Summary
Phase-Shift nanoemulsões (PSNE) pode ser vaporizado utilizando ultra-sons de alta intensidade focado para melhorar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores. Neste relatório, a preparação de PSNE estável, com uma estreita distribuição de tamanho é descrito. Além disso, o impacto de PSNE vaporizada no ultra-som mediada por ablação é demonstrada no tecido mimetizam fantasmas.
Abstract
Ultra-som de alta intensidade focado (HIFU) é utilizada clinicamente para remoção térmica de tumores. Para aumentar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores, as gotas revestidas com lípido perfluorocarbonos têm sido desenvolvidos, que pode ser vaporizada por HIFU. A vasculatura em muitos tumores é anormalmente leaky devido ao seu rápido crescimento, e as nanopartículas são capazes de penetrar as fenestrações e passivamente acumulam no interior dos tumores. Assim, controlando o tamanho das gotículas pode resultar em melhor acumulação no interior dos tumores. Neste relatório, a preparação de gotas estáveis em uma nanoemulsão de deslocamento de fase (PSNE), com uma estreita distribuição de tamanho é descrito. PSNE foram sintetizados por sonicação de uma solução de lípido na presença de perfluorocarbono líquido. Uma distribuição estreita de tamanhos foi obtida por extrusão das vezes PSNE múltiplas utilizando filtros com tamanhos de poros de 100 ou 200 nm. A distribuição de tamanho foi medido ao longo de um período de 7 dias usando dispersão dinâmica de luz. Polyachidrogéis rylamide contendo PSNE estavam preparados para experimentos in vitro. Gotículas PSNE nos hidrogéis foram vaporizados com ultra-sons e as bolhas resultantes melhoradas aquecimento localizado. Vaporizado PSNE permite um aquecimento mais rápido e também reduz a intensidade ultra-som necessária para a ablação térmica. Assim, espera-se que PSNE melhorar a ablação térmica em tumores, melhorando potencialmente a resultados terapêuticos do HIFU mediadas tratamentos de ablação térmica.
Protocol
1. Preparação de mudança de fase Nanoemulsion (PSNE)
- Dissolver 11 mg de DPPC e 1,68 mg de DSPE-PEG2000 em clorofórmio
- Evapora-se o solvente orgânico para formar um filme de lípido seco num balão de vidro de fundo redondo de-
- Dessicate a película lipídica durante a noite
- Hidratar a película de lípido com 5,5 mL de salino tamponado com fosfato (PBS)
- Solução de calor num banho de água a 45 ° C até que se dissolva filme lipídico, vortex periodicamente
- Transferir a solução lipídica em 7 ml frasco
- Sonicar solução de lípidos durante 2 min a 20% de amplitude
- Dividir solução em dois frascos de 2,5 ml cada (descartar restante de 0,5 ml)
- Adicionar 2,5 ml de PBS a cada frasco
- Colocar cada frasco num banho de 0 ° C de água-gelo
- Adicionar 50 ul TFDP a cada frasco
- Sonicar cada frasco no banho de gelo-água utilizando as seguintes definições: amplitude de 25%, modo pulsado (10 seg ligado, 50 segundos desligado), total de 60 seg em vez
- Trsoluções ansfer PSNE para 20 frascos de cintilação ml
- Adicionar 5 ml de PBS a cada tubo, resultando em 10 ml de volume final
- Montar direções Extrusor fornecidas pelo fabricante
- Lavar cada peça com água deionizada
- Colocar o disco de suporte de aço inoxidável no centro da base de suporte do filtro
- Coloque a malha de aço inoxidável em cima do disco de suporte de aço inoxidável
- Com uma pinça, colocar uma extrusora membrana disco de drenagem (se o lado brilhante) na malha de aço inoxidável
- Usando pinças, colocar o filtro de extrusora (acima do lado brilhante) na membrana de disco de drenagem
- Coloque cuidadosamente o pequeno-ring no filtro e colocar o Thermobarrel e superior extrusora acima da base de apoio
- Aperte parcialmente cada asa-porca primeiro, então completamente aperte as porcas de asa-com a mão em forma alternada
- Ligue o extrusor parauma linha de gás nitrogênio
- Para preparar o extrusor, pipeta 10 ml de água desionizada para a porta de amostra superior, limitar a abertura, e apertar a válvula de ventilação
- Abrir lentamente a linha de gás de azoto para aumentar a pressão, forçando a amostra através das membranas, e recolher a amostra do tubo de saída
- Após o uso, desmontar em ordem inversa, enxaguar as peças de extrusão com água desionizada, e descartar o filtro de membrana e do disco de membrana de drenagem
- Para 100 nm gotas apenas, PSNE pré-condição por extrusão 10 vezes através de 200 nm filtro
- Extrude PSNE 16 vezes através de 100 nm ou 200 nm, filtro para obter uma distribuição de tamanhos estreita
2. Preparação do hidrogel de poliacrilamida contendo PSNE
- Preparar uma solução de 24% de BSA por diluição de 1,2 g de pó de BSA em 5 ml de água desionizada
- Preparar a solução de APS a 10% diluído por 0,1 g de pó APS em 1 ml wate desionizadar
- Na seguinte ordem, misturar 2,1 ml de solução de acrilamida, 1,2 ml de tampão Tris, 0,1 ml de 10% APS, 4,5 ml de 24% solução de BSA e 3,6 ml de água desionizada na câmara de plástico
- Aquece-se a 40 ° C e colocar sob vácuo durante 1 hr
- Adicionar 480 ul de PSNE e misturar completamente por agitação suave da câmara de plástico.
- Adicionar 12 ul de TEMED e colocar a câmara num banho de água a 12 ° C durante 2 h
3. Resultados representativos
Um esquema da instalação de ultra-som para experiências com fantasmas tecido mimetizam de hidrogel é apresentado na Figura 1. Este protocolo resulta em gotículas de lípidos revestidos perfluorocarbono com uma distribuição estreita de tamanhos, que são estáveis em solução, durante pelo menos uma semana. A distribuição do tamanho medido com dispersão de luz dinâmica (90Plus Analisador de Tamanho de Partículas, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) é mostrado na Figura 2 para PSNE extrudida utilizando 100 e 200filtros nm. O diâmetro PSNE eficaz ao longo do tempo, medida usando dispersão dinâmica de luz, está listado na Tabela 1, demonstram que PSNE são estáveis durante pelo menos uma semana. B-modo as imagens de PSNE antes e depois vaporização num hidrogel de poliacrilamida são apresentadas na Figura 3. Além disso, a lesão formada por 15 segundos de HIFU mediada por aquecimento num hidrogel de poliacrilamida contendo albumina e PSNE é mostrado na Figura 4. A forma assimétrica da lesão é um resultado do aquecimento prefocal que ocorre devido à presença de uma nuvem de bolhas no caminho de ultra-som. É importante notar que o aquecimento prefocal e formação da lesão, devido à dispersão das bolhas podem ser minimizados através da redução da energia acústica transmitida.
Figura 1. Diagrama esquemático do arranjo experimental de ultra-som para experiências com tecidos mim-Icking hidrogéis.
Figura 2. Tamanho distribuição de PSNE extrudida através de 100 nm ou 200 nm, filtros, medida usando dispersão dinâmica de luz. As unidades dos eixos de ordenadas são baseados na intensidade da luz dispersa a partir de partículas de um certo tamanho em relação à intensidade total da luz dispersa a partir da amostra.
Figura 3. B-modo imagens (a) antes e (b) depois de vaporização PSNE num hidrogel de poliacrilamida. A seta indica a região focal onde uma nuvem de bolhas foi formada por vaporização PSNE.
Figura 4. Imagens de polyacrylamide hidrogel contendo albumina e PSNE (a) antes e (b), após a vaporização e sonicação com HIFU, demonstrando a formação da lesão, como resultado de ultra-som induzida pelo aquecimento. A freqüência central de ultra-som foi de 3,3 MHz. O sinal de ultra-som de um composto inicial de 30-ciclo, 6,4 W de pulso para vaporizar PSNE, imediatamente seguido de 15 segundos de ultra-som contínuo em 0,77 W.
| Dias após a extrusão | Extrudido com filtro de 200 nm | Extrudido com filtro de 100 nm | ||
| A média de Dia. (Nm) | Std. Desenv. (Nm) | A média de Dia. (Nm) | Std. Desenv. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <td> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Tabela 1. Diâmetro médio e desvio padrão de PSNE a um e sete dias após a extrusão com 100 nm e 200 nm filtros.
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Discussion
Ultra-som de alta intensidade focado (HIFU) é utilizada clinicamente para remoção térmica de tumores. 1 Para melhorar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores, as gotas revestidas com lípido perfluorocarbonos têm sido desenvolvidos, que pode ser vaporizada por HIFU. A vasculatura em muitos tumores é anormalmente leaky devido ao seu crescimento rápido. 2 Assim, as nanopartículas são capazes de penetrar as fenestrações e passivamente acumular dentro de tumores, um processo conhecido como o maior permeabilidade e efeito de retenção (EPR). 3 Foi demonstrado que nanopartículas entre 70 e 200 nm, de forma mais eficiente se acumulam em tumores. 4 O procedimento descrito no presente relatório produz uma nanoemulsão de deslocamento de fase estável (PSNE) de gotículas lipídicas revestidas com perfluorocarbonos com uma distribuição de tamanhos estreita. No passado, a maioria dos estudos, foram utilizadas as distribuições de tamanho de polidispersos PSNE, mas estudos recentes têm-se centrado na produção PSNE com distribuições de tamanho estreitas.5, 6 O método de extrusão descrito no presente protocolo permite controlar o tamanho, a fim de aumentar a percentagem de gotas administradas sistemicamente, que se acumulam no interior dos tumores.
O núcleo dodecafluoropentano dos nanogotas tem uma temperatura de ebulição de 29 ° C. 7 Assim, é importante manter uma temperatura baixa durante cada passo da preparação PSNE. Sonicação aumenta a temperatura da solução, mas utilizando uma sequência de sonicação pulsado e colocando a amostra num banho de gelo-água durante a sonicação pode reduzir a evaporação. Uma vez que as gotículas de lípidos revestidos ter formado, a temperatura de ebulição aumenta acima de 60 ° C, devido à tensão superficial. Vaporização PSNE 8 é a temperatura e pressão-dependente e também depende do tamanho e da composição das gotículas de perfluorocarbono líquido. 9 Por exemplo, verificou-se que as pressões de pico superiores a 3,8 MPa rarefacional eram necessários para vaporizar 200gotículas TFDP nm a 37 ° C. 10 O revestimento das gotículas com lípidos conjugados com poli (etileno glicol) (PEG) inibe a fusão, aumentando assim a estabilidade do tamanho de PSNE durante vários dias. Além disso, tem sido documentado que o PEG pode aumentar o tempo de circulação de lípido à base de vesículas, 11-13, que podem aumentar a fracção de PSNE administrada sistemicamente, que se acumulam em tumores localizados. 14, 15
As gotículas de perfluorocarbono pode ser suspenso num hidrogel fantasma tecido imitando-poliacrilamida contendo albumina para estudos in vitro de ablação térmica. 16 Os hidrogéis PSNE-carregadas são úteis para avaliar os limiares de vaporização, bem como estudar a formação da lesão da bolha melhorada aquecimento HIFU mediada . Os hidrogéis de absorver e converter energia acústica em calor, e uma vez que a temperatura no hidrogel excede 58 ° C, a albumina nos desnatura hidrogel e torna-se opaco17. Porque os hidrogéis são opticamente transparentes, é possível observar a desnaturação de proteínas, em tempo real. Vaporização da PSNE dentro dos hidrogéis cria bolhas, que são usados para aumentar a eficiência do ultra-som mediada por aquecimento. Usando um transdutor focalizado vaporização, PSNE bolha e melhorada de aquecimento pode ser localizada, evitando assim aquecimento indesejado em intervir meios biológicos (por exemplo tecido). Nos espectros, a nuvem da bolha vaporizado pode afectar a propagação do feixe de ultra-som e causar aquecimento prefocal, desde que a potência acústica excede um limiar. Abaixo deste limiar, a energia dispersa é demasiado baixo para a ablação de tecido na região prefocal, consequentemente, o volume de ablação está confinada à localização da nuvem de bolhas. O uso de PSNE para melhorar o aquecimento localizado in vivo poderia melhorar os resultados de tratamentos de ablação HIFU tumorais. Como um primeiro passo, um protocolo com base em extrusão foi desenvolvido para controlaro tamanho de PSNE estreitamente distribuído. Usando PSNE dispersas dentro opticamente transparentes tecido imitando-hidrogéis, é possível investigar o impacto da PSNE vaporizado no ultra-som mediada por aquecimento e ablação térmica. A entrega de agentes terapêuticos e nanopartículas para o núcleo do tumor in vivo permanece um desafio devido ao aumento das pressões intersticiais que nela se encontram. É provável que PSNE seria preferencialmente acumular-se dentro da periferia do tumor e não podem facilmente penetrar no núcleo do tumor. Estudos em hidrogéis têm mostrado que as bolhas podem redireccionar a energia acústica para o transdutor que resulta em volumes extirpadas na região prefocal. Este fenómeno ocorre quando a energia acústica transmitida excede um limiar específico. Assim, é possível localizar bolha-enhanced ablação do tumor para a periferia do tumor através de um ajuste de potência, bem como a ablação do núcleo interior através da reflexão da energia acústica off bolhas criadas na margem distal em maior poweconfiguração r. Além disso, a ablação precisa da periferia do tumor, que evita danos ao tecido saudável circundante ainda representam um avanço significativo e poderia permitir que, previamente, não-ressecáveis tumores de ser removido cirurgicamente. Embora haja diferenças entre as condições in vivo e os hidrogéis tecido mimetizam, os fantasmas são úteis para a compreensão dos mecanismos físicos de ultra-som melhorada de aquecimento com PSNE, a fim de optimizar os parâmetros de ultra-som para a ablação térmica. Estes são passos críticos para traduzir o uso de ultra-som PSNE para ablação mediada de reforço do laboratório para a clínica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma Saúde Aplicada BU / Cimit Fellowship Engenharia predoctoral, a Fundação Nacional de Ciência ampliando a participação pesquisa de iniciação Grant em Engenharia (BRIGE), e os Institutos Nacionais de Saúde (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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