Summary
Het ontwerp, de fabricage en assemblage van een ultra-licht gemotoriseerd Microdrive wordt beschreven. Het apparaat biedt een kosteneffectieve en eenvoudig te gebruiken oplossing voor chronische opnames van afzonderlijke eenheden in kleine gedragen dieren.
Abstract
De mogelijkheid om chronisch opnemen van populaties van neuronen in vrij gedragen dieren heeft bewezen een waardevol instrument voor het ontleden van de functie van de neurale circuits die ten grondslag liggen een verscheidenheid aan natuurlijke gedrag, met inbegrip van navigatie 1, besluitvorming 2,3, en het genereren van complexe motorische sequenties 4 , 5,6. Vooruitgang in precisiebewerking heeft het mogelijk gemaakt voor de fabricage van lichtgewicht apparaten die geschikt zijn voor chronische opnamen in kleine dieren, zoals muizen en zangvogels. Het vermogen om de elektrode aan te passen met kleine afstand bediende motoren verder toegenomen opbrengst de opname in verschillende contexten gedrag doordat dier handling. 6,7
Hier beschrijven we een protocol bij een ultra-light gemotoriseerd microdrive voor de lange termijn chronische opnamen in kleine dieren te bouwen. Ons ontwerp is ontstaan uit een eerder gepubliceerde versie 7, en is aangepast voor gemakkelijk gebruik en kosten-doeltrefVeness praktischer en toegankelijk voor een breed scala van onderzoekers. Deze beproefde ontwerp 8,9,10,11 maakt fijne positionering van elektrodes op afstand over een bereik van ~ 5 mm en weegt minder dan 750 mg wanneer gemonteerd. We presenteren het complete protocol voor hoe te bouwen en monteren deze stations, met inbegrip van 3D CAD tekeningen voor alle custom Microdrive componenten.
Protocol
1. Overzicht van componenten
- Een complete microdrive bestaat uit verschillende hoofdonderdelen (Figuur 1): een chassis dat dient als opbouw voor de aandrijving een motor met een fijn schroefdraad uitgaande as, een van schroefdraad shuttle dat de elektroden draagt en biedt een bijzondere elektrische aansluiting en een Omnetics (of gelijkwaardig) connector.
- Het chassis, elektrode shuttle, en elektrode shuttle buizen zijn aangepaste onderdelen die zijn ontworpen met 3D CAD-software (SolidWorks) en werden bewerkt door een lokale precisie machinist. Alle andere bestanddelen zijn commercieel verkrijgbaar.
- Chassis en shuttle zijn vervaardigd uit lichtgewicht polyetherimide (PEI), terwijl de elektrode shuttle buizen worden op maat gesneden met een draaibank van roestvrij staal hypodermische buizen (0.0293 "OD x 0,00975" ID). Hoewel deze componenten worden gesneden uit andere materialen, hebben wij gevonden dat PEI en roestvrijstalen de juiste balans van bewerkbaarheid, sterkte, en Wacht voor onze applicatie.
- Om de drive, een motor controller, die in staat van het draaien van de lage DC-spanning stappenmotor, assembleren is vereist. We maken gebruik van een aangepaste oplossing op basis van een drie-fase motor driver IC (Faulhaber BLD05002 verkrijgbaar bij de fabrikant) in combinatie met een IC timer die de tijdstap-ingang biedt. Een verscheidenheid aan kant-en-klare oplossingen zijn ook beschikbaar (bijv. Faulhaber MCBL05002 of Sutter Instrumenten MP-285).
2. Aandrijving Onderstel Voorbereiding en montage
- Met fijne zijkniptang Snijd de contactpennen aan de onderkant van de Omnetics (of equivalent) connector - 1,5 mm voor de achterste rij 1 mm voor de eerste rij (figuur 2A). Om de sterkte van de binding tussen de epoxy rijchassis en de connector te verbeteren, gebruik een scalpel om de achtervlakken van beide componenten ruwen.
- Met een scalpel gesneden vier 15 mm lange stukken polyimide buis (0,0113 "ID x 0.0133" OD) voor gebruik als draad guides. Zorgvuldig Zet het chassis in een kleine bankschroef met de open holte omlaag (Figuur 2B). Gebruik cyanoacrylaatlijm de polyimide buizen aan het chassis. Zij moet vlak liggen met de achterste chassis oppervlak en zijn evenwijdig aan elkaar zoals getoond in figuur 2B.
- Eenmaal droog, snijdt u de polyimide buizen tot ongeveer 6 mm in lengte en verwijder het afval secties. De overige pijpen moet ongeveer 3 mm van de onderrand van het chassis.
- Om voldoende ruimte voor samenpassing met de headstage of kabel te garanderen moet de connector worden gemonteerd een paar millimeter boven de polyimide buizen en evenwijdig zijn aan het chassis (figuur 2B). Gebruik epoxy (Torr Seal) om een klein voetstuk voor de connector te bouwen, plaats het op de top met de kortere rij van pennen bovenste, en nog veel meer epoxy rond de connector toe te voegen. Ga niet verder voordat de epoxy volledig is uitgehard.
- Verwijder het chassis van de ondeugd, over te dragen aaneen mal dat zorgt voor verbinding met de motor controller (dwz in ons geval jig is gewoon een stijve staaf met de bijpassende Omnetics-connector bevestigd aan een uiteinde) en oriënteren met de voorzijde van het station naar boven. Leid de motor draden door het gat in het chassis en schuif de motor in de groef in de basis. De motor en de aandrijfas moet parallel lopen met het chassis en past snuggly tegen de onderkant en de zijkant.
- Epoxy de motor op het chassis, zorg ervoor dat u zowel de aandrijfas of de ruimte waar de elektroden zal worden geïnstalleerd (zie Torr Seal plaatsing in figuur 4) belemmeren. Laat de epoxy uitharden.
- Draai het chassis zodat de connector toegankelijk is. Om de motor draden te ondersteunen en te voorkomen dat per ongeluk te breken, voeg dan een klein druppeltje snel-set epoxy om de draden waar ze uit het chassis. Trim, strip, en soldeer de draden op de juiste contacten op de connector (Figuur 2A). Test de motorzorgen voor een soepele schacht rotatie in beide richtingen.
3. Elektrode Shuttle Vergadering
- Om de kans voor beweging geïnduceerde artifacts in de opnamen is het essentieel dat de elektrode shuttle snuggly passen in het chassis. Test de pasvorm van de shuttle door te rijgen deze op de motoras en het runnen van het op en neer over de volle lengte van de as bij lage snelheid. Wees voorzichtig dat u de shuttle in het station dus wig en over-aanhalen van de motor-is het zeer gemakkelijk om de plastic overbrenging permanent beschadigen in dit stadium. Indien een eerder draaiende motoras ophoudt te draaien, kan de overbrenging worden beschadigd.
- Als de shuttle niet soepel loopt in de schacht, inspecteer het chassis oppervlakken en de drive schroef op vuil. Verwijder met een fijne tang of perslucht, de vacht van de schroefdraad in sommige lichte minerale olie en controleer de shuttle pasvorm.
- Als de shuttle is te strak, een tang en een fijne korrel slijpsteen te belemmeren materiaal weer te verwijderenm de zijkant van de shuttle. Zorg ervoor dat het materiaal gelijkmatig te verwijderen.
- Als de shuttle is te los zodanig dat het kantelt en chatters tijdens de reis, lijm een klein stukje van de transparante folie om de shuttle om de kloof tussen haar en het chassis oppervlak te vullen.
- Zodra de shuttle is goed past, verwijdert u de shuttle van de as en druk op een van de roestvrij stalen shuttle buizen in elk van de vier grote gaten in de shuttle. Elk moet midden op de shuttle met de uiteinden van de vier buizen flush (figuur 3). Vastzetten met een druppel cyanoacrylaat lijm aangebracht op de onderkant van de buis. Wees erg voorzichtig niet om de lijm te krijgen op de randen van de shuttle of in de buizen.
- Terug Rijg de voltooide elektrode shuttle op de aandrijfas en breng het helemaal naar beneden naar de basis van de schroefdraad.
4. Geleidebuis en Electrode Installatie
- Snijd vier 25 mm lange stukken polyimide Tubing (0,0045 "ID x 0,006" OD) voor gebruik als elektrode gidsen. Bovendien vier elektroden 40 mm gesneden gedeelten voor gebruik als namaakelektroden die de geleidebuizen in positie houdt tijdens de montage. (Merk op dat deze namaakelektroden zijn alleen voor montage en wordt niet gebruikt voor het opnemen, dus mogelijk dezelfde die hergebruiken voor elk samenstel.) Schuif elke sectie van de buis op zijn om een namaakelektrode dat de elektrodestroomkamers ~ 10 mm buiten uitstrekt het einde van de buis.
- Regelen elk van de polyimide buizen in het chassis zoals getoond in figuur 4A. Dit zal resulteren in de uiteinden van de elektrode reisgidsen spoelen met elkaar en uitgelijnd op de basis van de motoras, spreiden naar buiten tegen de electrode shuttle en de tegenoverliggende einden samenkomen bij de onderkant van de omvormer. Meng een kleine hoeveelheid Kwik-Cast en pas ongeveer 2 mm onder de bovenkant van de elektrode geleiders. Laat het drogen.
- Verwijder de namaakelektroden en de positie van de vrije uiteinden van de elektrode leidt dezedat ze een strakke bundel te vormen op de bodem van het station. Het kan nuttig zijn om een dunne draad te gebruiken om zijn plaats te houden tijdelijk (Figuur 4B). Bevestig de nieuwe positie met meer Kwik-Cast. Laat het drogen.
- Met een scherp scalpel, snijdt u de elektrode geleidebuizen waar ze verder reiken dan de onderzijde van de Microdrive. Na de implantatie wordt deze buizen leiden de elektroden van de onderkant van de omvormer (rustend op de schedel) aan het oppervlak van de hersenen. Dus de lengte waar de buizen moeten worden ontdaan afhankelijk van de anatomie van de implantatie (figuur 5). Voor zangvogels, dit is ongeveer 1,5 mm.
- Een elektrode aan op de connector, snijd een 30 mm lange sectie van geïsoleerde platinadraad (0,003 "dia.) En strip 1 mm isolatie van het uiteinde. Soldeer ze aan een van de signaalpennen van de connector. Buig de draad onder de connector en druk deze door een van de draadgeleider buizen. Trek de draad taunt en wikkel deze rond de geleider gleuf in thij bovenkant van het chassis.
- Met een schaar of fijn draad cutters, gesneden met een elektrode ~ 25 mm in lengte. Zorg dit te doen zonder buigen van de elektrode of beschadiging van de tip, indien dit zich voordoet, de elektrode niet worden gebruikt. Met de elektrode shuttle nu aan de bovenkant van de schacht, plaatst u de elektrode in een polyimide buis en trek deze omhoog door de RVS-buis in de shuttle. Positioneren zodanig dat de punt van de elektrode gelijk is met het ondereinde van het polyimide buis. Knip de elektrode 1 mm boven de shuttle buis.
- Met een fijne reeks forceps, isoleert uit de laatste 2 mm van de elektrode en de laatste 2 mm van de platinadraad. Plaats de elektrode in de shuttle buis, steek de platina draad in de buis, op elkaar en speld de twee door te schuiven een korte 1 mm doorsnede van wolfraam draad (0,008 "dia) in de buis. Dit moet een strakke pasvorm die zal beide een mechanische en een elektrische verbinding tussen de elektrode en de draad (figuur3).
- Voer de shuttle en de lengte van de aandrijfas om verdere beweging te waarborgen.
- Herhaal 4,5-4,8 totdat alle elektroden zijn geïnstalleerd.
- Snijd een 30 mm lange sectie van zilverdraad (0,005 "dia) voor gebruik als een aardleiding. Strip 1 mm van de isolatie van een uiteinde en soldeer op de grond pin.
5. Eindmontage en pre-implantatie Voorbereiding
- Om de wrijving van de elektroden tegen de geleidebuizen verminderen, vul de geleidingsbuizen met lichte minerale olie. Capillaire werking volstaat om de buizen vullen van een druppel olie die aan een uiteinde.
- Om een beschermkap voor de motor en de elektroden te maken, snijd een 12 mm x 25 mm rechthoek van transparantie en vouw het in een brede U-vorm. Gebruik cyanoacrylaat lijm de deksel op de buitenoppervlakken van het chassis (fig. 6). Snijd een 15 mm x 6 mm rechthoek transparantie en gebruik cyanoacrylaat lijm om het rond de connector. Om storingen te voorkomenrentie met de connector moet de lange zijde van de transparantie gelijk met de bovenrand van de connector.
- Voorafgaand aan de implantatie steriliseren elektroden en geleidebuizen door het verlagen van de verlengde elektroden in een 10:1 DI water-bleekoplossing gedurende 10 minuten. Daarna grondig spoelen met steriel water.
- Een mal gelijk aan die gebruikt in stap 2.5 kan worden gebruikt om de microdrive houden in een stereotaxisch manipulator tijdens implantatie.
6. Representatieve resultaten
Dit protocol vereist ongeveer 5 uur van hands-on assemblage tijd met een extra 6 tot 8 uur afgewisseld voor de epoxy en lijm om te drogen. Echter, zodra de microdrive is het eerst samengevoegd kunnen worden voorbereid voor hergebruik (de elektroden, elektrode geleidingsbuizen en elektrodedraden kunnen worden vervangen) in minder dan 2 uur. De kwaliteit en het karakter van de opnamen verkregen door het volgen van dit protocol zal, uiteraard mede afhankelijk van deopname target, de keuze van de elektroden, en de eventuele bewerking uitgevoerd op de headstage of verder stroomopwaarts van de Microdrive. Dit terzijde is het mogelijk om stabiele opnamen verkrijgen van een dier gedragen over een tijdspanne van meer dan tien weken. Voorbeelden van eenheid opnames van de robuuste kern van de archistriatum (RA) in een zangvogel gedragen wordt getoond in figuur 7A, multi-eenheid activiteit van dezelfde regio wordt getoond in Figuur 7B.
Figuur 1. 3D-model van de verzamelde gemotoriseerde Microdrive. De microdrive bestaat uit verschillende hoofdbestanddelen: (i) het chassis, (ii) motor met schroefdraad uitgaande as, (iii) shuttle electrode, (iv) shuttle buizen (v) elektroden, (vi) elektrode geleidingsbuizen en (vii ) connector.
Figuur 2. A)Model en aansluitschema voor de connector. Motor draden: b, i, l. Elektrodedraden: c, d, e, f. Aardingsdraad: k. Alle andere pinnen beschikbaar voor extra instrumentatie. B) Foto van de connector aan het chassis met Torr Seal epoxy. Let op de positie van de connector en aan de onderliggende draadgeleider buizen. Het cyanoacrylaat lijm waarmee de geleidebuizen in positie droogt helder en dus niet zichtbaar in het beeld.
Figuur 3. Elektrode shuttle montage.
Figuur 4. A) De elektrode geleidingsbuizen geplaatst in de behuizing voorafgaand aan het aanbrengen Kwik-Cast. B) Om de elektroden de bodem van het station te verlaten in parallel, brengen het ondereinde van de geleidingsbuizen in een strakke bundel vóór het toevoegen van de laatste druppel van de Kwik-Cast.
Figuur 5. Het bedrag dat de electrode geleidingsbuizen buiten de onderkant van de aandrijving door de anatomie van de implantatieplaats. Het diagram illustreert de afmetingen die relevant zijn voor het bepalen van de lengte van de geleidingsbuizen. Voor implanteren in de zangvogel, 1,5 mm voldoende.
Figuur 6. De afgewerkte gemotoriseerde microdrive met beschermkappen bevestigd.
Figuur 7. Vertegenwoordiger opnamen van de robuuste kern van de archistriatum (RA) in de gedragen zebravink. A) Single-eenheid activiteit opgenomen met 10MΩ platina-iridium elektroden. Top: bijvoorbeeld opname gemaakt een week na implantatie. Onder: bijvoorbeeld het opnemen van dezelfde elektrodezoals hierboven negen weken later. B) Multi-eenheid activiteit opgenomen met 1 M platina elektroden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Aanvullende Files: Het chassis, shuttle, en elektrode buizen werden ontworpen met SolidWorks 2010 CAD-software. Deze part bestanden worden verschaft in zowel de eigen (*. Sldprt) en vendor-neutraal (*. Iges) formaten en gedimensioneerd productietekeningen worden aangeboden in PDF-formaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde zal resulteren in een apparaat dat in staat van hoge kwaliteit opnames met minimale bewegingsartefacten alleen als de juiste zorg wordt genomen met de bouw. De passing van de shuttle in het chassis als van groot belang: te strak en het risico van overbelasting van de motor is hoog, te los en het risico van significante bewegingsartefact hoog. Een ideale pasvorm kan de shuttle naar de gehele lengte van de schroefas te reizen zonder kantelen uit positie of klapperen.
Selectie van registrerende elektroden is eveneens belangrijk, de materiaalkeuze, impedantie, isolatie en puntprofiel kunnen beïnvloeden weefsel reactiviteit, langdurige stabiliteit en signaal-ruisverhouding. Voor onze toepassing, hebben wij gevonden dat hoge impedantie (5-10MΩ) platina-iridium micro-elektroden stabiele enkele eenheid opnames met een hoge signaal-ruisverhouding (figuur 7) te produceren; verschillende toepassingen beter gediend doorandere elektroden. Binnen een relatief groot aantal keuzes elektrode, een eenvoudige verandering in electrode geleidebuis sizing waarschijnlijk de enige vereiste wijziging van deze microdrive passen.
Hoewel het opnemen van neurale signalen kunnen informatief zijn in zijn eigen recht, kan veel genuanceerd inzicht worden verkregen door het samenvoegen van deze met andere gedrags-of bio-signaal data. Een voordeel van het gebruik van deze ultra-lichte ontwerp is dat het opent de mogelijkheid van het toevoegen van extra head-mounted sensoren of effectoren om het dier zonder angst voor overbelasting. Bijvoorbeeld kan deze microdrive worden geïmplanteerd in combinatie met een microfoon, een audio-ontvanger, stimulatie elektroden of microdialyse probes tot een rijkere dataset van neurale activiteit in verschillende contexten. De extra contacten op de Omnetics connector (Figuur 2A) een geschikte interface voor deze extra instrumenten.
Net als alle elektrofysiologie apparaten, de qwaliteit van de opnamen gemaakt met deze microdrive beperkt door de stroomopwaartse signaalconditionering en data acquisitie apparatuur. Hoewel de specificaties voor deze apparatuur zal worden bepaald door de eisen van het experiment, is het essentieel dat een headstage voorversterker werkzaam is vlak boven de microdrive de zeer kleine stromen geïnduceerd op het punt van de elektrode spanningen gemeten door standaard verwerving instrumentatie amplificeren . Er zijn een verscheidenheid van commerciële producten die geschikt zijn voor specifieke toepassingen, hoewel leidraad voor maatwerk is in vroegere publicaties. 5,12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Ester en Joseph Klingenstein Fonds, de McKnight Endowment Fund, en NINDS 1R01NS066408-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chassis | Custom | Cut from PEI | |
| Electrode Shuttle | Custom | Cut from PEI | |
| Shuttle Tubes | Custom | Cut from Stainless Steel | |
| Connector | Omnetics | A7886-001 | Mates to A7877-001 |
| Motor w/ Gearhead | Faulhaber | 0206-A-001-B-021-47:1 | |
| Wire Guide | Small Parts, Inc. | SWPT-0113-12 | |
| Electrode Guide | Small Parts, Inc. | SWPT-0045-12 | |
| 10MΩ Pt-Ir electrodes | Microprobes, Inc | PI2PT310.0H3 | |
| Platinum Wire | A-M Systems | 772000 | For electrode wires |
| Silver Wire | A-M Systems | 786000 | For ground wire |
| Tungsten Wire | A-M Systems | 797000 | For electrode pins |
| Transparency | 3M | AF4300 | |
| Torr Seal | Varian Inc., Agilent | 9530001 | |
| Kwik-Cast | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | |
| Cyanoacrylate | Krazy Glue | KG517 | |
| Fast-Set Epoxy | Hardman | 04001 | |
| Light Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Chlorine bleach | |||
| Diagonal cutters | |||
| Scalpel blade | |||
| Forceps | |||
| Drive jig | Custom | Epoxy the mating connector to a syringe or stick | |
| Small Vice |
References
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Brain Research. 34, 171-175 (1971).
- Pennartz, C. M., Berke, J. D., Graybiel, A. M., Ito, R., Lansink, C. S., van der Meer, M., Redish, A. D., Smith, K. S., Voorn, P. Corticostriatal Interactions during Learning, Memory Processing, and Decision. 29, 12831-12838 (2009).
- Kepecs, A., Uchida, N., Zariwala, H., Mainen, Z. F. Neural correlates, computation, and behavioural impact of decision confidence. Nature. 455, 227-2231 (2008).
- Hahnloser, R. H. R., Kozhevnikov, A. A., Fee, M. S. An ultra-sparse code underlies the generation of neural sequences in a songbird. Nature. 419, 65-70 (2002).
- Leonardo, A., Fee, M. S. Ensemble Coding of Vocal Control in Birdsong. J. Neurosci. 25 (3), 652-661 (2005).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. J. Neurosci. Methods. 112, 83-94 (2001).
- Ölveczky, B. P., Otchy, T. M., Goldberg, J. H., Aronov, D., Fee, M. S. Changes in the neural control of a complex motor sequence during learning. J. Neurophys. 106, 386-397 (2011).
- Otchy, T. M., Ölveczky, B. P. Effects of Sensory Experience on the Development and Maintenance of a Motor Program Underlying a Complex Motor Sequence. Soc. for Neurosci. Abstr. , (2011).
- Goldberg, J. H., Adler, A., Bergman, H., Fee, M. S. Singing-related neural activity distinguishes two putative pallidal cell types in the songbird basal ganglia: comparison to the primate internal and external pallidal segments. J. Neurosci. 30 (20), 7088-7098 (2010).
- Goldberg, J. H., Fee, M. S. Singing-related neural activity distinguishes four classes of putative striatal neurons in the songbird basal ganglia. J. Neurophys. 103 (4), 2002-2014 (2010).
- Venkatachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted microwire implantation for chronic recording from neocortex. J. Neurosci. Methods. 90, 37-46 (1999).
- Shirvalkar, P. R., Shapiro, M. L. Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze. J. Vis. Exp. (44), e2155 (2010).
