Summary
nanoemulsions Phase-Shift (PSNE) ניתן מתאדה באמצעות אולטרסאונד ממוקד בעצמה גבוהה כדי לשפר את החימום מקומי ולשפר אבלציה תרמית בגידולים. בדו"ח זה, הכנת PSNE היציב עם חלוקת גודל צרה מתוארת. יתר על כן, ההשפעה של PSNE מתאדה באבלציה אולטרסאונד בתיווכו הפגין ברוחות רפאי רקמות מחקו.
Abstract
אולטרסאונד ממוקד בעצמה גבוהה (HIFU) משמש קליני תרמית לקטוע גידולים. כדי לשפר את החימום מקומי ולשפר אבלציה תרמית בגידולים, טיפי perfluorocarbon שומנים מצופים פותחו אשר ניתן מתאדות ידי HIFU. מערכת כלי הדם בגידולים רבים באופן חריג דולפת עקב הצמיחה המהירה שלהם, וחלקיקים מסוגלים לחדור לfenestrations ופסיבי מצטבר בתוך גידולים. לכן, שליטה על גודל הטיפין יכולה לגרום להצטברות טובה יותר בתוך גידולים. בדו"ח זה, ההכנה של טיפין יציבות בnanoemulsion שלב מעבר (PSNE) עם התפלגות גודל צרה מתוארת. PSNE היה מסונתז על ידי sonicating פתרון שומנים בנוכחות perfluorocarbon הנוזלי. התפלגות גודל צרה הייתה מתקבלת על ידי extruding מספר פעמי PSNE באמצעות מסננים בגדלים נקבוביים של 100 או 200 ננומטר. התפלגות הגודל נמדדה לאורך תקופת 7-יום באמצעות פיזור אור דינמי. Polyacהידרוג rylamide המכיל PSNE היה מוכן לניסויים במבחנה. טיפי PSNE בידרוג היו מתאדות עם אולטרסאונד ואת הבועות כתוצאה משופרת חימום מקומי. מתאדה PSNE מאפשר חימום מהיר יותר וגם מפחיתה את עוצמת אולטרסאונד לצורך אבלציה תרמית. לפיכך, PSNE צפוי לשפר אבלציה תרמית בגידולים, פוטנציאל שיפור תוצאות טיפוליות של טיפולי אבלציה תרמית HIFU בתיווך.
Protocol
1. הכנת nanoemulsion שלב המשמרת (PSNE)
- להמס 11 מ"ג DPPC ו1.68 מ"ג DSPE-PEG2000 בכלורופורם
- להתאדות הממס אורגני כדי ליצור סרט שומנים יבש בבקבוק זכוכית עגולה עם תחתית
- שחון סרט שומני הלילה
- Rehydrate סרט שומנים עם 5.5 מ"ל של תמיסת המלח פוספט שנאגר-(PBS)
- פתרון חום באמבטית 45 ° C מים עד סרט שומנים מתפרק, vortexing מעת לעת
- העברת פתרון שומנים לתוך בקבוקון מ"ל 7
- Sonicate פתרון שומנים עבור 2 דקות במשרעת 20%
- מחלק פתרון לשני בקבוקונים של 2.5 מ"ל כל אחת (למחוק 0.5 מ"ל נותר)
- הוסף 2.5 המ"ל PBS לכל בקבוקון
- הנח בכל בקבוקון 0 ° C אמבט קרח מים
- הוסף DDFP μl 50 לכל בקבוקון
- Sonicate כל בקבוקון באמבטית קרח המים באמצעות ההגדרות הבאות: משרעת 25%, מצב פעם (10 שניות ב, 50 שניות כבויות), סך הכל 60 שניות על זמן
- Trפתרוני ansfer PSNE עד 20 בקבוקוני scintillation מ"ל
- הוסף 5 המ"ל PBS לכל בקבוקון, וכתוצאה מכך נפח 10 מ"ל סופי
- להרכיב הכיוונים הבאים extruder מסופקים על ידי יצרן
- יש לשטוף את כל חלק עם מי deionized
- הכנס את דיסק תמיכת הנירוסטה במרכז בסיס תמיכת המסנן
- הנח את רשת הנירוסטה על גבי דיסק תמיכת הנירוסטה
- השימוש בפינצטה, הנח קרום דיסק ניקוז extruder (עד צד מבריק) על רשת הנירוסטה
- השימוש בפינצטה, למקם את מכבש המסנן (עד צד מבריק) על קרום דיסק הטמיון
- בזהירות להניח את טבעת O הקטנה על הפילטר ולמקם את thermobarrel והעליון extruder מעל בסיס התמיכה
- חלקית להדק כל אגף-אגוז ראשון, ואז להדק את אגף אגוזים לחלוטין על ידי יד באופנה מתחלפת
- חבור למכבשקו גז חנקן
- כדי להתניע את מכבש פיפטה המים, 10 מיליליטר deionized ליציאת המדגם העליונה, מחסל את הפתח, ולהדק את שסתום האוורור
- לאט לאט לפתוח את קו גז החנקן כדי להגביר את הלחץ, ואלץ את הדגימה דרך הקרום, ולאסוף דגימה מהצינורות לשקע
- לאחר שימוש, לפרק בסדר הפוכה, יש לשטוף את חלקי extruder עם מי deionized, והשלך את מסנן הממברנה ודיסק ניקוז קרום
- עבור 100 טיפי ננומטר, PSNE תנאי מוקדם רק על ידי extruding 10 פעמים באמצעות 200 ננומטר מסנן
- Extrude PSNE פי 16 עד 100 ננומטר או 200 ננומטר סינון להשגת התפלגות גודל צרה
2. הכנת Hydrogel polyacrylamide מכילה PSNE
- הכן 24% פתרון BSA על ידי דילול 1.2 גרם BSA אבקה במי 5 מ"ל deionized
- הכן 10% פתרון APS ידי אבקה מדוללת 0.1 גרם APS במיליליטר wate 1 deionizedr
- לפי הסדר הבא, לערבב פתרון 2.1 מ"ל acrylamide, 1.2 מ"ל טריס חיץ, המ"ל APS 0.1 10%, 24% מיליליטר פתרון 4.5-BSA, ומי deionized 3.6 מ"ל בתא פלסטיק
- חום עד 40 מעלות צלזיוס, ומקום תחת ואקום לשעה 1
- הוסף 480 μl של PSNE וביסודיות על ידי לערבב מתערבל תא הפלסטיק בעדינות.
- הוסף TEMED μl 12 ולמקם את החדר ב° C אמבט מי 12 עבור 2 שעות
3. נציג תוצאות
סכמטי של ההתקנה לניסויי אולטרסאונד עם רוחות רפאים הידרוג רקמות מחקו מוצג באיור 1. פרוטוקול זה גורם לטיפי perfluorocarbon שומנים מצופים עם התפלגות גודל צרה שאינן יציבים בתמיסה לפחות בשבוע. התפלגות הגודל נמדדה עם פיזור האור דינאמי (מנתח 90Plus גודל חלקיקים, מכשירי ברוקהייבן, Holtsville, ניו יורק) מוצגת באיור 2 לPSNE באמצעות extruded 100 ו 200מסנני ננומטר. קוטר PSNE היעיל לאורך זמן, הנמדד באמצעות פיזור האור דינאמי, מופיע בטבלת 1, הוכחה כי PSNE הם יציב במשך לפחות שבוע. תמונות ב-mode של PSNE לפני ואחרי האידוי בידרוג polyacrylamide מוצגות באיור 3. כמו כן, נגע שנוצר על ידי 15 שניות של חימום HIFU בתיווך בידרוג polyacrylamide המכיל אלבומין וPSNE מוצגת באיור 4. הצורה הסימטרית של הנגע היא תוצאה של חימום prefocal שנגרמה עקב נוכחותו של ענן הבועה בדרך אולטרסאונד. חשוב לציין שחימום prefocal והיווצרות נגע בשל פיזור מבועות ניתן למזער על ידי צמצום כוח אקוסטי המשודר.
איור 1. תרשים סכמטי של התקנה ניסיונית לאולטרסאונד ניסויים ברקמות MIMicking הידרוג.
איור 2. הפצה של PSNE נמתחת דרך 100 או 200 ננומטר מסנני nm גודל, נמדד באמצעות פיזור אור דינמי. היחידות של צירי ordinate מבוססות על עוצמת האור מפוזר מחלקיקים בגודל יחסי לעוצמת האור המפוזרת המוחלטת ממדגם מסוים.
איור 3. תמונות B-mode (א) ולפני (ב) לאחר אידוי PSNE בידרוג polyacrylamide. החץ מצביע על האזור שבו מוקד ענן בועה הוקם על ידי אידוי PSNE.
איור 4. תמונות של polyacrהידרוג ylamide המכיל אלבומין וPSNE (א) ולפני (ב) לאחר האידוי וsonication עם HIFU, הוכחת היווצרות נגע כתוצאה מחימום אולטרסאונד המושרה. התדר המרכזי אולטרסאונד היה 3.3 מגה רץ. אות אולטרסאונד כללה 30-מחזור ראשוני, 6.4 W הדופק כדי לאדות PSNE, ומייד אחריו 15 שניות של אולטרסאונד הרציף ב 0.77 וו
| ימים לאחר שחול | Extruded עם 200 ננומטר מסנן | Extruded עם 100 ננומטר מסנן | ||
| מתכוון דיא. (ננומטר) | STD. Dev. (ננומטר) | מתכוון דיא. (ננומטר) | STD. Dev. (ננומטר) | |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | <td> 177.72.5 | 124.8 | 3.1 | |
טבלה 1. Mean קוטר וסטיית התקן של PSNE בימים 1 ושבעה לאחר חול עם 100 ננומטר ו 200 ננומטר מסננים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אולטרסאונד ממוקד בעצמה גבוהה (HIFU) משמש קליני תרמית לקטוע גידולים. 1 כדי לשפר את החימום מקומי ולשפר אבלציה תרמית בגידולים, טיפי perfluorocarbon שומנים מצופים פותחו אשר ניתן מתאדות ידי HIFU. מערכת כלי הדם בגידולים רבים באופן חריג דולפת עקב הצמיחה המהירה שלהם. 2 לפיכך, חלקיקים מסוגלים לחדור לfenestrations ופסיבי מצטבר בתוך גידולים, תהליך המכונה חדירות המשופרות ושמירת האפקט (EPR). 3 מוכיח כי חלקיקים שבין 70 ל 200 ננומטר לצבור באופן יעיל ביותר בגידולים. 4 ההליך המתואר בדוח זה מייצר nanoemulsion יציב שלב מעבר (PSNE) של טיפי perfluorocarbon מצופות שומנים בהתפלגות גודל צרה. בעבר, מרבית המחקרים המשמשים הפצות polydisperse גודל של PSNE, אך מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו בייצור PSNE עם הפצות גודל צרות.5, 6 שיטת החול המתואר בפרוטוקול זה מאפשר לאדם לשלוט על הגודל כדי להגדיל את האחוז של טיפין באופן מערכתי שמצטברות בתוך גידולים.
ליבת dodecafluoropentane של nanodroplets יש טמפרטורת רתיחה של 29 ° 7 ג לכן, חשוב לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך כל שלב של הכנת PSNE. Sonication מגביר את הטמפרטורה של הפתרון, אבל תוך שימוש ברצף sonication פעם והצבת המדגם באמבט קרח מים במהלך sonication יכול להפחית אידוי. ברגע שטיפי שומנים המצופים יצרו, טמפרטורת הרתיחה עולה מעל 60 מעלות עקב מתח הפנים ג. אידוי PSNE 8 הוא טמפרטורה ולחץ תלוי ותלוי גם בגודל ובהרכב של טיפי perfluorocarbon הנוזליות. 9 לדוגמה, נמצא כי לחצי rarefactional שיא מעל 3.8 מגפ"ס היו נחוצים כדי לאדות 200טיפי ננומטר DDFP ב 37 ° C. 10 ציפוי את הטיפין עם שומנים מצומדות עם פולי (אתילן גליקול) (PEG) מעכבות היתוך, ובכך להגדיל את יציבות גודל PSNE על מספר רבים של ימים. בנוסף, תועד כי PEG יכול להגדיל את זמן המחזור של שלפוחית שומנים המבוססות, 11-13 אשר עשוי להגדיל את החלק היחסי של PSNE מערכתי המצטברים בגידולים ממאירים מקומיים. 14, 15
טיפי perfluorocarbon יכולות להיות מושעות בפנטום הידרוג polyacrylamide רקמת מחקים המכיל אלבומין למחקרים באבלציה תרמית מבחנה. את 16 הידרוג PSNE הטעונה שימושיים להערכת ספי האידוי, כמו גם לומד היווצרות נגע מחימום HIFU בתיווך בועה משופרת . את הידרוג לספוג ולהמיר אנרגיה האקוסטית לחום, וברגע שהטמפרטורה בידרוג עולה על 58 מעלות צלזיוס, אלבומין בdenatures הידרוג'ל והופכת אטומים17. בגלל הידרוג הם שקוף אופטי, ניתן להתבונן denaturation חלבון בזמן אמת. אידוי של PSNE בתוך הידרוג יוצר בועות, המשמשים כדי להגביר את היעילות של חימום אולטרסאונד בתיווך. שימוש ממוקד מתמר אידוי, PSNE וחימום בועה משופר יכול להיות מקומי, וכך למנוע חימום לא רצוי להתערב בתקשורת הביולוגית (כלומר רקמה). ברוחות הרפאים, ענן הבועה המאוידת יכול להשפיע על העברת קרן אולטרסאונד ולגרום לחימום prefocal, ספק כוח אקוסטי חורג מסף. מתחת לסף הזה, הכח המפוזר הוא נמוך מדי כדי לקטוע רקמה באזור prefocal וכתוצאה מכך, נפח ablated מוגבל למיקומו של ענן הבועה. השימוש בPSNE כדי לשפר את החימום מקומי in vivo יכול אף לשפר את תוצאות טיפולי אבלציה הסרטניות HIFU. כצעד ראשון, פרוטוקול חול מבוסס פותח כדי לשלוטגודל PSNE הופץ בצמצום. שימוש PSNE מפוזר בתוך הידרוג שקופה אופטי-רקמות מחקה, אפשר לחקור את ההשפעה של PSNE מתאדים בחימום אולטרסאונד בתיווך ואבלציה תרמית. מסירה של סוכנים טיפוליים וחלקיקי ליבת גידול in vivo עדיין מהווה אתגר בשל לחצי ביניים מוגברים שנמצאו שם. סביר להניח כי יעדיף PSNE לצבור בתוך הפריפריה ובקלות הגידול לא יכולה לחדור לליבת גידול. מחקרים בידרוג הראו כי בועות יכולות להפנות את האנרגיה האקוסטית כלפי המתמר וכתוצאה מכרכי ablated באזור prefocal. תופעה זו מתרחשת כאשר הכח מועבר אקוסטית עולה על סף מסוים. לפיכך, ניתן למקם אבלציה גידול בועה משופרת לפריפרית גידול שימוש בהגדרת כוח אחד, כמו גם לקטוע הליבה הפנימית על ידי המשקף את האנרגיה האקוסטית בועות שנוצרה בשולי דיסטלי בpowe גבוההגדרת r. יתר על כן, אבלציה המדויקת של פריפרית הגידול שימנע פגיעה ברקמות הבריאות עדיין מהווה פריצת דרך משמעותית ועלולה לאפשר קודם לכן גידולים לא resectable שהוסרו בניתוח. למרות שיש הבדלים בין בתנאי vivo והידרוג רקמות מחק, את רוחות הרפאים שימושיות להבנת המנגנונים הפיסיקליים של החימום אולטרסאונד משופר עם PSNE על מנת לייעל את פרמטרי אולטרסאונד לאבלציה תרמית. אלה הם צעדים קריטיים לתרגום השימוש בPSNE לאבלציה אולטרסאונד בתיווך שיפור מהמעבדה למרפאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת BU / CIMIT יישומית בריאות הנדסת Predoctoral, קרן לאומית למדע הרחבת מחקר השתתפות ייזום גרנט בהנדסה (BRIGE), והמכונים הלאומיים לבריאות (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
- Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F.
- Baban, D. F., Seymour, L. W.
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
- Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
- Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
- Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
- Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
- Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
- Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
- Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
- Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
- Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
- Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
- Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).
