Summary
De werkwijze omvat de hier gepresenteerde precieze schade van levende zebravis embryo's met hoge energie laserpulsen en de analyse van deze letsels en hun herstel met de tijd. We laten ook zien hoe genetisch enkel label of groepen van skeletspiercellen kunnen worden gevolgd tijdens en na de laser-licht veroorzaakte schade.
Abstract
Verschillende experimentele benaderingen zijn gebruikt in de muis om spierblessure veroorzaken, met als doel om spieren regeneratie te bestuderen, met inbegrip van myotoxin injecties (bupivacaïne, cardiotoxine of notexin), spier transplantaties (denervatie-devascularization geïnduceerde regeneratie), intensieve lichaamsbeweging, maar ook muizen spierdystrofie modellen zoals de mdx muis (voor een overzicht van deze benaderingen zie 1). In zebravis, genetische benaderingen zijn mutanten die spierdystrofie fenotypen (zoals runzel 2 of sapje 3) vertonen en antisense oligonucleotide morfolino dat de expressie van dystrofie-geassocieerde genen 4 blokkeren. Bovendien chemische benaderingen mogelijk, bijv. met Galanthamine, een chemische verbinding remmen acetylcholinesterase, hetgeen resulteert in hypercontraction, wat uiteindelijk leidt tot spierdystrofie 5. Echter, genetische en farmacologische benaderingen generally van invloed op alle spieren binnen een individu, terwijl de omvang van fysiek toegebracht letsel gemakkelijker in ruimte en tijd 1 gecontroleerd. Gelokaliseerde lichamelijk letsel kan de beoordeling van de contralaterale spier als een interne controle. Inderdaad hebben we onlangs gebruikte laser gemedieerde ablatie naar skeletspier regeneratie te bestuderen in de zebravis embryo 6, terwijl een andere groep onlangs gemeld het gebruik van een twee-foton laser (822 nm) zeer lokaal beschadigd plasmamembraan van embryoethische zebravis spier cellen 7.
Hier rapporteren we een methode voor het gebruik van de Micropoint laser (Andor Technology) zorgt voor skeletspieren celschade in de zebravis embryo. De Micropoint laser is een hoge energie laser die geschikt is voor doelwitcel ablatie bij een golflengte van 435 nm. De laser is verbonden met een microscoop (in onze setup, een optische microscoop van Zeiss) zodanig dat de microscoop worden tegelijkertijd fof scherpstellen het laserlicht op het monster en visualiseren van de effecten van de verwonding (helderveld of fluorescentie). De parameters voor het regelen van laserpulsen omvatten golflengte, intensiteit en aantal pulsen.
Door de transparantie en externe embryonale ontwikkeling, het zebravis embryo zeer vatbaar voor zowel laser geïnduceerde schade en voor het bestuderen van het daaropvolgende herstel. Tussen 1 en 2 dagen na de bevruchting, somitic skeletspiercellen geleidelijk ondergaan rijping van anterior naar vanwege de progressie van somitogenesis posterior van de stam naar staart 8, 9. Op deze stadia, embryo spontaan trillen en initiëren zwemmen. De zebravis is onlangs erkend als een belangrijk vertebrate modelorganisme voor de studie van weefselregeneratie, met vele soorten weefsels (hart, neuronale, vasculaire etc.) kunnen worden geregenereerd na letsel in de volwassen zebravis 10, 11.
Protocol
1. Labeling Losse Cellen
Injecteer eencellige embryo's met een plasmide dat codeert voor GFP of GFP-fusie-eiwit onder controle van een β-actine promoter. Tijdens de ontwikkeling wordt GFP vervolgens uitgedrukt in een mozaïek mode. Hier gebruikten wij het transgene construct Tg [β-actine: α-actinine-GFP], welke plaatsen de α-actinine-GFP fusie-eiwit onder controle van de β-actine promoter.
2. Embryo Embedding
- Verzamelen zebravis embryo en handhaven onder normale omstandigheden tot 28 hpf (staging volgens 12).
- Dechorionate embryo's onder de stereomicroscoop met een pincet (Dumont # 5).
- Bereid een microscoopglaasje met een vaseline ring.
- Bereid een 1% laag smeltpunt agarose / 10% tricaine oplossing E3 medium: kook 100 mg agarose in 10 ml E3 oplossing van een homogene vloeistof en agarose oplossing te verkrijgen, en aliquot storeongebruikte agarose oplossing bij -20 ° C voor verder gebruik. Voor direct gebruik, laat de gekookte oplossing afkoelen en te handhaven op max. 39 ° C. Voeg tricaine stock oplossing tot een eindconcentratie van 10% tricaine verkrijgen. Zowel tricaine en agarose nodig om embryonale bewegingen te voorkomen.
- Embed een embryo in 1% laag smeltpunt agarose / 10% tricaine / E3 medium in de vaseline ring, met het embryo tot natuurlijk aan de zijkant; voorzichtig af met een dekglaasje alleen om de embryo te handhaven, en om in een convex voorkomen oppervlak dat het licht zou breken. Idealiter zou de embryonale spierweefsel die gericht raken dekglaasje.
3. Embryo Laser-verwonding
- Bereid de Micropoint laser en de microscoop:
- Raadpleeg de Micropoint laser handleiding voor gedetailleerde instructies over het instellen en gebruiken van de laser in combinatie met de microscoop.
- Selecteer de juistekleurstof voor het genereren van een 435 nm golflengte laserbundel.
- Stel de laser apparaat uit met de demping schuifregelaar. Het laservermogen moet sterk genoeg zijn om een glazen oppervlak breken met een enkele puls (bijvoorbeeld gericht op het dekglaasje van het monster om dit te testen). Dit is het laservermogen nodig cel ablatie.
- Concentreren van het gebied of cel van interesse met de reticule geïnstalleerd in het oculair van de microscoop. Gebruik een 20x objectief (40x zullen precieze schade toe, maar vaak de werkafstand is niet voldoende voor deze lens).
Opmerking 1: de laser niet alleen verwonden cellen in de focus vlak, maar ook cellen boven en onder die binnen de laserstraal. Zorg ervoor dat voor het experiment dat de laser optimaal is ingesteld en aangepast voor een maximale focus binnen de z-as. Het beste is om de diepte van de laser schade vast voordat het experiment om te weten welke cels precies zal gewond raken.
- Stel het licht die nodig is voor het visualiseren van het experiment: helderveld voor normaal gebruik, of fluorescentie als gericht op een fluorescent gelabelde cel.
- Stuur een puls van laserlicht naar het doelgebied of meerdere pulsen, afhankelijk van de gewenste mate van schade.
4. Analyse van de verwonding en Recovery
- Desgewenst kan de procedure van laser schade worden geregistreerd live (bijvoorbeeld met de stroom verwerving keuze van de Metamorph software). 6
- Onmiddellijk na verwonding, moet het embryo voorzichtig uit de agarose met een tang en teruggeplaatst in egg water voor herstel.
Noot 2: Gespierd activiteit (zwemmen en spiertrekkingen) is vooral belangrijk voor het skelet herstel van de spieren. Aangezien het embryo niet bewegen vanwege tricaine blootstelling en de stijve agarose inbedding is niet recommended de embryo tussen dia en het dekglaasje te lang behouden.
- Na herstel kan het embryo worden vastgesteld en geanalyseerd zoals gewenst door licht-, fluorescentie-of confocale microscopie zoals aangegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laser-gemedieerde schade werd uitgevoerd op geïmmobiliseerde 1 dag-oude embryo's. Zoals getoond in figuur 1 kan een enkele laser pulsen genereren een kleine wond, herkenbaar aan de beschadigde, opgerold Actin-rijke myofibrillen die normaal gespannen tussen de somiet grenzen. Een groter aantal laserpulsen zal echter leiden tot een massief blok beschadigd somiet, waar de meeste myofibrillen worden vernietigd. Toch kunnen we letterlijk zien dat "tijd alle wonden heelt", met kleine blessures helen sneller dan grotere. Na herstel, Actin kleuringen laten zien dat myofibrillen opnieuw de somiet normaal overspannen, maar extra informatie kan worden verkregen door kleuring voor Xirp1. De Xirp1 eiwit is een goede marker voor het detecteren waar schade en herstel opgetreden, omdat het ectopisch gelokaliseerd langs terugwinnen myofibrillen binnen voorheen gewonden spiercellen 6.
Voor sommige doeleinden is het van belang te bepalen welke cellen exactly gewond met de laser, daarom kan nuttig zijn genetisch label sommige cellen (bijvoorbeeld door expressie mosaically een GFP-gelabeld eiwit) om nauwkeurig te kunnen welke cel is gericht en visualiseren beoordelen of de naburige cellen werd ook beïnvloed door de laserpuls (figuur 2). Na schade herstel en antilichaamkleuring, wordt mogelijk om opnieuw analyseren doelwitcel dankzij het patroon van mosaically gelabelde cellen eromheen.
Een interessante benadering is om regelmatig te controleren na verloop van tijd hoe de laser-gemedieerde beschadiging van de somitic spier beïnvloedt. Hiervoor kan de laser letsel van het geïmmobiliseerde embryo worden live opgenomen om de onmiddellijke gevolgen, bijvoorbeeld binnen de eerste minuut (figuur 3) te zien. Bovendien kan timelapse opnamen worden uitgevoerd met elke gewenste tijdsinterval (bijvoorbeeld 5 min interval), om nauwkeurig te volgen hoe cellen herschikkenrond de wond.
Figuur 1. De ernst van het letsel toegebracht kan sterk variëren, afhankelijk van het aantal toegepaste laserpulsen. Derhalve herstel van schade zal verlopen bij verschil passen, maar uiteindelijk meeste wonden gesloten zijn. We hebben onlangs aangetoond dat Xirp1 (groen) is een goede marker voor spieropbouw, omdat het wordt opgereguleerd op schade en lokaliseert niet-Actin sarcomeer (rood) van beschadigde myofibrillen op 32 hpf 6.
Figuur 2. Gelabelde cellen specifiek gericht (gewijzigd vanaf Ref 6). CeLLS werden bestempeld door mozaïek expressie van Tg [β-actine: α-actinine-GFP] (groen of zwart-wit). Een dergelijke cel is hier gericht op 32 hpf en ernstig beschadigd door verscheidene laserpulsen, zoals aangegeven door de rode bout. De witte pijl geeft de benadeelde cel; gele pijlen wijzen op andere GFP-gelabelde cellen. De foto rechts werd genomen na herstel en antilichaam kleuring van dezelfde wond.
Figuur 3. Live stream overname van laser letsel laat zien hoe de schade het hele somiet blok raakt. Montage van enkele foto's die op de Axioplan in de live stream-modus (dat wil zeggen ongeveer 16 beelden / sec) met DIC. De zwarte pijl geeft aan waar de laser raakt de somitic spier op 28 hpf. Rode pijlen geven de terugtrekkende uiteinden van een beschadigdemyofibril. Deze dynamische veranderingen binnen een somiet blok plaatsgevonden binnen 2,5 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laser-gemedieerde schade is een krachtige methode voor het toebrengen van wonden van een gewenste grootte door ablatie cellen om regeneratie te bestuderen onder gecontroleerde omstandigheden in de zebravis embryo. Met name kunnen cellen nauwkeurig worden gericht (figuur 2) en de schade-gebied en timing worden geregeld. Vervolgens worden de verwonding en regeneratieprocessen gemakkelijk gevolgd, opgenomen (figuur 3) en geanalyseerd (Figuur 1). Hoewel de laser goed gericht in de x-en y-as wordt niet volledig geconcentreerd in de z-as. Dit kan schade aan cellen zich onder of boven de cellen van belang. Toch is deze benadering opent een brede terrein van in-vivo-onderzoek van spierherstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Bob Nowak (Andor Technology) voor technische hulp en advies. SA-S. wordt ondersteund door een Heisenberg fellowship van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door DFG subsidie SE2016/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
|||
References
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
