 (NuP), 마우스의 심장에서 염색질 (DE), 그리고 산 - 압축을 푼 염색질 (AE) 일부를 세제 - 추출 헬러 세포에서 산 압축을 푼 염색질 분획과 함께 한 차원 SDS-PAGE 젤 (12 % 아크릴 아미드)에 실행 아오리 물들했다. 다양한 분자량의 총 단백질의 풍부한의 다른 패턴은 또한 산 압축을 푼 분수에 풍부하게하는 세제 - 압축을 푼 염색질의 낮은 분자량의 histones을위한 농축 등의 다른 하위 구획에 대한 고유 proteomes의 존재를 입증 . 또한 노트의 HELA 세포에서 AE 분율의 실질적 덜 복잡한 자연입니다S는 마음에서 그 비교.
4 그림. 상대 풍부의 정량화 세 가지 다른 심장 상태에서 마우스 :. 기저 (파란색) 비대 (빨간색) 및 실패 (녹색) 세중의 수집 및 단백질 샘플 LC / MS / MS에 의해 복제 두 기술에 달려 있었다. 특정 펩타이드 (그의 스펙트럼의 오른쪽에 표시됩니다)의 monoisotopic 봉우리는 왼쪽에 표시됩니다. 상대 풍부은 통합에 의해 계산과 심장 마비의 다른 주에있는 펩타이드의 상대적 풍부한 (그리고 온있는 단백질)을 비교하기 위해 각 phenotypic 상태 (중간 패널)의 복제 사이에 평균했습니다. 하단 패널 (히스톤 H4)는 변경되지 않지만 상단 패널은 풍부한 질환에 변경되어 HMGB1에서 펩타이드를 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 주요 구성 요소 분석 재현성을 드러내고있다. 펩타이드 농도 (축)에 대한 역모를 각각의 마우스에 대한 ANOVA 분석 (3 생물은 / 심장 상태를 X이 기술을 복제 복제는), (녹색에서 빨간색으로 파란색으로 기초, 비대, 실패) 질병 상태에 의해 클러스터링 보여주는 질량 분석기의 데이터와 다른 질병 상태 사이의 중요한 생리적 차이를 성공적으로 재현성을 나타냅니다.
6 그림. 뚜렷한 핵 하위 구획의 글로벌 특성이 있습니다. 우리는 모든 4 FR에서 1048 총 독특한 단백질을 확인행동. 146 단백질은 nucleoplasm에서 확인 749 단백질, 세제 - 압축을 푼 염색질 분획에서 380, 산 - 압축을 푼 염색질 분획에서 426, 그리고 그대로 핵의 428에 비해 모든 4 분수에 의해 공유되었다. 벤 다이어그램은 생체와 격리이 분류의 능력에 뚜렷한 영역의 존재를 강조, 분수 사이의 식별 단백질의 중간 중복를 도시한다. 또한, 만 unfractionated 핵 (오렌지)를 분석하여 달성 전체 핵 프로테옴의 현저하게 불완전한 특성은 또한 분류를 정당화.
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Discussion
핵 절연을위한 두 가지 방법은 이미 검토 한 : 27 하나는 수성 자당 / 소금 용액에 조직을 homogenizing의 비 수성 용매에 동결 건조 된 조직을 homogenizing의 Behrens 기술과 두 번째, 우리가 사용하는의 수정입니다 다음 차동 또는 밀도 기울기 원심 분리에 의해.
조직 샘플에서 산 추출하여 핵의 Subfractionation은 histones을 분석되는 원본을 목표로 1960, 28 년부터 사용 된 염색질을 공부하기위한 중요한 도구입니다. 산 추출 프로토콜은 핵심 nucleosomal histones 구성 요소를 정화의 목표를 위해 개발 된 29이 이전 연구의 한계는 비 히스톤 단백질 구성, 그리고 염색질 수정에 대한 정보의 부재이다;. 우리는 현재의 프로토콜로이 문제를 해결했습니다 핵 및 염색질의 독특한 생물학적 subfractions을 특성화하십시오.병렬로 세제 추출 또는 염색질의 산 추출을 사용하는이 방법은, 염색질 규제 분자의 다양성을 드러내는함으로써 가설 생성을위한 강력한 접근 방식으로 제공 내생 규제 수준 구분.
성인 myocyte에 설립 산성 - 추출 방법을 적용하면 고밀도 세포 골격 및 대형 mitochondrial 인구 포함한 특정 장애물을 포즈. 산 추출 버전은 전체 심장 조직을 30 일에 사용 된 상태에서 실험이 알려진 단백질을 연구 할 수있는 대상 방식으로 실시되었다, 현재의 프로토콜은 설계와 편견 프로테옴 분석을 사용하려면 실행되었습니다. 또한, 우리는 세제 - 추출 및 산 - 압축을 푼 염색질 별도로합니다 (만 37% 오버랩이 두 분수의 proteomes 사이에 관찰 할 수 있었다) 더 나은 역학을 이해하기 위해 검토하는 것이 도움이 발견 한을 통해 염색질 단백질 INT의 이러한 인구DNA와 eract. 요소 기반의 버퍼를 사용하는 다른 프로토콜도 산성 추출하기 전에 수행 적은 단단히 게놈에 바인딩 단백질을 풍부하게, 31,32을 설명하고 있습니다. 염색질 분수뿐만 아니라, 다른 사람들이 subfractionated nucleolus를 분리하기 위해 핵, 33 만 전체의 마음으로부터 격리 심근 핵의 질량 분광 분석을위한 subfractionation을하는 것은보고되지 않았습니다.
에 샷건 proteomic 연구 손상 핵 - 즉, unfractionated 세포 소기관 -이 MudPIT 접근법을 사용하여 심근 조직에서 수행 된. 15이 연구는 1044 핵 심장 단백질을 식별 동일한 규모의 프로토콜로, 그러나 그들은의 평균을 사용하여 의존 8.5이 낮은 풍부한 단백질을 감지하는 20 시간 지속 각각의 실행과 복제합니다. 반면에, 우리는 동안 importa (긴 크로마토 그래피 - 우리 LC의 실행은 85 분 아르없이) 모두 증가 식별 단백질의 수, subfractionation를 고용ntly 또한 하위 핵 지역화와 단백질의 상대적인 풍부에 대한 추가 생물학적 정보를 제공합니다.
전체 마우스의 심장 (약 0.14 g) 우리는 그대로 핵에서 단백질의 약 1.2 밀리그램 (전체의 0.85 %)를 복구합니다.에서 그대로 핵에서 우리는 subfractions의 각에 대해 다음 복구를 달성 (참고 : 산 추출 및 세제 압축 풀기가 별도의 마음이 아닌 시리즈에 완료로 총 값은 100 %를 초과) : Nucleoplasm (15 %), 세제 - 염색질 (85 %), 그리고 산 - 압축을 푼 염색질 (54 %)를 추출. 비교함으로써, 열 과학은 데이터 시트는 10 % 교차 오염 사이에있는 마우스의 심장 40 밀리그램에서 수율 1.6mg cytosolic 단백질과 0.6 밀리그램 핵 단백질 (1.5 %)를 말합니다 키트 (원자력 및 세포질 시약 NE-PER)이 두 분수. 시그마는 사람들이 토끼의 근육에서 테스트 한 키트 (NXTRACT, CellLytic 핵 추출 키트),하지만 마음을 가지고, 100 MG 조직 0.4에서 발견그들은 세포질 오염의 "몇 퍼센트"로 그들의 "원유 핵 펠릿을"기간 어떤 핵 단백질 6 밀리그램 (0.46 %). 같은 Epigentek와 같은 다른 회사도 키트를 제공하지만 우리는 비교를 위해 웹 사이트에 농축과 순결에 대한 자세한 정보를 찾을 수 없습니다.
우리는 proteomic 연구 심장 핵을 성공적으로 농축에 대한 현재 필요를 해결하기 위해 새로운 기술을 설명하고 있습니다. 우리는 더 적은 풍부한 단백질뿐만 아니라 높은 해상도, 정량화 및 단백질 현지화 결정을 허용을 감지 할 수있는 능력을 증가 모두 하위 칸 분류에 대한 방법론을 설명합니다. 이를 위해, 대량 분광 분석을위한 프로토콜은 권장 지침 그러나 대소 별 케이스 고려가 가장 가능성이 필요합니다를 제공합니다. 예를 들어, 우리는 스펙트럼의 시퀀스 유사성 필요한 수동 검사와 심장 히스톤 변형 isoforms의 큰 숫자가 교장 할당 발견조 봉우리와 자신 스펙트럼을 할당 할 수되기 전에 부모 이온 질량을 확인가. 14 검색 매개 변수도 후 병진 수정 (PTM) 신분증과 우수한 리뷰를 사용자 정의 할 수는 PTM 분석 (PTM 농축을 포함에 대한 데이터 해석과 상세한 방법과 우려가 존재 , PTMs 34 소프트웨어, 조합의 PTMs, 36 다른 조각 전략 37 대체 소화 및 가공 38,39)의 35 분석.
설명 강화와 분류는 전체 심장 (이 대량으로 50-70%의 cardiomyocyte입니다)에서입니다. 세포 특이성이 희생 측면은 핵 단백질의 특정 가족에 특히 중요 할 수있는 반면, 성인 myocyte 세포 격리 프로토콜과 수 없습니다 적절한 버퍼,에 단백질의 훨씬 더 빠른 정지 할 수 있습니다. 이러한 방법으로,이 방법은 더 나은 무결성 o를 유지F 저하에 대한 샘플. 그러나, 또한 설명을 모두 분리 셀과 전체 유기체 모델은 심장 마비를 공부에 필요한 도구이기 때문에, 절연 신생아 쥐의 심실 근세포에이 프로토콜을 적용하는 방법은 다음과 같습니다. 원칙적으로이 방법은 또한 절연 마음 -와주의 절연 (한 시간 이상 지속 할 수있는) 동안 발생하는 단백질 바인딩의 변화는 proteomic 관찰의 해석 혼란 것이라고에서 효소 분해에 의해 추출 성인 근세포에 적용 할 수 있습니다.
우리는 질병에 기여하는 핵 프로테옴와 염색질의 메이크업의 변화를 이해하려면이 방법을 개발했습니다. 14 그러나 다른 응용 프로그램에서 정상적인 생리학의 프로테옴 구성의 자극 특정 변경 사항을 공부하고 있습니다. 또한, 하위 분류는 단백질이 핵의 독특한 기능 지역에 걸쳐 운영하고 지역화하는 방법에 특성화의 새로운 수준의 기능을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
Vondriska 연구소는 NIH와 UCLA에서 Laubisch 기금의 국립 심장 폐 혈액 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다. EM은 UCLA의 생리학에서 제니퍼 S. Buchwald 대학원 동지의 수상자이다, HC는 미국 심장 협회 사전 박사의 원정이 수상자이다, MP는 NIH 루스 Kirschstein 포스트 박사의 원정이받는 것입니다, 그리고 SF가의 수신자입니다 NIH K99 수상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
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