Summary
Использование черенковского свечения Imaging (CLI) для контроля доклинических лечения рака описано здесь. Этот метод использует Черенкова (CR) и оптической томографии (OI) для визуализации меченых зондов и, следовательно, представляет собой альтернативу ПЭТ в доклинических терапевтического мониторинга и скрининга лекарственных средств.
Protocol
1. Опухоль модели
- Культуры клеток H460 (American Type Culture Collection) в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина (Технологии Invitrogen Life). Следует отметить, что выбор клеточных линий, культуры среды, места прививки, количество ксенотрансплантатов на мышь, и другие соображения все, чтобы быть адаптирована к целям конкретного исследования. Здесь мы приведем лишь один конкретный дизайн-проект в качестве иллюстрации.
- Поддержание клеточных линий в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° C и изменений в свежую среду, через день.
- При 75% сливающийся монослой клеток образуется, отсоединить монослоя с трипсином и отделить клетки в одной клеточной суспензии для дальнейшего культивирования клеток.
- Приостановить примерно 1 × 10 6 H460 клеток в фосфатно-солевом буфере (PBS; Invitrogen) и имплантатов подкожно влевого и правого плеч голым мышам (женщины бестимусным голым мышам (Nu / Nu), 4 - 6 недель, Charles River Laboratories, Inc.)
- Разрешить опухолей вырастет до 150 - 200 мм 3. Она занимает около 2 недель для H460 ксенотрансплантатов опухоли вырасти до такого размера. Стандартный суппорт измерение проводится для отслеживания размеров опухоли.
- Когда опухоль достигает идеального размера опухоли мышей, несущих готовы к лечению и в естественных изображений с помощью как ПЭТ и CLI.
2. ПЭТ
- Выполните ПЭТ-исследований в соответствии с этим графиком или любые его вариации в зависимости от конкретного проекта (рис. 1) 12. Ряд факторов может влиять на разработку графика, в том числе, но не ограничиваясь, выбор опухоли ксенотрансплантата клеточных линий, противоопухолевые препараты и режимы дозирования. Здесь мы приведем лишь один конкретный график визуализации. CLI исследования должны быть выполнены в соответствии сже графику, как и ПЭТ-исследований, с CLI выполняется сразу же после соответствующего ПЭТ. Следует также отметить, что цель исследования ПЭТ в основном для подтверждения результатов CLI. Для обычных пользователей, которые просто хотят использовать OI инструментов для работы с изображениями меченых зондов, ни ПЭТ является необходимым. Однако, если один делает проверку желание ПЭТ следует подчеркнуть, что ПЭТ и CLI инструменты должны быть расположены в непосредственной близости для проверки, чтобы быть успешным в связи с коротким периодом полураспада от 18 F (109,77 мин).
- Разделите мыши на лечение и контрольную группы (п ≥ 3 каждый). Лечение мышей в группе лечения с 2 инъекции бевацизумаба 20 мг / кг на 0 и 2. День 0 определяется по первой инъекции. Отметим, что в День -1 предварительного сканирования должна быть выполнена как через ПЭТ и CLI.
- Малые животных ПЭТ опухоли мышей должна быть выполнена с моделью R4 грызунов сканера (Siemens Medical Solutions США, Inc.)
- Anesthetize всех мышей с 2% изофлурана (Aerrane; Baxter) и ввести с 3'-дезокси-3'-18 F-fluorothymidine (18 F-FLT; 7,3 - 8,0 МБк [198 - 215 мкКи]) через хвостовую вену. ПЭТ-зонд должен быть разводят в PBS перед инъекцией.
- Через 1 час, анестезию мышей снова и поместить под наркозом мышей, подверженных и недалеко от центра поля зрения малых животных ПЭТ-сканера.
- Получите три минуты статического сканирования и реконструкции изображений по 2-мерной упорядоченного множества алгоритмов максимального ожидания. Фон коррекция не нужна.
- Ничья регионах, представляющих интерес (трансформирования, 5 пикселей для корональной и трансаксиальной ломтиками) за опухоли на распад-исправлен всего тела корональных изображениях. Получить максимальную рассчитывает на пиксель в минуту от РИ и конвертировать в счета на миллилитр в минуту с использованием калибровочной константы. С предположением о ткани плотностью 1 г / мл, конвертировать трансформирования для подсчетаза грамм в минуту. Определить изображения ROI полученные% ID / г значения путем деления рассчитывает на грамм в минуту введенной дозы. Ослабление коррекция не нужна.
3. CLI
- CLI должна быть выполнена с системой ИВИС Spectrum (суппорт Life Sciences). Приобретение и анализа изображений будут осуществляться с использованием живой образ 3,0 программного обеспечения (суппорт Life Sciences). Волновым спектральных изображений, чтобы быть выполнены с использованием 18-набор узкополосных фильтров излучения (490 - 850 нм). Опять же, для каждой мыши, выполнить CLI сразу после ПЭТ свести к минимуму количество радиоактивного распада, если ПЭТ-исследованиях, включенных в протокол.
- Поместите животных в светонепроницаемой камере под изофлуран анестезии. Несколько мышей могут быть размещены одновременно увеличить пропускную способность.
- Получение изображений с помощью 3 мин время экспозиции (F / Stop = 1, биннинга = 4). Используйте те же настройки освещения (лампа напряжения, фильтры, F / Stop, полей зрения, Binnния) о приобретении всех изображений. Используйте спинной участок кожи для расчета интенсивности сигнала фоне ткани. Нормализация флуоресценции для фотонов в секунду на квадратный сантиметр на стерадиан (P / S / см 2 / ср).
4. Представитель Результаты
Визуальное сравнение между CLI и ПЭТ-изображения могут быть легко выполнены. После объединения шкалы через образы из той же модальности и место CLI и ПЭТ-изображения рядом можно увидеть в этой репрезентативной выборки (рис. 2A), что обе консоли и ПЭТ показали значительно снизилась сигналы от H460 ксенотрансплантатов в мышей с предварительной обработкой на 3-й день, что свидетельствует значительный терапевтический эффект. Для сравнения, умеренно увеличена до неизменным сигналы наблюдались в необработанных мышей в течение того же периода времени (данные не показаны). По визуального осмотра только можно заметить, что есть хорошая консистенция между опухолью контрасты, которые являются визуальнымизуется из CLI и ПЭТ. На самом деле, это визуальное корреляция имеет достаточное разрешение, чтобы показать центрального некроза опухоли вторичной по отношению к противоопухолевым схемы лечения (просьба сравнить CLI и ПЭТ-изображения с Днем 3). Для проверки визуализации результатов количественных и корреляционный анализ может быть осуществлен.
Количественными из CLI и ПЭТ изображений и простой монтаж с помощью линейной регрессии показали, что два условия действительно были отличные корреляции (рис. 2В, R 2 = 0,9309 для 18 F-FLT исследовали группу лечения). Примечательно, что во всех наших CLI и ПЭТ-исследований изображений с различных моделях опухолей и различных противоопухолевых препаратов склонах приступы являются также чрезвычайно близки, что свидетельствует отлично подходит линейной регрессии даже все данные скопившийся (данные не показаны). Оба представителя изображения взяты из наших предыдущих 12 публикаций.
er.within-страница = "Всегда"> 
Рисунок 1. Схема эксперимента ПЭТ и CLI исследований. Опухоли были имплантированы на двусторонней основе в плечевой области и позволили вырасти до 150-200 мм 3, и опухоли мышей подвергали в естественных изображений с помощью ПЭТ и CLI при -1 день, 1 и 3. Бевацизумаб лечение проводилось на 2 инъекций 20 мг / кг на 0 и 2.
Рисунок 2. (A) В естественных условиях CLI и ПЭТ-изображения мышей, несущих H460 ксенотрансплантатов обрабатывают Бевацизумаб до лечения (предварительное сканирование) и после лечения (день 3). (B)-корреспондент количественного анализа CLI и ПЭТ результаты (п = 3) и их корреляции. Изображения адаптировано из (6).arge.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLI становится перспективным метода молекулярной визуализации, которая нашла потенциалов во многих основных научно-исследовательских приложений и даже клинического использования 4,5,15,16,17. Основные преимущества CLI по сравнению с традиционными ядерными методы визуализации, такие как ПЭТ стволовые от его использования ОИ инструменты, которые легче в использовании, характеризуются коротким временем приобретения и высокой пропускной способностью, значительно дешевле и более доступны для исследователей. Кроме того, то, что отличает CLI, кроме О. в целом является использование β-излучающих меченых молекул в качестве датчиков изображения, многие из которых были утверждены по контролю за продуктами и лекарствами (FDA), в отличие от традиционных О.И. агентов. С помощью этих уникальных и привлекательных качеств, CLI быстро привлекла к себе внимание из области молекулярной визуализации. Тем не менее, его потенциал в доклинических и клинических приложений еще до конца не исследованы.
Мониторинг рака терапия является одной из областей,где CLI может иметь значительные полезности. Это очень важная область, которая имеет ключевое значение для зонда развития, скрининга лекарственных средств, и даже пошив терапии рака для пациентов. В настоящее время доклинических терапии рака мониторинг осуществляется почти исключительно через ядерные методы визуализации, такие как ПЭТ. Поэтому CLI обеспечивает очень привлекательной альтернативой ПЭТ, особенно с учетом того, что есть отличная корреляция между CLI и ПЭТ-изображениях. Тем не менее, еще одним преимуществом консоли для мониторинга терапии заключается в том, что CLI может изображения не только β +-излучатели, но и β - излучатели, такие как 32 P, 90 Y и 131 I, все из которых являются клинически значимыми.
Тем не менее, CLI не без недостатков. Опора на ОИ инструментов подсказывает, что CLI страдает от некоторых недостатков, присущих оптических изображений, таких как затухание сигнала и рассеяния в живых тканях. Кроме того, особенности спектраCR также приводит к ограниченной интенсивности сигнала и в дальнейшем, тем глубже сигнала от поверхности тела, тем ниже чувствительность, и чем беднее возможность количественного 6. Однако, несмотря на недостатки, можно рассматривать как значительный, можно в значительной степени обойти эти препятствия в доклинических исследованиях, используя мелкие животные, такие как мыши. Более того, существует по крайней мере несколько клинических областях, которые потенциально могут извлечь выгоду из CLI мониторинга терапии рака. Мониторинг поверхностные лицам заболеваний, таких как воспалительные заболевания дерматологических и рака может служить одним хорошим примером. Кроме того, заболевание лиц, которые глубокую еще доступный прибор с зарядовой связью или волоконно-оптических методов, основанных можете использовать превосходную чувствительность и количественного возможности CLI, а также. Еще одна захватывающая возможность заключается в использовании CLI, чтобы помочь хирургам получить анатомическую и функциональную информацию об опухоли в операционной. Два последних доказательство правильности концепции студентовштампов продемонстрировали обнаружение и резекции опухолей у мышей с интраоперационной изображение руководством, благодаря CLI 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы признаем поддержке Национального института рака (NCI) R01 CA128908 и Стэнфордский медицинский научный сотрудник стипендий. Никакой другой потенциальный конфликт интересов, имеющих отношение к этой статье сообщается.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H460 Cell Line | American Type Culture Collection | ATCC Number: HTB-177 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen Life Technologies | 12633-012 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10091-148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15640-055 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Life Technologies | 10010-023 | |
| Female Athymic Nude Mice | Charles River Laboratories, Inc. | Strain Code: 088 | |
| Bevacizumab (Avastin) | Genentech/Roche | N/A | |
| MicroPET Rodent R4 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | N/A | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter | Baxter Number: AHN3637 | |
| IVIS Spectrum | Caliper Life Sciences | N/A |
References
- Weissleder, R., Mahmood, U.
- Chen, K., Chen, X. Positron emission tomography imaging of cancer biology: current status and future prospects. Semin. Oncol. 38 (1), 70 (2011).
- Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M. Y., et al. Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Med. Princ. Pract. 20 (5), 397 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Miao, Z., et al. Molecular Optical Imaging with Radioactive Probes. PLoS One. 5 (3), e9470 (2010).
- Robertson, R., Germanos, M. S., Li, C., et al. Optical imaging of Cerenkov light generation from positron-emitting radiotracers. Phys. Med. Biol. 54 (16), N355 (2009).
- Xu, Y., Liu, H., Cheng, Z. Harnessing the power of radionuclides for optical imaging: Cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 52 (12), 2009 (2011).
- Cerenkov, P. Visible emission of clean liquids by action of g-radiation. Dokl Akad Nauk SSSR. 2, 451 (1934).
- Cerenkov, P. A. Visible radiation produced by electrons moving in a medium with velocities exceeding that of light. Phys Rev. 52 (4), 0378 (1937).
- Boschi, F., Calderan, L., D'Ambrosio, D., et al. In vivo 18F-FDG tumour uptake measurements in small animals using Cerenkov radiation. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 38 (1), 120 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Liu, S., et al. Optical imaging of reporter gene expression using a positron-emission-tomography probe. J. Biomed. Opt. 15 (6), 060505 (2010).
- Park, J. C., Yu, M. K., An, G. I., et al. Facile preparation of a hybrid nanoprobe for triple-modality optical/PET/MR imaging. Small. 6 (24), 2863 (2010).
- Xu, Y., Chang, E., Liu, H., et al. Proof-of-concept study of monitoring cancer drug therapy with cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 53 (2), 312 (2012).
- Ellis, L. M.
- Hochster, H. S. Bevacizumab in combination with chemotherapy: first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer. Semin. Oncol. 33, Suppl 5 . 10. (2006).
- Dothager, R. S., Goiffon, R. J., Jackson, E., et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: a novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems. PLoS One. 5 (10), e13300 (2010).
- Hu, Z., Liang, J., Yang, W., et al. Experimental Cerenkov luminescence tomography of the mouse model with SPECT imaging validation. Opt. Express. 18 (24), 24441 (2010).
- Park, J. C., Il An, G., Park, S. I., et al. Luminescence imaging using radionuclides: a potential application in molecular imaging. Nucl. Med. Biol. 38 (3), 321 (2011).
- Holland, J. P., Normand, G., Ruggiero, A., et al. Intraoperative imaging of positron emission tomographic radiotracers using Cerenkov luminescence emissions. Mol. Imaging. 10 (3), 177 (2011).
- Intraoperative imaging of tumors using Cerenkov luminescence endoscopy: a feasibility experimental study. J. Nucl. Med. Liu, H., Carpenter, C. M., Jiang, H., et al. , (2012).
